Name: Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a cuantificar la fagocitosis de macrófagos regulada por células madre mesenquimales usando partículas fluorescentes sensibles al pH. Este protocolo permite estudiar mecanismos de contacto celular en inmunidad innata.

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Este trabajo fue apoyado por el mecanismo del Instrumento Principal de Investigación de la NSF bajo los números de subvención 1626093 y 1919583.

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<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
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<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
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<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
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<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El análisis de la fagocitosis utilizando biopartículas conjugadas a un colorante sensible al pH es una herramienta relativamente nueva que ha demostrado ser ventajosa sobre las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes12,19,20. Con las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes, solo es factible el análisis de punto final. La detección se realiza con microscopía fluorescente y/o espectrofluorometría desp...

Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras que dan lugar a células de tejido conectivo. Los MSC están presentes en tejidos de mamíferos adultos y se pueden aislar de la médula ósea1. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, estas células son ampliamente estudiadas2. Los primeros estudios se centraron en la regulación MSC de las células T3,4,5,6, pero más recientemente, su regulación de las células macrófagos (MΦ), un componente celular importante de la inmunidad innata, ha recibido una mayor atención7,8,9,10,11,12,13,14 . La importancia de la interacción MSC-MΦ en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria se ve subrayada por el hecho de que el agotamiento de monocitos/macrófagos abroga los efectos terapéuticos de MSC en modelos animales8. Aquí, el foco es la interacción de contacto celular del MSC con MΦ. Los MSC tienen la capacidad de regular el fenotipo de MΦ promoviendo el cambio de respuestas inflamatorias a antiinflamatorias, lo que lleva a actividades de reparación de tejidos8,9,10,11,y se ha hecho mucho para demostrar estos mecanismos reguladores. En otras circunstancias, MSC puede apoyar o exacerbar una respuesta inflamatoria impulsada por MΦ12,13 y mejorar la actividad fagocítica de MΦ14,15. Sin embargo, existe una falta crítica de datos existentes que identifiquen los mecanismos y las condiciones bajo las cuales MSC regula la actividad fagocítica MΦ.
Los MΦ tienen familias de receptores que reconocen patógenos opsonizados (recubiertos de anticuerpos o complemento) o no opsonizados que conducen a la fagocitosis16. La activación y actividad de este último está menos estudiada17. En un ambiente in vitro no inflamatorio, los MSC mejoran la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados13. Sin embargo, el reconocimiento de patógenos no opsonizados por MΦ puede reducirse después de la exposición a un ambiente inflamatorio producido por linfocitos durante una respuesta inmune adaptativa. El IFN-γ, liberado por las células asesinas naturales y los linfocitos efectores, tiene un efecto inhibidor sobre la fagocitosis MΦ de partículas no opsonizadas18. Se desarrolló un modelo de coculto para estudiar los mecanismos de regulación del contacto directo MSC de la fagocitosis MΦ. El objetivo del experimento presentado aquí es determinar si los MSC regulan la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados después de que MΦ haya sido expuesto al IFN-γ(Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0,4% solución azul de tripano</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 15 mL y 50 mL</td><td>ThermoFisher ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 4 pocillos con pocillos no extraíbles</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)&nbsp; Sistema de imagen Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo, tratamiento con cultivo de tejidos, superficie 75&nbsp; cm2, cuello inclinado, con capuchón, filtrado</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Línea Celular MSC de Ratón</td></tr><tr><td>DMEM, Alta Glucosa</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Suero Bovino Fetal, calificado, inactivado por calor</td><td>Hemocitómetro ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Ratón M&Phi; Línea celular</td></tr><tr><td>LADMAC Línea celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>Las células LADMAC secretan el factor de crecimiento factor estimulante de colonias 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>Solución de imagen de células vivas</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Biopartículas Conjugadas</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Murina recombinante IFN-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices Unidades</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estériles de filtro al vacío de un solo uso, 250 mL, 0,2 y micro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles, 0,2 micrómetros</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo tratadas para cultivo de tejidos, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; cuantificación e imágenes

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado tradicionalmente por sus propiedades regenerativas, pero más recientemente, sus características inmunorreguladoras han estado a la vanguardia. Interactúan y regulan la actividad de las células inmunes. El enfoque de este estudio es la regulación MSC de la actividad fagocítica de los macrófagos. La fagocitosis de macrófagos (MΦ) es una parte importante de la respuesta del sistema inmune innato a la infección, y los mecanismos a través de los cuales msc modulan esta respuesta están bajo investigación activa. Aquí se presenta un método para estudiar la fagocitosis MΦ de partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a una molécula fluorescente sensible al pH mientras están en coculto con MSC. A medida que aumenta la actividad fagocítica y las partículas de zymosan etiquetadas están encerradas dentro del ambiente ácido del faglisosoma, la intensidad de fluorescencia de la molécula sensible al pH aumenta. Con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas, la actividad fagocítica se mide utilizando un espectrofotómetro fluorescente y los datos cinéticos se presentan como cambios en las unidades fluorescentes relativas durante un período de 70 minutos. Para apoyar estos datos cuantitativos, el cambio en la actividad fagocítica se visualiza utilizando imágenes dinámicas. Los resultados que utilizan este método demuestran que cuando se está en coculto, msc mejora la fagocitosis MΦ de la zymosan no opsonizada de MΦ tanto naïve como IFN-γ tratada. Estos datos se suman al conocimiento actual de la regulación MSC del sistema inmune innato. Este método se puede aplicar en futuras investigaciones para delinear completamente los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.

Después de calcular la media ± SEM para cada grupo en todos los puntos de tiempo, los datos se presentan en formato de gráfico de líneas con el eje Y como la intensidad fluorescente relativa y el eje X como tiempo. El archivo complementario 1 proporciona un ejemplo de datos sin procesar de una lectura cinética de la placa de 96 pozos en formato de hoja de cálculo.
En este estudio, los resultados óptimos presentados en la Figura 3Ay la Tabl...

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Este método de coculto ayudará a responder preguntas clave sobre los mecanismos de contacto celular detrás de la regulación de las células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos y, por lo tanto, iluminará el papel de MSC en la regulación de la inmunidad innata. Esta técnica se puede aplicar en análisis de alto rendimiento. Las biopartículas conjugadas con colorantes sensibles al pH fluorescencia solo en ambientes de faglisosomas ácidos.Por lo tanto, el lavado y el enfriamiento son necesarios. Este método también se puede aplicar a una variedad de modelos de coculto que incluyen neutrófilos y otros fagocitos. Demostrando el procedimiento estará Ethan Chetkof, un estudiante universitario actualmente en mi laboratorio.Para empezar, observe la confluencia de células madre mesenquimales cultivadas. Cuando se alcanza una confluencia del 70-80%, aspire el medio de crecimiento de las células cultivadas en un plato de 100 milímetros y agregue cinco mililitros de PBS. Después de aspirar el PBS, agregue dos mililitros de solución de EDTA de tripsina al 0,05% e incube las células durante tres minutos.Después de tres minutos, verifique el desprendimiento celular con un microscopio invertido. Y si las células no están separadas, incube durante uno o dos minutos nuevamente. Una vez que todas las células estén separadas, agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco a la placa.Después de enjuagar la placa con la mezcla de medio de tripsina, use una pipeta serológica estéril para recolectar células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 mililitros. A continuación, peletizar las células por centrifugación. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a colocar la gránula celular en 10 mililitros de medio de crecimiento fresco mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.Para el conteo celular, agregue 10 microlitros de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga 30 microlitros de solución de Trypan Blue al 0.4%, luego agregue 10 microlitros de la mezcla debajo de la cubierta de una cámara de conteo del hemocitómetro. Bajo el microscopio invertido o Brightfield, cuente las células viables no teñidas utilizando una lente de objetivo 10X y cuatro cámaras de un milímetro cuadrado y calcule el número de células como se describe en el manuscrito de texto. Utilice la ecuación C1V1 igual a C2V2 para determinar el volumen deseado del medio fresco y la suspensión celular necesaria para preparar la suspensión celular a una concentración final de una vez 10 a la quinta célula por mililitro.Use un micropipetador multicanal para agregar 100 microlitros de la suspensión celular en los pozos de una placa de 96 pozos de acuerdo con el diseño de la placa. Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión celular a cada uno de los portaobjetos de la cámara de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche. Preparar 10 mililitros de medio de activación que contenga interferón gamma a una concentración de 250 nanogramos por mililitro para activar las células de macrófagos en un plato de 100 milímetros.Aspire el medio de crecimiento de los cultivos de células macrófagos y enjuague las células con cinco mililitros del medio de activación desprovisto de interferón gamma. Después de aspirar el medio de enjuague en el plato experimental, agregue 10 mililitros de medio de activación suplementado con interferón gamma. Y en el plato de control, agregue 10 mililitros de medio de activación sin interferón gamma, luego incube las células durante 16 a 24 horas.Al final de la incubación, para preparar los cocultivos, retire el medio de activación de las células de macrófagos y agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco. Use un elevador de células para raspar suavemente las células y recolectar las células en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, cuente las células utilizando la exclusión de Trypan Blue y la hemocitometría, seguida de la preparación de suspensiones de células macrófagos de control y tratadas a la concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro como se demostró previamente para las células madre mesenquimales.Aspire suavemente el medio de los pozos experimentales que contienen células madre mesenquimales. Utilice una micropipeta multicanal para agregar 100 microlitros de las suspensiones de células de macrófagos tratadas y de control en los pozos experimentales apropiados de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche como se ha demostrado. Aspire suavemente el medio desde el portaobjetos de cámara de cuatro paredes que contiene células madre mesenquimales.Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión de células de macrófagos a los pozos apropiados de acuerdo con el diseño e incube durante la noche. Agregue un mililitro de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene un miligramo de partículas de Zymosan y recoja la mezcla de partículas de medio en un tubo de cultivo de vidrio. Después de enjuagar el vial con un mililitro adicional de solución de imágenes, transfiera el medio de imágenes enjuagado en el tubo de vidrio, luego agregue tres mililitros de solución de imágenes adicional para lograr 0.2 miligramos por mililitro de suspensión de partículas de Zymosan.Vórtice la suspensión Zymosan usando pulsos rápidos durante 30 a 60 segundos, luego use un sonicador de sonda para sonicar la suspensión con 60 pulsos rápidos. Después de aspirar el medio, enjuague los pozos experimentales y los pozos en blanco del reactivo con 100 microlitros de solución de imágenes de células vivas. A continuación, aspire la solución de imágenes de células vivas de los pozos y agregue 100 microlitros de la suspensión de Zymosan.Abra la bandeja de placas del lector fluorescente utilizando la interfaz del panel táctil. Coloca la placa sin la tapa en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde de lectura en el menú superior.Para realizar el ensayo de fagocitosis, después de enjuagar el primer pozo experimental con 750 microlitros del medio de imagen, agregue 400 microlitros de la suspensión de Zymosan dejando los pozos restantes en el medio de crecimiento. A continuación, coloque la diapositiva en la etapa incubada del sistema de imágenes. Utilice el software de imágenes.Seleccione la opción Campo brillante en la pestaña Localizar y, a continuación, haga clic en el icono del ocular. Con el objetivo 10X en su lugar, use el ocular y la perilla de enfoque para enfocar las células. Seleccione la pestaña de adquisición.Abra el menú desplegable del experimento y seleccione un conjunto de longitudes de onda que incluya el conjunto de filtros EGFP para acomodar la excitación de 509 nanómetros y las longitudes de onda de emisión de 533 nanómetros del tinte sensible al pH. Cuando queden unos dos minutos en el temporizador, haga clic en el icono 20X en el menú del objetivo para cambiar el objetivo a 20X, luego haga clic en el menú de canales, seleccione filtros EGFP y, en el menú de exposición, establezca el tiempo de exposición en 400 milisegundos para detectar el fluoróforo verde sensible al pH, y luego haga clic en en vivo. Después de ajustar el enfoque, haga clic en detener para apagar la luz y marque la casilla junto a la configuración experimental de lapso de tiempo superior.En el menú de estrategia de enfoque, seleccione el enfoque automático del software y, en el menú desplegable, seleccione la configuración inteligente y central para reducir el tiempo de exposición a la luz mientras se ejecuta el enfoque automático. En el menú de lapso de tiempo, establezca el número deseado de adquisiciones en 30 a 60, el tiempo de intervalo en un minuto y luego haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar la adquisición. Se estudió el efecto del interferón gamma sobre el coculto.Los resultados representativos demuestran que el coculto de macrófagos con células madre mesenquimales mejora la actividad fagocítica del macrófago. El tratamiento con interferón gamma reduce la actividad del macrófago. Sin embargo, en presencia de células madre mesenquimales, la actividad fagocítica de los macrófagos fue parcialmente rescatada.Las densidades celulares óptimas son críticas en estos estudios. Y cuando las células de macrófagos se cubrieron a una densidad demasiado baja, no se detectaron cambios en la intensidad de la fluorescencia. Cuando las células macrófagos se colocaron en una alta densidad, la intensidad de la fluorescencia se elevó rápidamente en todos los grupos y no se discernieron diferencias.Una de las cosas más importantes durante este procedimiento es asegurarse de que las densidades celulares se optimicen y se mantengan consistentes entre los experimentos.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Este video muestra un ensayo para estudiar la regulación de la fagocitosis de macrófagos con células madre mesenquimales (MSC) en un co-cultivo. Al co-cultivar MSC con macrófagos, se añaden partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a un fluoróforo sensible al pH para ser fagocitadas por los macrófagos. Con el aumento de la fagocitosis, la intensidad de la fluorescencia aumenta, lo que permite determinar la regulación de la actividad fagocítica mediada por MSC.

Un ensayo para estudiar la regulación de la fagocitosis de los macrófagos por las células madre mesenquimales

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos en modelos de ratón, para evaluar los efectos de las intervenciones nutricionales, farmacológicas y genéticas en los monocitos sanguíneos y para caracterizar los monocitos sanguíneos derivados de los macrófagos en modelos de ratón utilizando tapones de gel de membrana de sótano cargados de monocitos-quimioattractant-1 (MCP-1).

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos

En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Este protocolo describe la robusta generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre, y métodos para su posterior caracterización. La expresión del marcador de superficie celular, la expresión génica y los ensayos funcionales se utilizan para evaluar el fenotipo y la función de estos macrófagos derivados de iPSC.

Producción y caracterización de macrófagos humanos a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Aprende a cuantificar la fagocitosis de macrófagos regulada por células madre mesenquimales usando partículas fluorescentes sensibles al pH. Este protocolo permite estudiar mecanismos de contacto celular en inmunidad innata.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

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