Name: Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende a estudiar genes letales embrionarios en tumores malignos de la vaina del nervio periférico mediante ablación ex vivo con adenovirus Cre en modelos murinos. Este método permite analizar funciones gén esenciales in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353, R01 NS109655), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804), el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 y W81XWH-15-1-0193), y The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 y 2015-05-007).

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Los métodos detallados presentados aquí se desarrollaron utilizando un modelo GEM de MPNST. Sin embargo, si el tejido tumoral de interés se puede dispersar en células individuales, estas metodologías son fácilmente adaptables para varios tipos de tumores que surgen en los GEM. Es importante asegurarse de que el alelo floxed no resulte en i) disminución de la supervivencia que puede dificultar la obtención de suficientes ratones para detectar tumores, o ii) aumento de la latencia tumoral que puede dificultar la obtención ...

Antes de las últimas dos décadas, el tratamiento de los cánceres humanos se basaba en gran medida en la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos que se dirigían ampliamente a las poblaciones celulares que proliferaban rápidamente al dañar el ADN o inhibir la síntesis de ADN. Aunque estos enfoques inhibieron el crecimiento de células cancerosas, también tuvieron efectos secundarios perjudiciales en los tipos de células normales que proliferan rápidamente, como las células epiteliales intestinales y las células del folículo piloso. Más recientemente, la terapia contra el cáncer ha comenzado a utilizar agentes quimioterapéuticos que se dirigen con precisión a las proteínas dentro de las vías de señalización que son de importancia crítica para el crecimiento de la neoplasia de un paciente individual. Este enfoque, comúnmente conocido como "Medicina de Precisión", ha llevado al desarrollo de un repertorio cada vez mayor de anticuerpos monoclonales y pequeños inhibidores moleculares. Estos agentes inhiben eficazmente la proliferación y supervivencia de las células tumorales, al tiempo que evitan los efectos secundarios nocivos en los tipos de células normales observados con los agentes quimioterapéuticos convencionales y la radioterapia. Los anticuerpos monoclonales utilizados para el tratamiento de los cánceres humanos se dirigen con mayor frecuencia a las moléculas de la superficie celular, como los receptores del factor de crecimiento1 (por ejemplo, la gran familia de tirosina quinasas del receptor que abarca la membrana) y los moduladores de la respuesta inmune2 (por ejemplo, proteína de muerte celular programada 1, ligando de muerte programada 1). Los inhibidores moleculares pequeños pueden inhibir las proteínas de la superficie celular o las proteínas de señalización que se encuentran intracelularmente3. Sin embargo, para emplear eficazmente estos nuevos agentes terapéuticos, se debe establecer que un cáncer en particular depende de la molécula a la que se dirige un agente terapéutico candidato.
Aunque estos nuevos agentes terapéuticos tienen efectos más focalizados, muchos de ellos aún inhiben la acción de más de una proteína. Además, a menudo se dispone de múltiples agentes con eficacia y especificidad variables para atacar una proteína específica. En consecuencia, durante las investigaciones preclínicas, es aconsejable utilizar enfoques adicionales como la ablación genética para validar una proteína candidata como diana terapéutica. Un enfoque especialmente útil para validar una proteína como objetivo terapéutico es extirpar el gen que codifica la proteína candidata en un modelo animal genéticamente modificado que desarrolla el tipo específico de cáncer de interés. Este enfoque puede ser relativamente sencillo si los ratones con una mutación nula (ya sea una mutación natural, una mutación nula genéticamente modificada [un "knockout"] o una mutación nula introducida por una trampa genética) están disponibles, y los ratones son viables en la edad adulta. Desafortunadamente, los ratones con una mutación nula que cumplen con estos criterios a menudo no están disponibles, generalmente porque la mutación nula resulta en la muerte embrionariamente o en los primeros días de vida postnatal. En esta circunstancia, los ratones propensos a desarrollar el tipo de interés tumoral pueden cruzarse a ratones en los que los segmentos clave del gen de interés están flanqueados por sitios loxP ("floxed"), lo que permite que el gen se ablase mediante la introducción de un transgén que expresa Cre recombinasa en las células tumorales (un knockout condicional). Este enfoque proporciona varias ventajas. En primer lugar, si se dispone de un controlador de Cre que se expresa en el tumor pero no en el tipo de célula que condujo a la muerte en los knockouts convencionales, este enfoque puede validar potencialmente el objetivo terapéutico candidato. En segundo lugar, la ablación del gen que codifica la proteína candidata en las células tumorales, pero no en otros elementos intratumorales, como los fibroblastos asociados al tumor o las células inmunes, permite al investigador distinguir entre los efectos autónomos de las células y los efectos no autónomos de las células de la diana terapéutica. Finalmente, un controlador de Cre inducible por tamoxifeno (CreERT2) permite al investigador eliminar el gen de interés en diferentes etapas en el desarrollo del tumor y definir la ventana en la que el agente terapéutico candidato tiene más probabilidades de ser efectivo.
Desafortunadamente, también hay problemas técnicos que pueden limitar el uso de knockouts condicionales en tumores que surgen en modelos GEM. Por ejemplo, un controlador de Cre que se expresa en las células tumorales y evita la eliminación de genes en las células normales esenciales para la vida puede no estar disponible. Otro problema, que puede estar subestimado, es que los conductores cre y CreERT2 a menudo ablacionan de manera variable los alelos floxados en ratones, lo que resulta en mosaicismo para la mutación nula en un cáncer GEM. Cuando esto ocurre, las células tumorales en las que el gen objetivo no ha sido ablacionado continuarán proliferando rápidamente, sobrecreciendo las células tumorales con alelos ablacionados. El mosaicismo en las líneas conductoras de Cre puede ocurrir debido a la expresión no ubicua de Cre en el linaje objetivo y por recombinación fallida en células individuales independientes de la expresión de Cre4. Este es un fenómeno conocido de los controladores Cre que depende del tipo de célula y debe considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de datos. El mosaicismo puede enmascarar el efecto del knockout y llevar a un investigador a concluir erróneamente que el gen de interés no es esencial para la proliferación y / o supervivencia de las células tumorales y, por lo tanto, no es un objetivo terapéutico válido.
Varios de estos problemas se encontraron en un estudio previo que intentó determinar si el receptor tirosina quinasa erbB4 era un objetivo terapéutico potencial en las células MPNST5. En estos estudios, se utilizaron ratones que expresan un transgén que codifica la isoforma neuregulina-1 (NRG1) factor de crecimiento glial-β3 (GGFβ3) bajo el control del promotor cero de la proteína mielina específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3). Los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan múltiples neurofibromas plexiformes que progresan hasta convertirse en MPNST a través de un proceso que recapitula los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST plexiforme observados en pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante neurofibromatosis tipo 1 (NF1)6. Cuando se cruza a ratones con una mutación nula Trp53, el resultado P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- desarrollan MPNST de novo como se ve en cis-Nf1+/-; Trp53+/- ratones.
Estos MPNST recapitulan la progresión de las lesiones de grado II de la Organización Mundial de la Salud (OMS) a las lesiones de grado IV de la OMS observadas en humanos7. En ratones P 0-GGFβ3, los MPNST surgen dentro de neurofibromas plexiformes preexistentes en el nervio trigémino (58%) y las raíces nerviosas dorsales espinales (68%)7; los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- tienen una distribución muy similar. En los seres humanos, los MPNST surgen con mayor frecuencia en el nervio ciático seguido por el plexo braquial, las raíces nerviosas espinales, el vago, el femoral, la mediana, el plexo sacro, el obturador poplíteo y los nervios tibial y cubital posterior8. Esta distribución tumoral en estos modelos GEM es algo diferente de lo que se ve en humanos. Sin embargo, los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- son histológicamente idénticos a los MPNST humanos, portan muchas de las mismas mutaciones observadas en los MPNST humanos y recapitulan el proceso de progresión del neurofibroma-MPNST observado en pacientes con NF1. La generación de P 0-GGFβ3 o P0-GGFβ3; Los ratones Trp53+/- que eran Erbb4-/- no fueron factibles ya que los ratones con dos alelos nulos Erbb4 mueren en el útero en el día embrionario 10.5 secundario a defectos cardíacos9. Porque el rescate de la expresión de Erbb4 en el corazón mediante la introducción de un transgén Erbb4 específico del corazón (cadena pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) da como resultado ratones Erbb4-/- viables10, la generación de ratones con un complicado P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Se intentó el genotipo Erbb4-/-.
Sin embargo, los apareamientos no produjeron ratones en las proporciones mendelianas esperadas, lo que indica que el genotipo deseado era perjudicial. Por lo tanto, la generación de P 0-GGFβ3; Se intentaron ratones Trp53+/- con alelos 11 Erbb4 floxed y un controlador CreERT2 para permitir la eliminación de Erbb4 en los MPNST que surgen en estos ratones. En estos animales, numerosas células tumorales con alelos Erbb4 intactos todavía estaban presentes (mosaicismo). El mosaicismo observado podría ser el resultado de una administración ineficiente de tamoxifeno, lo que resultó en diferencias en la eficiencia de recombinación dentro del tejido. La posibilidad de mecanismos compensatorios espontáneos podría contribuir aún más al mosaicismo en la recombinación mediada por tamoxifeno al eludir el requisito de expresión de Erbb4. Es factible que la pérdida de Trp53 haga que las células tumorales sean susceptibles a mutaciones "permisivas" espontáneas adicionales que podrían confundir la interpretación de los datos. Como parecía probable que las células MPNST intactas de Erbb4 enmascararan las consecuencias de la ablación de Erbb4 en otras células tumorales, este enfoque fue abandonado.
Estos obstáculos condujeron al desarrollo de una metodología para la ablación de Erbb4 en células MPNST de paso muy temprano utilizando un adenovirus que expresa Cre recombinasa y eGFP. Estas células se pueden separar de las células no infectadas utilizando FACS, lo que reduce notablemente el mosaicismo para el gen Erbb4 ablacionado. A continuación, se describen los métodos utilizados para lograrlo, junto con los métodos utilizados para evaluar los efectos de la ablación génica in vitro e in vivo. El siguiente protocolo es un ejemplo de cómo producir ratones portadores de tumores que producen tumores portadores de alelos floxados de genes letales embrionarios de interés para la escisión ex vivo antes de la evaluación del crecimiento tumoral de aloinjerto in vivo . Esto incluye una descripción de los enfoques utilizados para analizar el efecto que la ablación de Erbb4 ejerce sobre la proliferación de células tumorales, la supervivencia y la expresión génica in vitro y la proliferación, supervivencia y angiogénesis en aloinjertos ortotópicos.

<table><tbody><tr><td>Ad5CMV-eGFP</td><td>Núcleo de vector de transferencia de genes, Universidad de Iowa</td><td>VVC-U de Iowa-4</td><td></td></tr><tr><td>Ad5CMVCre-eGFP</td><td>Núcleo de vector de transferencia de genes, Universidad de Iowa</td><td>VVC-U de Iowa-1174</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 anticuerpo secundario</td><td>Thermo/Fisher</td><td>GaR A11036</td><td></td></tr><tr><td>Bioconductor Software de código abierto para bioinformática</td><td>Bioconductor</td><td>http://www.bioconductor.org</td><td>Herramienta de análisis estadístico alternativa utilizada para el paso 4.4</td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Celigo Citómetro de imagen</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cell</td><td>Stripper Corning</td><td>25-056-Cl</td><td>mezcla de quelantes kit de</td></tr><tr><td>tinción DAB</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7800</td><td></td></tr><tr><td>DAVID (Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado)</td><td>DAVID</td><td>https://david.ncifcrf.gov</td><td>software de análisis de enriquecimiento funcional utilizado para el paso 4.5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq y Buffer (Genotyping PCR)</td><td>Thermo/Fisher</td><td>EP0701 y K1072</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos erbB4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-284</td><td></td></tr><tr><td>erbB4</td><td>anticuerpos Abcam</td><td>ab35374</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 anticuerpos</td><td>Millipore</td><td>HFR1: 05-1133</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GenomeSpace Herramientas y fuentes de datos</td><td>GenomeSpace</td><td>https://genomespace.org/support/tools/</td> <td>recurso general para varios tipos de herramientas bioinformáticas de código abierto para el paso 4.5</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005- </td><td></td>Cl</tr><tr><td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizLizAtion tool</td><td>Gorilla</td><td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td><td>software de análisis de enriquecimiento funcional utilizado para el paso 4.5</td></tr><tr><td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td><td>Broad Institute</td><td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp software de</td><td>análisis de enriquecimiento funcional utilizado para el paso 4.5</td></tr><tr><td>HSD: Ratones Athymic Nude-FOxn1nu</td><td>Envigo (anteriormente Harlan Labs)</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 (secuenciador de ADN de próxima generación)</td><td>Secuenciador de ADN Illumina</td><td>Hi Seq 2500</td><td>utilizado para el paso 4.2</td></tr><tr><td>Lasergene: Expresión génica ArrayStar y análisis de variantes</td><td>DNAStar Software LaserGene</td><td>N/A</td> software de <td>análisis estadístico y de normalización utilizado para el paso 4.4</td></tr><tr><td>Lasergene: Ensamblaje de alineación de secuencias SeqMan NGen</td><td>Alineación de software utilizada para el paso 4.3</td> Alineación de software N<td>/A</td><td>utilizada para el paso 4.3</td></tr><tr><td>Matrigel, matriz de membrana basal de bajo factor de crecimiento</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NRG1-beta</td><td></td><td>Internamente Generado por SLC, también disponible comercialmente en R & D Sistemas (396-HB-050/CF).</td><td></td></tr><tr><td>Tinción nuclear Hoeschst 33342</td><td>Thermo</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de clasificación de ontologías genéticas</td> de <td>Panther Software</td><td>de análisis de enriquecimiento funcional http://pantherdb.org utilizado para el paso 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Partek (alineador y analizador BWA)</td><td>Partek, Ver 7</td><td>N/A</td><td>alineación de software y estadística/normalización utilizada para el paso 4.3</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-CL</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación 1: 5&prime;-CAAATGCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTGT GTCTG- 3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 producto nulo y un 350&thinsp; producto bp Floxed ErbB4;</td><td></td></tr><tr><td>Primer 2: 5&prime;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 producto nulo y un 350&thinsp; producto bp Floxed ErbB4;</td><td></td></tr><tr><td> Primer 3: 5&prime;-TATTGTGTTCATCTCTATCATTGCA ACCCAG-3&prime; </td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 3: 350&thinsp; producto ErbB4 de tipo salvaje.</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodo</td><td>Fisher</td><td>51-351-0</td><td></td></tr><tr><td>Perfilador de proteoma Matrices de fosfoquinasa</td><td>R& D Systems</td><td>ARY003B</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de viabilidad celular bioluminiscente</td><td>Glo Promega</td><td>G9712</td> en<td>tiempo real</td></tr><tr><td>ToppGene Suite</td><td>ToppGene</td><td>https://toppgene.cchmc.org</td><td>software de análisis de enriquecimiento funcional utilizado para el paso 4.5</td></tr><tr><td>Trizol (reactivo basado en ácido-cuanidinio-fenol y cloroformo)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Kit de amplificación de señal de tiramida</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL721001EA</td><td></td></tr></tbody></table>

definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

El desarrollo de nuevos fármacos que se dirigen con precisión a proteínas clave en los cánceres humanos está alterando fundamentalmente la terapéutica del cáncer. Sin embargo, antes de que estos medicamentos puedan ser utilizados, sus proteínas diana deben ser validadas como dianas terapéuticas en tipos específicos de cáncer. Esta validación a menudo se realiza eliminando el gen que codifica el objetivo terapéutico candidato en un modelo de cáncer de ratón genéticamente modificado (GEM) y determinando qué efecto tiene esto en el crecimiento del tumor. Desafortunadamente, los problemas técnicos como la letalidad embrionaria en los knockouts convencionales y el mosaicismo en los knockouts condicionales a menudo limitan este enfoque. Para superar estas limitaciones, se desarrolló un enfoque para ablacionar un gen letal embrionario floxed de interés en cultivos a corto plazo de tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) generados en un modelo GEM.
Este artículo describe cómo establecer un modelo de ratón con el genotipo apropiado, derivar cultivos tumorales a corto plazo de estos animales y luego extirpar el gen letal embrionario floxed utilizando un vector adenoviral que expresa Cre recombinasa y proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). A continuación, se detalla la purificación de las células transducidas con adenovirus mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la cuantificación de los efectos que la ablación génica ejerce sobre la proliferación celular, la viabilidad, el transcriptoma y el crecimiento del aloinjerto ortotópico. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz y generalizable para identificar y validar dianas terapéuticas in vitro e in vivo. Estos enfoques también proporcionan una fuente renovable de células derivadas de tumores de bajo paso con artefactos de crecimiento in vitro reducidos. Esto permite estudiar el papel biológico del gen objetivo en diversos procesos biológicos como la migración, la invasión, la metástasis y la comunicación intercelular mediada por el secretoma.

La Figura 4 ilustra un resultado típico obtenido al transducir P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Células MPNST Erbb4fl/fl con el adenovirus Ad5CMV-eGFP o el adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Los cultivos se observan con microscopía de fluorescencia para identificar células que expresan eGFP y mediante microscopía de contraste de fase para determinar el número total de células presentes en el mismo campo a 10x (arriba) ...

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Este protocolo proporciona un método alternativo in vivo para estudiar el papel de crecimiento tumoral de un knockout de genes letal embrionario. La ventaja de este método es que los knockouts de genes que normalmente son letales embrionarios se pueden realizar en tumores derivados de un modelo de ratón genéticamente modificado para estudiar sus efectos de pérdida de función in vivo. Esta técnica se puede aplicar a enfermedades que requieren estudiar el papel in vivo de genes esenciales embrionarios inalcanzables de los modelos tradicionales de ratones knockout de genes.La generación del modelo animal lleva tiempo y se requieren pruebas empíricas para determinar el MOI óptimo para la infección adenoviral para garantizar que se logre la recombinación adecuada. Para empezar, identifique el ratón con el genotipo deseado. Cuando un ratón portador de tumor alcanza su punto final humanitario, eutanasia al ratón y use un cuchillo de bisturí estéril para extirpar el tumor.Diseccionar el tumor en tres secciones en cortes estilo pan de pan usando un cuchillo de bisturí para generar los segmentos de tejido para la fijación de formalina parafina incrustando la generación temprana de cultivos d

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Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.

Inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epitelio

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

Hemos desarrollado una metodología para evaluar si las neoplasias del sistema nervioso en ratones modificados genéticamente recapitulan con precisión la patología de sus homólogos humanos. Aquí, aplicamos estas técnicas histológicas, criterios patológicos definidos y metodologías de cultivo a neurofibromas y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos que surgen en el modelo de ratón P 0-GGFβ3.

Identificación, diagnóstico y clasificación de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos en modelos de ratón modificados genéticamente

La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) conduce a tumores benignos de la vaina de los nervios periféricos (neurofibromas) que requieren un microambiente nervioso específico para su crecimiento. Se desarrolló un modelo de xenoinjerto ortotópico optimizado, utilizando la inyección intraneural de células de Schwann humanas en ratones NSG. Este modelo recapitula los neurofibromas humanos y proporciona una plataforma valiosa para evaluar estrategias terapéuticas.

Un xenoinjerto ortotópico del nervio ciático para neurofibromatosis tipo 1 Neurofibromas

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Este protocolo describe un método de imagen residente tumor-infiltración T CD8 células con anticuerpos fluorescente acoplados dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la migración de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

Resonancia paramagnética electrónica de bajo campo (banda L, 1.2 GHz) usando puntas de prueba nitroxyl y trityl soluble se demuestra para la evaluación de parámetros fisiológicamente importantes en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama.

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Aprende a estudiar genes letales embrionarios en tumores malignos de la vaina del nervio periférico mediante ablación ex vivo con adenovirus Cre en modelos murinos. Este método permite analizar funciones gén esenciales in vivo.

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