Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Este protocolo llena un vacío técnico para el estudio bioquímico de C.elegans y amplía su utilidad como organismo modelo. Esta técnica es simple y robusta, lo que permite un aislamiento constante del extracto nuclear de C.elegans funcionalmente activo. Comience colocando los animales L1 sincronizados en 10 placas que contienen medios de crecimiento de nematodos de 150 milímetros sembrados con Escherichia coli OP50, y permita que los animales crezcan durante 48 horas a 20 grados Centígrados hasta que alcancen la etapa L4.

Una vez preparados los tampones hipotónicos e hipertónicos, limpie el homogeneizador Balch inundando la cámara de molienda con etanol al 70%. Luego enjuague la cámara con agua desionizada para eliminar el exceso de etanol. Inserte la bola de carburo de tungsteno en la cámara de molienda.

Tapa los extremos del cañón del homogeneizador Balch y asegura las tapas con los tornillos de pulgar proporcionados. Luego prepare cinco mililitros de los tampones hipotónicos e hipertónicos completos por muestra como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, llene una jeringa estéril de dos mililitros con un mililitro de tampón hipotónico completo y enjuague suavemente la cámara de molienda del homogeneizador Balch, dejando aproximadamente 500 microlitros de tampón hipotónico completo en la cámara.

Guarde el homogeneizador enjuagado en hielo y déjelo enfriar durante 30 minutos. Recoja los animales L4 bien alimentados con tampón M9 en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a los animales a 1.000 veces g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y continúe lavando el pellet animal hasta que el sobrenadante esté claro.

A continuación, lave a los animales con tres mililitros de tampón hipotónico frío y centrífique nuevamente como se ha demostrado. Después de retirar el tampón hipotónico sobrenadante, agregue un mililitro de tampón hipotónico completo al gránulo animal y transfiera la suspensión animal a una nueva jeringa estéril de dos mililitros. Para homogeneizar los animales mantenidos en hielo, empuje suavemente a los animales a través de la cámara de molienda del homogeneizador Balch cargado con la bola de tungsteno.

Luego recoja a los animales en la jeringa y repita este procedimiento 30 veces. Después de 30 ciclos de homogeneización, recoja la suspensión máxima de animales del homogeneizador Balch y guarde la jeringa con la punta colocada hacia abajo dentro de un microtubo de 1,7 mililitros. Retire la bola de tungsteno y limpie la cámara de molienda con agua desionizada.

Seque y devuelva la bola al tubo etiquetado respectivo. Luego inserte la bola de tungsteno con un diámetro de 7.9880 milímetros y un espacio libre de 12 micrómetros en la cámara de molienda, y vuelva a sellar el homogeneizador. Enjuague la cámara de molienda nuevamente con un mililitro de tampón hipotónico completo helado.

Moler la suspensión 25 veces como se ha demostrado. Transfiera la suspensión del animal a un microtubo limpio de 1,7 mililitros y guarde la suspensión en hielo. Pellet por los cuerpos de los animales y los escombros por centrifugación.

Pipetee 40 microlitros del sobrenadante a un tubo etiquetado como fracción de entrada y almacene la fracción en hielo. Transfiera el sobrenadante restante a un nuevo tubo de 1,7 mililitros sin perturbar el pellet, y centrífuga para granular los núcleos. Luego transfiera el sobrenadante sin perturbar los núcleos granulados a un nuevo tubo de 1,7 mililitros marcado como fracción citosólica.

Para lavar el pellet de núcleos, agregue 500 microlitros de tampón hipotónico completo al pellet, suspenda el pellet y centrífique a 4, 000 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo nuclear en 500 microlitros de tampón hipotónico completo fresco, y vuelva a centrifugar la muestra como se ha demostrado. Luego disuelva el pellet en 40 microlitros de tampón hipertónico completo.

Transfiera la suspensión nuclear a una nueva fracción nuclear etiquetada con tubo de 1,7 mililitros y guárdela en hielo. Determine la concentración de proteínas de tres fracciones utilizando un kit de cuantificación fluorescente. Alícuota las fracciones nucleares en tubos de un solo uso que contengan seis microgramos de la proteína nuclear, y congele en hielo seco y baño de etanol.

Guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. La imagen representativa del gel muestra los productos de transcripción del extracto nuclear de larvas de Caenorhabditis elegans L4 utilizando la plantilla de ADN promotor de CMV. El aislamiento exitoso de proteínas nucleares activas resultó en una banda de 132 pares de bases después de una transcripción in vitro, y el aislamiento fallido resultó en una banda débil o la ausencia de una banda.

Recuerde etiquetar claramente los búferes completos. Los tampones inapropiados pueden dañar la funcionalidad de las proteínas nucleares. Además, mantenga el homogeneizador helado para evitar la desnaturalización de las proteínas.

El desarrollo de esta técnica permitió a los investigadores medir la tasa de transcripción de ARN de C.elegans durante condiciones estresantes, lo que demuestra que la tasa de transcripción del animal puede cambiar dependiendo de las condiciones ambientales.