Name: Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a medir el recambio de lípidos de membrana en neuronas vivas utilizando la sonda fluorescente ND6 sensible al pH. Este método permite visualizar directamente los procesos de exocitosis y endocitosis con alta precisión.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Oficina de Investigación e Indagación de Pregrado de la Universidad Atlántica de Florida (M.J.S.), la subvención piloto 20A17 (Q.Z.) del Departamento de Salud de Florida Ed y Ethel Moore (Q.Z.), la subvención de la Asociación de Alzheimer AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) y la subvención NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).

El siguiente protocolo incluye (1) un procedimiento simplificado para establecer cultivos corticales y de hipocampo de ratón basado en un protocolo bien establecido22, (2) una breve introducción a una configuración de microscopio de epifluorescencia para neuronas vivas, (3) una descripción detallada de la carga y la obtención de imágenes de ND6 en neuronas de ratón, (4) una discusión sobre la cuantificación del tráfico de membrana por la señal ND6. Todos los procedimientos siguen las pautas de bioseguridad e IACUC en la Universidad Atlántica de Florida. La síntesis de ND6 ha sido descrita previamente20.
1. Preparación de cultivos corticales e hipocampales de ratón
NOTA: Si no se especifica lo contrario, todos los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar de nivel 2 de bioseguridad. Esterilice todas las herramientas y materiales.
<ol><li>Use pinzas de tamaño 5 para colocar cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de pocillos múltiples. NOTA: Por ejemplo, una placa de 24 pocillos es ideal para cubreobjetos de 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>Añadir el volumen adecuado de matrices extracelulares para recubrir la superficie del cultivo celular (p. ej., 75 μL de solución de matriz de membrana basal por cubreobjetos de 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> ; véase la Tabla de Materiales)</li>
	<li>Coloque las placas preparadas en la incubadora de cultivo de tejidos (5% CO2, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para permitir la reticulación de la matriz de la membrana basal.</li>
	<li>Sacrificar a los animales, abrir el cráneo y transferir todo el cerebro a una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 20% de suero fetal bovino (H+20). Corte el cerebro a lo largo de la línea media y separe las cortezas y el hipocampo en una campana de disección de flujo laminar para reducir la contaminación.</li>
	<li>Use microtijeras para cortar los pañuelos en trozos pequeños (~ 1 mm3). Transfiera esos tejidos a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de H+20.</li>
	<li>Lavar los tejidos tres veces con 5 mL de H+20 y tres veces con 5 mL de HBSS.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de tripsina al 1% con ácido etilendiaminotetraacético e incubar a 37 °C durante 10 min para la digestión enzimática.</li>
	<li>Repita el paso 1.6 y utilice el vacío para aspirar HBSS al final.</li>
	<li>Disociar los tejidos mecánicamente en 1 mL de HBSS que contenga 2,95 g/L de MgSO4•7H2O utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen adecuado de medios de cultivo para obtener una concentración de ~10.000.000 de células/ml.</li>
	<li>Coloque las células en placas a ~1.000.000 de células/cm2 y coloque el cultivo en la incubadora (5% de CO2, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para facilitar la fijación de las células a los cubreobjetos de vidrio.</li>
	<li>Agregue un volumen apropiado de medio de cultivo (p. ej., 1 ml por pocillo para una placa de 24 pocillos). Añadir el mismo volumen de medio de cultivo después de 1 semana. Después de 2 semanas, reemplace la mitad del medio de cultivo existente con medios nuevos cada semana.</li>
</ol>2. Configuración del microscopio para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas
NOTA: Una configuración de imagen ejemplar (Figura 5) incluye al menos un microscopio de fluorescencia invertida (consulte la Tabla de Materiales), una fuente de luz de fluorescencia con obturador automático, juegos de filtros de fluorescencia (por ejemplo, para obtener imágenes de ND6, use 405/10 BP para la excitación, 495 LP para dicroica y 510/20 BP para la emisión) y una cámara de alta sensibilidad (Tabla de Materiales), todos los cuales están controlados por un software de adquisición de imágenes (Tabla de Materiales).
<ol><li>Prepare una cámara de imágenes que permita el control de la temperatura y la entrada/salida de la solución para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas. NOTA: Por ejemplo, en este protocolo se utilizó una cámara de imágenes de baño abierto modificada fijada en una plataforma de calentamiento (Figura 6).</li>
	<li>Configure un dispositivo programable para cambiar las soluciones de perfusión y administrar el estímulo eléctrico en puntos de tiempo definidos durante la obtención de imágenes. NOTA: La sincronización de hardware y software es necesaria para los análisis cuantitativos (Figura 7). Por ejemplo, en este protocolo, se utilizó una salida de disparo de la cámara de imágenes para iniciar un programa informático que controla un dispositivo de conmutación automática, que controla un sistema de perfusión multicanal y un estimulador de pulso cuadrado.</li>
	<li>Para obtener imágenes conjuntas de dos o más reporteros fluorescentes, realice imágenes de fluorescencia multicanal, ya sea cambiando secuencialmente los conjuntos de filtros o dividiendo simultáneamente diferentes emisiones de fluorescencia y proyectándolas en la misma cámara.</li>
</ol>3. Carga e imagen de ND6 en cultivos neuronales
<ol><li>Pesar una cantidad adecuada de ND6, disolverlo en dimetilsulfóxido (DMSO) y dejar que se solubilice a temperatura ambiente; Sonicate brevemente (p. ej., 3 min). Filtre la solución madre cruda con un filtro de 0,22 μm para eliminar los agregados de colorante grandes. Después de la filtración, determine la concentración de colorante mediante espectroscopia de absorción a 405 nm utilizando un espectrofotómetro convencional o de microvolumen utilizando ε = 10.700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Antes de la aplicación, diluir la solución madre a una concentración de 1 μM utilizando la solución de baño. Mantenga la solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Marcaje de endosomas y vesículas sinápticas<ol><li>Para etiquetar de forma ubicua compartimentos de membrana endocitados, como endosomas, añadir solución madre de ND6 (p. ej., 1 mM en DMSO) al medio de cultivo a la concentración final de 1 μM e incubar al 5 % de CO2, 100 % de humedad y 37 °C durante 30 min. Para reducir el alcance del marcaje SV, suprimir farmacológicamente la actividad neuronal espontánea. Por ejemplo, utilizar la tetrodotoxina para bloquear los potenciales de acción o el ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) y el ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanoico (D-AP5) para inhibir la transmisión excitatoria23.</li>
		<li>Para etiquetar selectivamente los SV, utilice una estimulación breve pero fuerte para evocar la exo/endocitosis presináptica. En primer lugar, transfiera la(s) cubreobjeto(s) de cultivo a una placa de Petri de 35 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> que contenga 2 ml de solución normal de Tyrode a temperatura ambiente. En segundo lugar, diluir la solución madre de ND6 en una solución de Tyrode con alto contenido de K+ (90 mM de KCl) a la concentración final de 1 μM. En tercer lugar, reemplace la solución normal de Tyrode en la placa de Petri con una solución de Tyrode con alto contenido de K+ que contenga ND6 e incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera el cultivo celular marcado con ND6 a la cámara de imágenes llena de solución de Tyrode normal precalentada que contiene 10 μM de NBQX y 10 μM de D-AP5.</li>
	<li>Ajuste la velocidad de perfusión a ~0,2 mL/s (es decir, 1 gota por segundo) e inicie la perfusión de la solución normal precalentada de Tyrode que contiene NBQX y D-AP5 para eliminar el exceso de ND6 en el cultivo.</li>
	<li>Ajuste el enfoque y localice el campo de visión apropiado que contenga neuronas sanas y bien distribuidas que lleven neuritas conectadas. Evite las áreas que contengan coloides de colorante no resueltos.</li>
	<li>Pruebe la obtención de imágenes de células cargadas de ND6 con diferentes tiempos de exposición para identificar los mejores ajustes de imagen. NOTA: Para obtener el mejor tiempo de exposición, la intensidad de fluorescencia de píxeles más alta en la imagen resultante es aproximadamente la mitad del rango de bits (por ejemplo, para una imagen de 16 bits, el rango de bits es de 0 a 65,535), lo que permitirá un aumento adicional de la fluorescencia cuando se aplique la solución de baño ácido. El tiempo de exposición seleccionado debe utilizarse para todas las imágenes ND6.</li>
	<li>Establezca el protocolo de estimulación y perfusión, el intervalo de fotogramas y la duración total. Por ejemplo, en el siguiente protocolo, utilice una línea de base de 30 s, una estimulación de campo eléctrico de 10 s a 30 Hz, una recuperación de 50 s, 120 s 90 mM K+, una recuperación de 60 s, una solución de Tyrode de 60 s con 50 mM deNH 4Cl, una solución de Tyrode de 60 s a pH 5,5 y un intervalo de fotogramas de 3 s.</li>
	<li>Iniciar la adquisición de imágenes acompañada de la estimulación y perfusión sincronizadas. Supervise la simulación y el intercambio de soluciones durante la obtención de imágenes.</li>
	<li>Detenga la perfusión después de que finalicen las imágenes, retire el cubreobjetos y limpie la cámara de imágenes para el siguiente ensayo.</li>
</ol>4. Cuantificación del tráfico de membranas mediante un cambio en la fluorescencia de ND6
<ol><li>Realice una copia de seguridad y/o haga una copia electrónica de todos los archivos de imagen.</li>
	<li>Elija un programa de análisis para la extracción de datos, por ejemplo, un software de análisis de imágenes de código abierto como ImageJ24 y/o FIJI25.</li>
	<li>Abra o importe una pila de imágenes en el programa de análisis.</li>
	<li>Establezca la primera imagen como referencia y alinee el resto con ella utilizando funciones/complementos como Rigid Registration26, que mitigará los artefactos debidos a la deriva xy. Consulte la Figura 8 para ver imágenes de ejemplo.</li>
	<li>Promedie todas las imágenes adquiridas durante los 30 s previos a la línea de base para producir una imagen de referencia. Guarde una copia de esta imagen para futuras consultas.</li>
	<li>Establezca el umbral de intensidad para generar una imagen binaria a partir de la imagen promediada de línea base.</li>
	<li>Utilice Watershed en ImageJ o funciones similares en otro programa para separar las neuritas o células conectadas.</li>
	<li>Utilice la función Analizar partícula con el tamaño de área y la circularidad adecuados para solicitar regiones de interés (ROI) correspondientes a membranas celulares, endosomas, lisosomas o botones sinápticos. Guarde todos los ROI seleccionados.</li>
	<li>Seleccione cuatro ROI de fondo en regiones sin celdas dentro del campo de visión.</li>
	<li>Mida las intensidades medias de píxeles de cada ROI en cada fotograma de la pila de imágenes y exporte los resultados para su análisis estadístico.</li>
	<li>Calcule la intensidad media de las ROI de fondo como el ruido de referencia, que se restará de las intensidades de píxel promedio para cada ROI.</li>
	<li>Promedie las tres intensidades medias más altas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de la solución de Tyrode pH 5.5 para obtener la intensidad de fluorescencia máxima, que se define como 100% para la normalización.</li>
	<li>Promedie las tres intensidades medias más bajas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de 50 mM NH4Cl para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, que se define como 0% para la normalización.</li>
	<li>Calcule los cambios de fluorescencia relativos para cada ROI en función de sus propias intensidades de 0% y 100%. Derive los cambios medios de fluorescencia, la cinética de los cambios y otros valores/gráficos a partir de los datos individuales de ROI.</li>
</ol>

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<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Los colorantes a base de lípidos, como el 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) y el perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), se han utilizado durante mucho tiempo para ilustrar la morfología celular y rastrear procesos celulares como las proyecciones axónicas de las neuronas. Los colorantes de estirilo, como el FM1-43, se han inventado y utilizado con éxito para el estudio de la exocitosis34. Debido a su baja afinidad con la membrana, etiquetan selectivamente las...

La bicapa lipídica es uno de los ensamblajes de biomoléculas más comunes y es indispensable para todas las células. Fuera de las células, forma la membrana plasmática que interconecta las células y su entorno; Dentro de las células, compartimenta varios orgánulos especializados para funcionalidades designadas. Más dinámicas que quietas, las membranas lipídicas experimentan constantemente fusión y fisión, lo que media el transporte de biomateriales, la reforma de orgánulos, el cambio morfológico y la comunicación celular. Sin duda, la membrana lipídica es la base física de casi todos los procesos celulares, y su disfunción juega un papel crucial en diversos trastornos que van desde el cáncer1 hasta la enfermedad de Alzheimer2. Aunque las moléculas lipídicas son mucho menos diversas que las proteínas, la investigación de membranas hasta ahora se ha centrado principalmente en las proteínas. Por ejemplo, se sabe mucho más sobre la maquinaria proteica que sobre los lípidos en la exocitosis 3,4,5. Además, la organización, distribución, dinámica y homeostasis de los lípidos a través de las membranas superficiales e intracelulares permanecen en gran medida inexploradas en comparación con las proteínas de membrana6.
Esto no es sorprendente, ya que las técnicas modernas de biología molecular, como la mutagénesis, proporcionan una ventaja metodológica para estudiar proteínas en lugar de lípidos. Por ejemplo, el marcaje transgénico de la proteína verde fluorescente sensible al pH (también conocida como pHluorina) a las proteínas vesiculares facilita la medición cuantitativa de la cantidad y la tasa de recambio de proteínas vesiculares durante la exocitosis/endocitosis 7,8,9. Sin embargo, es casi imposible modificar genéticamente los lípidos de membrana in vivo. Además, las manipulaciones cualitativas e incluso cuantitativas de las cantidades y distribuciones de proteínas son mucho más factibles que las de los lípidos10. Sin embargo, se han aislado y desarrollado lípidos fluorescentes nativos y sintéticos para simular lípidos de membrana endógena in vitro e in vivo11. Un grupo de lípidos fluorescentes ampliamente utilizados son los colorantes de estirilo, por ejemplo, FM1-43, que exhiben fluorescencia mejorada por membrana y son una herramienta poderosa en el estudio de la liberación de vesículas sinápticas (SV) en las neuronas12. Últimamente, los colorantes lipídicos sensibles al medio ambiente se han inventado y se han utilizado ampliamente como una nueva clase de reporteros para estudiar varias propiedades de la membrana celular, incluido el potencial de membrana11, el orden de fase13 y la secreción14.
Se desarrolló una nueva clase de miméticos lipídicos cuya fluorescencia es sensible al pH (p. ej., pHluorin) y a la membrana (p. ej., FM1-43) para medir directamente la distribución de lípidos en la membrana plasmática y los endosomas/lisosomas y el tráfico de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Para ello, se seleccionaron los conocidos fluoróforos solvatocrómicos que presentan características push-pull debido a la transferencia de carga intramolecular. Entre los fluoróforos solvatocrómicos existentes, el andamio de 1,8-naftalimida (ND) es relativamente fácil de modificar, versátil para el etiquetado y es único en fotofísica15 y, por lo tanto, se ha utilizado en intercaladores de ADN, diodos emisores de luz orgánicos y sensores de biomoléculas 16,17,18.
La unión de un grupo donante de electrones a la posición C4 del andamio ND genera una estructura push-pull, que conduce a un aumento del momento dipolar mediante la redistribución de la densidad de electrones en el estado excitado19,20. Tal transferencia de carga intramolecular produce grandes rendimientos cuánticos y desplazamientos de Stokes, lo que resulta en una fluorescencia brillante y estable21. Este grupo ha desarrollado recientemente una serie de análogos lipídicos solvatocrómicos basados en el andamio ND y los ha obtenido con buenos rendimientos sintéticos20.
La caracterización espectroscópica muestra que, entre esos productos, el ND6 posee las mejores propiedades de fluorescencia (Figura 1)20. En primer lugar, tiene picos de excitación y emisión bien separados (es decir, ~400 nm y ~520 nm, respectivamente, en la Figura 2A, B) en comparación con los fluoróforos populares como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la GFP, lo que lo hace espectralmente separable de ellos y, por lo tanto, útil para la obtención de imágenes multicolor. En segundo lugar, la fluorescencia de ND6 exhibe un aumento de más de ocho veces en su fluorescencia en presencia de micelas (Figura 2C), lo que sugiere una fuerte dependencia de la membrana. Estudios previos de imágenes de fluorescencia de células vivas con diferentes tipos de células mostraron una excelente tinción de membrana por ND620. En tercer lugar, cuando el pH de la solución disminuye de 7,5 (que se encuentra comúnmente en ambientes extracelulares o citosólicos) a 5,5 (que se encuentra comúnmente en endosomas y lisosomas), ND6 muestra un aumento de aproximadamente el doble en la fluorescencia (Figura 2D), lo que muestra su sensibilidad al pH. Además, la simulación de dinámica molecular indica que ND6 se integra fácilmente en la bicapa lipídica con su andamio ND hacia afuera de la membrana y el residuo de piperazina muestra fuertes interacciones con los grupos principales de fosfolípidos (Figura 3). En conjunto, estas características hacen de ND6 un análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar y medir el recambio lipídico de la membrana durante la exocitosis/endocitosis.
En este artículo se presenta un método para estudiar la tasa de recambio y la dinámica de los lípidos SV utilizando neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. Al estimular las neuronas con soluciones de Tyrode con alto contenido de K+ , los SV y la membrana plasmática se cargaron con ND6 (Figura 4A, B). Posteriormente, las neuronas fueron reestimuladas con diferentes estímulos seguidos de soluciones de Tyrode que contienen NH4Cl y pH 5,5 (Figura 4D). Este protocolo facilita la medición cuantitativa de las tasas de exocitosis y endocitosis ensambladas en diferentes circunstancias (Figura 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Sistema de adquisición de datos</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Digidata 1440A</td><td>Para la estimulación sincronizada y el intercambio de soluciones</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de doble canal</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>OMEGA Scientific FB-01</td><td>Para la fabricación de soluciones de H+20 utilizadas en disección y cultivo</td><td>de</td> tejidos</tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS cámara</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>Cámara de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>Para la fabricación de soluciones de H+20 utilizadas en la disección y el cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Plataforma calefactada</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences 354234</td><td></td><td>para el cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Para el control de adquisición</td></tr><tr><td>de imágenes Multiline Calentador de soluciones en línea</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Para el cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos Nikon Ti-E Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Cámara CMOS digital ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Cámara de perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Para la adquisición de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Sistema de perfusión de control de válvulas de seis canales</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Para el intercambio de soluciones</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso cuadrado</td><td>Grass Instrument</td><td>SD9</td><td>Para la estimulación del campo eléctrico</td></tr></tbody></table>

medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al ph nd6

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

La exo-/endocitosis es un proceso común que media el intercambio de biomoléculas entre las células y su entorno y entre diferentes células. Las células especializadas utilizan este proceso para ejecutar funciones vitales del cuerpo, como la secreción de insulina de las células β y la liberación de neurotransmisores de las sinapsis químicas. Debido a su importancia fisiológica, la exo-/endocitosis ha sido uno de los temas más estudiados en biología celular. Se han desarrollado muchas herramientas para estudiar este proceso a nivel de genes y proteínas, por lo que se sabe mucho sobre la maquinaria proteica que participa en este proceso. Sin embargo, se han desarrollado muy pocos métodos para medir el recambio lipídico de la membrana, que es la base física de la exocitosis.
Este artículo presenta una clase de nuevos análogos de lípidos fluorescentes que exhiben fluorescencia dependiente del pH y demuestra su uso para rastrear el reciclaje de lípidos entre la membrana plasmática y las vesículas secretoras. Con la ayuda de manipulaciones simples del pH, estos análogos también permiten la cuantificación de la distribución de lípidos a través de la superficie y los compartimentos de la membrana intracelular, así como la medición de la tasa de renovación de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Estos nuevos reporteros lipídicos serán de gran interés para diversos campos de investigación biológica, como la biología celular y la neurociencia.

Los SV están especializados para la liberación de neurotransmisores a través de exocitosis evocada27. Los SV tienen un lumen muy ácido (es decir, pH 5,5), que es ideal para el ND6. Utilizamos estimulación alta de K+ para evocar exo-/endocitosis SV con el fin de permitir que ND6 accediera a SV. Como era de esperar, aparecieron puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales después de la carga (Figura 9A). El perfil de lín...

Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Este protocolo describe la caracterización y aplicación de una nueva sonda lipídica fluorescente sensible al pH, específica para membranas celulares, que permite a los investigadores monitorizar la exo y la endocitosis en células vivas. La mayoría de los informes anteriores sobre la proteína de membrana se basan en la proteína de fluorescencia verde sensible al pH, que es indirecta. Como mimético lipídico, el ND6 se integra en la membrana celular y, por lo tanto, informa fielmente sobre el tráfico de membranas lipídicas.La sonda ND6 se vuelve fluorescente solo si se incrusta en el entorno de la membrana biológica. La intensidad de fluorescencia de esa sonda se correlaciona con la protonación y desprotonación del grupo principal de piperazina. Por lo tanto, emite una fluorescencia mucho más fuerte a un pH más bajo.La exocitosis y la endocitosis son procesos ubicuos que subyacen a la secreción y absorción de muchas moléculas de señalización. Por lo tanto, ND6 se puede utilizar para estudiar algunas cuestiones fundamentales en biología celular y ciencias biomédicas. Haley, Oliver y Jonathan, estudiantes de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento.Comience preparando una cámara de imágenes que permita el control de la temperatura y la salida de entrada de la solución para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas. Configure un dispositivo programable para cambiar las soluciones de perfusión y administrar el estímulo eléctrico en puntos de tiempo definidos durante la obtención de imágenes. Pesa una cantidad adecuada de ND6.Disolverlo en dimetilsulfóxido y dejar que se solubilice a temperatura ambiente. A continuación, sonique la solución brevemente. Filtre la solución madre cruda con un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar los agregados de colorante grandes.Usando un espectrofotómetro convencional o de micro volúmenes, determine la concentración de colorante a 405 nanómetros. Antes de la aplicación, diluya la solución madre a una concentración de un miligramo por mililitro utilizando la solución de baño. Mantenga la solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad.Agregue la solución madre de ND6 al medio de cultivo a la concentración final de un microgramo por microlitro e incorpórela para etiquetar de forma ubicua los compartimentos de membrana endocitosados, como los endosomas. Para reducir la extensión del marcaje de las vesículas sinápticas, suprimir la actividad neuronal espontánea farmacológicamente. Después de etiquetar selectivamente las vesículas sinápticas como se describe en el manuscrito, monte el cubreobjetos que contiene las células en la cámara de imágenes.Conecte el sensor de temperatura, la entrada de perfusión y la punta de vacío a la cámara de imágenes. Ajustar la velocidad de perfusión a aproximadamente 0,2 mililitros por segundo e iniciar la perfusión de la solución de tyrode normal precalentada que contiene NBQX y DAP5 para eliminar el exceso de ND6 en el cultivo. Ajuste el enfoque y localice el campo de visión apropiado que contenga neuronas sanas y bien distribuidas que lleven neuritas conectadas.Evitar las áreas que contienen dicoloides no resueltos. Intente obtener imágenes de células cargadas de ND6 con diferentes tiempos de exposición para identificar la mejor configuración de imágenes. Establezca el protocolo de estimulación y perfusión, el intervalo de fotogramas y la duración total utilizando la información del manuscrito de texto.Iniciar la adquisición de imágenes acompañado de estimulación y perfusión sincronizadas. Monitorizar la estimulación y el intercambio de soluciones durante la toma de imágenes. Detenga la perfusión después de que terminen las imágenes.Retire el cubreobjetos y limpie la cámara de imágenes para el próximo ensayo. Haga una copia de seguridad y haga una copia electrónica de todos los archivos de imagen. Seleccione y abra el programa de análisis para la extracción de datos.Abra o importe una pila de imágenes en el programa de análisis. Después de generar una máscara binaria, utilice la función de análisis de partículas con el tamaño de área y la circularidad adecuados para solicitar regiones de interés, o ROI, correspondientes a membranas celulares, endosomas, lisosomas o botones sinápticos. Seleccione cuatro ROI de fondo en regiones sin celdas dentro del campo de visión.A continuación, guarde todos los ROI seleccionados. Alinee todos los fotogramas dentro de las pilas de imágenes de lapso de tiempo ND6. Establezca la primera imagen como referencia y alinee el resto con ella mediante un registro rígido, lo que mitigará los artefactos debidos a la deriva XY.A continuación, guarde las pilas de imágenes alineadas. Aplique los ROI guardados a pilas de imágenes ND6 alineadas. Mida las intensidades medias de píxeles de la fluorescencia ND6 para cada ROI en cada fotograma de la pila de imágenes.A continuación, exporte los resultados para su análisis estadístico. Calcule la intensidad media de los ROI de fondo para obtener el ruido de referencia, que se restará de todos los ROI seleccionados. Promedie las tres intensidades medias más altas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de la solución de tyrode pH 5.5 para obtener la intensidad de fluorescencia máxima, definida como 100% para la normalización.Promedie las tres intensidades medias más bajas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de cloruro de amonio de 50 milimolares para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, definida como 0% para la normalización. Calcule los cambios de fluorescencia relativos para cada ROI en función de sus propias intensidades de 0% y 100%. Derive los cambios medios de fluorescencia, la cinética de los cambios y otros valores o gráficos a partir de datos individuales de ROI.Los puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales fueron visibles después de cargar las células neuronales con ND6. Una fuerte correlación entre las intensidades de fluorescencia de ND6 y FM464 también sugirió la tinción de vesículas sinápticas por ND6. Se observó una disminución en la fluorescencia de ND6 en respuesta tanto a la estimulación eléctrica como a la estimulación con alto contenido de potasio, lo que sugiere que ND6 reside en la membrana de la vesícula sináptica y que la luz de la vesícula sináptica se neutraliza durante la liberación.Bajo una estimulación eléctrica exhaustiva, el tratamiento con M beta CD redujo significativamente la liberación y recuperación de vesículas sinápticas medida por imágenes ND, lo que sugirió que el colesterol de membrana facilita la exocitosis y endocitosis de las vesículas sinápticas. Baf A1 impidió la recuperación de la fluorescencia de ND6 después de la estimulación al bloquear de forma aguda la reacidificación de las vesículas sinápticas recuperadas. Es imprescindible tener conocimientos básicos de microscopía de fluorescencia.Es muy importante una planificación cuidadosa de las condiciones fisiológicas para respaldar la obtención de imágenes de células vivas. Es crucial determinar con precisión la concentración de la solución madre de ND. Si es posible, vuelva a medir la concentración de la solución madre antes de cada uso.Manténgalo alejado de la luz solar directa para evitar el blanqueamiento fotográfico y la descomposición de la sonda.

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.

Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Presentamos una nueva técnica para medir la difusión lateral de una especie tensioactiva en la interfaz fluido-fluido mediante la fusión de una monocapa de gota en una monocapa plana.

La recuperación de fluorescencia después de combinar una gotita de medir la difusión de dos dimensiones de un fosfolípido monocapa

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Este protocolo presenta el uso de un entorno de muestra de flujo detenido para mezclar rápidamente múltiples soluciones líquidas in situ durante una medición de dispersión de neutrones de ángulo pequeño y para estudiar procesos cinéticos en escalas de longitud nanométrica y escalas de segundo tiempo.

Medición de la evolución temporal de materiales a nanoescala con flujo detenido y dispersión de neutrones de ángulo pequeño

La lipofagia es una forma selectiva de autofagia que implica la degradación de las gotas de lípidos. Las disfunciones en este proceso se asocian con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. Este protocolo describe enfoques de imágenes cuantitativas para comprender mejor la interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer.

Explorando la regulación del catabolismo de las gotas lipídicas a través de la lipofagia

Describimos un método para utilizar la ciclodextrina para mediar el intercambio entre lípidos de la membrana plasmática con lípidos exógenos. Esta técnica se puede combinar con experimentos que estudian proteínas transmembrana, que se comportan de manera diferente en entornos lipídicos similares a balsas que en entornos no similares a balsas.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Este protocolo detalla un ensayo in vitro para medir la captación de lípidos celulares en células endoteliales tras la estimulación con BODIPY-C12 y BODIPY-C16 , análogos fluorescentes de ácidos grasos saturados de cadena larga y cadena muy larga. Este método es eficiente y adaptable a otros tipos de células, ofreciendo un enfoque útil para estudiar el metabolismo de los lípidos.

Cuantificación de la absorción de ácidos grasos endoteliales utilizando análogos de ácidos grasos fluorescentes

Aprende a medir el recambio de lípidos de membrana en neuronas vivas utilizando la sonda fluorescente ND6 sensible al pH. Este método permite visualizar directamente los procesos de exocitosis y endocitosis con alta precisión.

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

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