Name: Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a aislar extractos nucleares activos de Caenorhabditis elegans y reconstituir la transcripción in vitro. Este protocolo robusto utiliza un homogeneizador Balch para estudiar regulación génica.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar el sistema de transcripción eucariota debido a su bajo costo de mantenimiento y la facilidad de manipulación genética. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento consistente del extracto nuclear funcionalmente activo de L4 C. elegans . Aunque este protocolo se centró en visualizar la actividad de transcripción, el ADNc producido post-transcripcionalmente se puede cuantificar mediante RT-qPCR para obtener una medición más precisa de la acti...

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.
Si bien las contribuciones del nematodo a la ciencia son vastas, se han subutilizado para dilucidar el sistema de transcripción eucariota, y la mayor parte de nuestra comprensión sobre estos mecanismos proviene de estudios que utilizan extracto nuclear de levadura, mosca de la fruta y cultivo de células de mamíferos2. El mayor obstáculo que disuade a los investigadores de extraer extracto nuclear funcional es la dura cutícula externa del nematodo. Este exoesqueleto comprende colágenos, cuticlinas, glicoproteínas y lípidos reticulados, lo que hace que C. elegans desde la etapa larvaria hasta la edad adulta sea resistente a la extracción de proteínas a través de fuerzas químicas o mecánicas3. Una vez se desarrolló un sistema de transcripción in vitro que utiliza extracto nuclear de C. elegans, pero no se adoptó ampliamente debido al alcance limitado del sistema, y el uso del homogeneizador Dounce para preparar el extracto podría conducir a la inestabilidad de la proteína4,5.
A diferencia del protocolo anterior para el aislamiento de extractos nucleares que utilizaba un homogeneizador Dounce para romper C. elegans, este protocolo utiliza un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch consta de dos componentes principales: una bola de carburo de tungsteno y un bloque de acero inoxidable con un canal perforado de un extremo a otro. El homogeneizador Balch se carga con la bola de carburo de tungsteno y se tapa a cada lado para sellar la cámara de molienda. Las jeringas se pueden cargar en los dos puertos verticales que conducen a la cámara de molienda. A medida que el material pasa de una jeringa a la otra a través de la cámara de molienda, la presión de las jeringas fuerza el material a través de un espacio estrecho entre la bola y la pared de la cámara. Esta presión lenta y constante rompe el material hasta que alcanza un tamaño consistente que es capaz de pasar a través del espacio estrecho fácilmente. Forzar a C. elegans a través de la estrecha brecha a través de una presión constante pero suave rompe la apertura de los animales, liberando su contenido en el amortiguador circundante. Cambiar el tamaño de las bolas aprieta aún más la brecha, rompiendo las células recién liberadas y libera los núcleos en el tampón. Múltiples instancias de centrifugación separan los núcleos del resto de los desechos celulares, lo que permite la recolección de un extracto nuclear limpio. El homogeneizador Balch es preferido sobre el homogeneizador Dounce por varias razones: el sistema puede manejar una gran cantidad de animales, lo que permite extraer una gran cantidad de proteínas activas en un solo intento; el mecanizado preciso de las bolas y el bloque de acero permite un rectificado consistente entre múltiples muestras; el bloque de acero pesado actúa como un disipador de calor, extrayendo uniformemente el calor de la cámara de molienda, evitando la desnaturalización.
Después del aislamiento, la actividad transcripcional del extracto nuclear debe verificarse antes de ser utilizada en cualquier experimento bioquímico. Tradicionalmente, la actividad de transcripción se medía utilizando nucleótidos radiomarcados para rastrear y visualizar el ARN recién sintetizado. Sin embargo, el etiquetado radiactivo puede ser oneroso, ya que requiere precaución durante el uso y la eliminación6. Los avances tecnológicos permiten a los investigadores de hoy utilizar métodos mucho menos dañinos o problemáticos para medir incluso pequeñas cantidades de ARN utilizando técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)7. Aquí, el protocolo describe un método para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 (L4) C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Consumibles y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 8-Strip Tubos & Tapas de tiras planas, transparentes</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR individuales de 0,2 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL microtubos estériles</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de grado molecular absoluto 100%</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica de 10 mL</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 150 mm</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de plástico de 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL jeringas Norm-Ject</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL vaso de filtro de vacío 0,22 y micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga cónicos de 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica de 5 mL</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Rotulador a prueba de alcohol</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Dicloruro de calcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C8667 C8667 C8667</td><td></td></tr><tr><td>Con de clonación de templo de ADN, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clonación de templos de control de ADN, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>desionizada</tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de gel de ADN, Invitrogen seguro SYBR</td><td></td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de escalera de ADN, O' gobernante genético</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga de ADN, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNasa, Referencia-CERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr><tr><td>Escherichia coli OP50 cepa</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transcripción in vitro de extracto nuclear HeLa, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Hepes, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 37%</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Blanqueador de hipoclorito</td><td>Caldo Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Dicloruro de magnesio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Platos de peso medio</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>agua de grado molecular, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nistatina</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; Sistema de PCR N1638</td><td></td></tr><tr><td>, FailSafe con premezcla A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa, cóctel de un solo uso Halt 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensayo de proteínas, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Q33211</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcripción inversa, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>kit de extracción de ARN Kit micro RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74004</td> Inhibidor de ARNasa <td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril con 0.2 y micro; m Membrana de polietersulfona</td><td>VWR international</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>cebadores de transcripción, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cebadores de transcripción, reverso 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; Incubadora C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; Incubadora C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; incubadora C</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C frigorífico</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; Congelador C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch homogeneizador, isobiotec homogeneizador celular</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer de sobremesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, Eppendorf 5418 R</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección, Leica M80</td><td>Fluorómetro Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes en gel, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífugas, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Pipeta</td><td>de 17014382</td><td></td>Rainin</tr><tr><td> L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin 17014392</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma oscilante</td><td>VWR International, Eppendorf Mastercycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro, Eppendorf 950030010</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento del extracto nuclear activo de caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans ha sido un importante sistema modelo para la investigación biológica desde que se introdujo en 1963. Sin embargo, C. elegans no se ha utilizado completamente en el estudio bioquímico de reacciones biológicas utilizando sus extractos nucleares, como la transcripción in vitro y la replicación del ADN. Un obstáculo significativo para el uso de C. elegans en estudios bioquímicos es interrumpir la gruesa cutícula externa del nematodo sin sacrificar la actividad del extracto nuclear. Si bien se utilizan varios métodos para romper la cutícula, como la homogeneización o la sonicación de Dounce, a menudo conducen a la inestabilidad de las proteínas. No existen protocolos establecidos para aislar proteínas nucleares activas de larvas o adultos de C. elegans para reacciones in vitro . Aquí, el protocolo describe en detalle la homogeneización de la etapa larvaria 4 C. elegans utilizando un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch utiliza presión para forzar lentamente a los animales a través de un estrecho espacio que rompe la cutícula en el proceso. El diseño uniforme y el mecanizado preciso del homogeneizador Balch permiten una molienda constante de animales entre experimentos. El fraccionamiento del homogeneizado obtenido del homogeneizador Balch produce un extracto nuclear funcionalmente activo que se puede utilizar en un método in vitro para evaluar la actividad de transcripción de C. elegans.

Siguiendo los pasos descritos se debe producir extracto nuclear funcional (Figura 1), la desviación en los pasos de molienda o lavado puede conducir a una actividad deficiente o bajos rendimientos. Si se obtiene extracto nuclear funcional de C. elegans , transcribirá la región aguas abajo del promotor cmv en la plantilla de ADN cuando se agregue al ensayo in vitro descrito anteriormente. La transcripción de ARN resultante se puede purificar...

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Este protocolo llena un vacío técnico para el estudio bioquímico de C.elegans y amplía su utilidad como organismo modelo. Esta técnica es simple y robusta, lo que permite un aislamiento constante del extracto nuclear de C.elegans funcionalmente activo. Comience colocando los animales L1 sincronizados en 10 placas que contienen medios de crecimiento de nematodos de 150 milímetros sembrados con Escherichia coli OP50, y permita que los animales crezcan durante 48 horas a 20 grados Centígrados hasta que alcancen la etapa L4.Una vez preparados los tampones hipotónicos e hipertónicos, limpie el homogeneizador Balch inundando la cámara de molienda con etanol al 70%. Luego enjuague la cámara con agua desionizada para eliminar el exceso de etanol. Inserte la bola de carburo de tungsteno en la cámara de molienda.Tapa los extremos del cañón del homogeneizador Balch y asegura las tapas con los tornillos de pulgar proporcionados. Luego prepare cinco mililitros de los tampones hipotónicos e hipertónicos completos por muestra como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, llene una jeringa estéril de dos mililitros con un mililitro de tampón hipotónico completo y enjuague suavemente la cámara de molienda del homogeneizador Balch, dejando aproximadamente 500 microlitros de tampón hipotónico completo en la cámara.Guarde el homogeneizador enjuagado en hielo y déjelo enfriar durante 30 minutos. Recoja los animales L4 bien alimentados con tampón M9 en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a los animales a 1.000 veces g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y continúe lavando el pellet animal hasta que el sobrenadante esté claro.A continuación, lave a los animales con tres mililitros de tampón hipotónico frío y centrífique nuevamente como se ha demostrado. Después de retirar el tampón hipotónico sobrenadante, agregue un mililitro de tampón hipotónico completo al gránulo animal y transfiera la suspensión animal a una nueva jeringa estéril de dos mililitros. Para homogeneizar los animales mantenidos en hielo, empuje suavemente a los animales a través de la cámara de molienda del homogeneizador Balch cargado con la bola de tungsteno.Luego recoja a los animales en la jeringa y repita este procedimiento 30 veces. Después de 30 ciclos de homogeneización, recoja la suspensión máxima de animales del homogeneizador Balch y guarde la jeringa con la punta colocada hacia abajo dentro de un microtubo de 1,7 mililitros. Retire la bola de tungsteno y limpie la cámara de molienda con agua desionizada.Seque y devuelva la bola al tubo etiquetado respectivo. Luego inserte la bola de tungsteno con un diámetro de 7.9880 milímetros y un espacio libre de 12 micrómetros en la cámara de molienda, y vuelva a sellar el homogeneizador. Enjuague la cámara de molienda nuevamente con un mililitro de tampón hipotónico completo helado.Moler la suspensión 25 veces como se ha demostrado. Transfiera la suspensión del animal a un microtubo limpio de 1,7 mililitros y guarde la suspensión en hielo. Pellet por los cuerpos de los animales y los escombros por centrifugación.Pipetee 40 microlitros del sobrenadante a un tubo etiquetado como fracción de entrada y almacene la fracción en hielo. Transfiera el sobrenadante restante a un nuevo tubo de 1,7 mililitros sin perturbar el pellet, y centrífuga para granular los núcleos. Luego transfiera el sobrenadante sin perturbar los núcleos granulados a un nuevo tubo de 1,7 mililitros marcado como fracción citosólica.Para lavar el pellet de núcleos, agregue 500 microlitros de tampón hipotónico completo al pellet, suspenda el pellet y centrífique a 4, 000 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo nuclear en 500 microlitros de tampón hipotónico completo fresco, y vuelva a centrifugar la muestra como se ha demostrado. Luego disuelva el pellet en 40 microlitros de tampón hipertónico completo.Transfiera la suspensión nuclear a una nueva fracción nuclear etiquetada con tubo de 1,7 mililitros y guárdela en hielo. Determine la concentración de proteínas de tres fracciones utilizando un kit de cuantificación fluorescente. Alícuota las fracciones nucleares en tubos de un solo uso que contengan seis microgramos de la proteína nuclear, y congele en hielo seco y baño de etanol.Guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. La imagen representativa del gel muestra los productos de transcripción del extracto nuclear de larvas de Caenorhabditis elegans L4 utilizando la plantilla de ADN promotor de CMV. El aislamiento exitoso de proteínas nucleares activas resultó en una banda de 132 pares de bases después de una transcripción in vitro, y el aislamiento fallido resultó en una banda débil o la ausencia de una banda.Recuerde etiquetar claramente los búferes completos. Los tampones inapropiados pueden dañar la funcionalidad de las proteínas nucleares. Además, mantenga el homogeneizador helado para evitar la desnaturalización de las proteínas.El desarrollo de esta técnica permitió a los investigadores medir la tasa de transcripción de ARN de C.elegans durante condiciones estresantes, lo que demuestra que la tasa de transcripción del animal puede cambiar dependiendo de las condiciones ambientales.

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Investigación

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Este protocolo describe cómo estudiar procesos celulares durante la conversión de destino celular en Caenorhabditis elegans en vivo. Uso de animales transgénicos, permitiendo sobreexpresión impulsado por el promotor de shock térmico la neurona destino-inducción del factor de transcripción CHE-1 y agotamiento RNAi-mediada de la regulación de cromatina factor LIN-53 germen célula neurona reprogramación puede observarse en vivo.<br...

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de RNA, DNA y proteínas de la misma muestra, en un esfuerzo por reducir la variación y mejorar la reproducibilidad, facilitar interpretaciones.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans.  Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

El presente protocolo describe métodos de suplementación lipídica en cultivos líquidos y en placa para Caenorhabditis elegans, junto con estudios longitudinales y análisis transcripcionales de genes a granel o unos pocos gusanos y tejidos de gusanos.

Suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en Caenorhabditis elegans

Aprenda a aislar extractos nucleares activos de Caenorhabditis elegans y reconstituir la transcripción in vitro. Este protocolo robusto utiliza un homogeneizador Balch para estudiar regulación génica.

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

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