Name: Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprende a producir lisados bacterianos de alta calidad para expresión génica sin células usando una cepa de Escherichia coli con autólisis programada. Este método accesible facilita la investigación en biología sintética.

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Los autores agradecen a Zachary Sun y Richard Murray (Instituto de Tecnología de California) por proporcionar amablemente el plásmido P_araBAD-gamS, y a Kaeko Kamei (Instituto de Tecnología de Kyoto) por proporcionar amablemente una centrífuga de enfriamiento de alta velocidad. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y del programa ARO MURI y fue apoyado en parte por la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes, MEXT, Japón.

1. Prepare medios y búferes.
<ol><li>Preparar el medio 2xYTPG.<ol>
<li>Mezcle 62 g de polvo de 2xYT, 5,99 g de fosfato de potasio monobásico, 13,93 g de fosfato de potasio dibásico y agua desionizada a 2 L.</li>
		<li>Autoclave en ciclo líquido con un tiempo de exposición de 30 min14.</li>
		<li>A 400 ml de medios 2xYTP de 1.1.2, agregue 7.2 g de D-glucosa (dextrosa) y mezcle hasta que se disuelva.</li>
		<li>Filtro-esterilizar a través de un filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el búfer de S30A.<ol>
<li>Mezcle Tris-HCl (pH 7.7, concentración final de 50 mM), glutamato de potasio (60 mM final) y glutamato de magnesio (14 mM final).</li>
		<li>Ajuste el pH a 7,7 usando 10 M KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la Solución 1 (consulte la Tabla 1).<ol>
<li>Resuspend ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinatanosulfónico (HEPES) en 2 ml de agua.</li>
		<li>Ajuste el pH a 8.0 usando KOH.</li>
		<li>Agregue todos los demás componentes de la Tabla 1.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.6 usando 10 M KOH. Filtro-esterilización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de premezcla 2.5x (ver Tabla 2).<ol>
<li>Mezclar todos los componentes de la Tabla 2.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.5 usando KOH.</li>
		<li>Alícuota y congelación a -80 °C. NOTA: Una reacción de 20 μL utiliza 8,9 μL de premezcla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparar las celdas.
<ol><li>Rayar las células autolisadas en placas de agar LB que contienen 50 μg/ml de ampicilina utilizando un bucle inocular y crecer a 37 °C (ver Nota 1).</li>
	<li>Elija una sola colonia en un cultivo iniciador de LB / medio de ampicilina usando una punta de pipeta y crezca a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Inocular 400 mL de medio 2xYTPG que contenga 50 μg/ml de ampicilina con 400 μL de cultivo iniciador, y crecer a 37 °C en un matraz Erlenmeyer de 1 L, agitando a 300 rpm.</li>
	<li>Mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD600)utilizando un espectrofotómetro para leer una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de 1 cm. Cuando el OD600 exceda 1, comience a diluir el cultivo 5 veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico. Continuar cultivando las células hasta que el cultivo diluido de 5 veces alcance OD600 de 0.3 (correspondiente a un cultivo OD600 de 1.5).</li>
</ol>3. Preparar el lisado.
<ol><li>Prepare el tampón S30A suplementado con ditiotreitol (TDT) de 2 mM. Mezclar 3 ml de tampón S30A con 6 μL de solución madre de TDT a 1 M. Colocar sobre hielo para su uso en el paso 3.7.</li>
	<li>Cosechar las células centrifugando a 1800 × g durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante vertiéndolo y usando una pipeta para eliminar cualquier líquido restante.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 45 ml de tampón S30A frío (4-10 °C) utilizando un mezclador de vórtice.</li>
	<li>Pese un tubo centrífugo vacío de 50 ml, transfiera las células a él y repita los pasos 3.2-3.3 para lavar las células.</li>
	<li>Pesar el pellet, restando el peso de un tubo vacío de 50 mL. Asegúrese de aspirar cuidadosamente cualquier sobrenadante restante para garantizar una medición precisa del peso del pellet. NOTA: Un rendimiento típico es de ~ 1.3 g de pellet celular de 400 ml de cultivo de producción.</li>
	<li>Agregue 2 volúmenes de tampón S30A frío suplementado con 2 mM de ditiotreitol, es decir, 2 ml de tampón por cada 1 g de gránulo celular, y resuspenda las células mediante una mezcla vigorosa de vórtice.</li>
	<li>Congelar las células. Coloque el tubo de 50 ml que contiene las células en un congelador de -20 °C o -80 °C hasta que el pellet esté completamente congelado. NOTA: El paso de congelación es un buen punto de parada para el día.</li>
	<li>Descongele las celdas en un baño de agua a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vórtice vigorosamente durante 2-3 min.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 45 min con agitación a 300 rpm.</li>
	<li>Limpie la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30.000 × g durante 45 min a 4 °C. NOTA: Si no se dispone de una centrífuga capaz de 30.000 x g, centrífuga durante 45 min a 21.000 × gy tenga precaución adicional en el paso 3.13, ya que el pellet será menos compacto.</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, evitando molestar el pellet tanto como sea posible. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita el paso anterior.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrífuga una vez más a 21.000 × g (o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa) durante 5 minutos.</li>
	<li>Alicuar el autolisado desaclarado en los volúmenes deseados, evitando cuidadosamente cualquier pellet restante, y congelar a -80 ° C o usar inmediatamente. NOTA: Una sola reacción de 20 μL utiliza 8 μL de autolisato.</li>
</ol>4. Expresión génica libre de células
NOTA: El autolisado ya está listo para cualquier uso final deseado. El siguiente es un ejemplo de protocolo estándar para la expresión génica libre de células.
<ol><li>Para una reacción de 20 μL, mezclar sobre hielo 8 μL de autolizado y 8,9 μL de premezcla. Ver NOTA al final de la sección de protocolo con respecto a la optimización de las concentraciones de glutamato de magnesio y PEG 8000.</li>
	<li>Añadir ADN (por ejemplo, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentración final de 8 nM), cualquier otro reactivo y agua a 20 μL.</li>
	<li>Coloque la reacción en una microplaca de 384 pocillos y mida el curso del tiempo de fluorescencia y / o los puntos finales utilizando un lector de placas. Para la proteína verde fluorescente (GFP), utilice una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.</li>
</ol>5. Modificaciones del protocolo
Nota : las siguientes modificaciones del protocolo le permiten servir a otras aplicaciones.
<ol><li>Expresión génica libre de células utilizando plantillas lineales de ADN<ol>
<li>Realice los pasos de la sección 4, complementando la reacción con 2,2 μM de proteína GamS purificada (expresada y purificada como se describe12)antes de la adición del ADN lineal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expresión génica libre de células que incorpora degradación de proteínas<ol>
<li>En el paso 2.1, utilice células autolizadas que contengan el plásmido pACYC-FLAG-dN6-His (consulte la Tabla de materiales). En todos los medios de crecimiento, además, se incluyen 34 μg/ml de cloranfenicol.</li>
		<li>En el paso 2.3, incluir 40 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el medio de crecimiento para inducir la expresión del plásmido.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2-3.4 (lavado) dos veces adicionales (para un total de tres lavados) para garantizar la eliminación completa del cloranfenicol, que es un inhibidor de la traducción. Para los dos primeros lavados (paso 3.4), sustituya el tampón S30A por solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4).</li>
		<li>En el paso 4.2, complemente con un ATP adicional de 3 mM (agregado de una solución madre de 100 mM ATP en agua, pH 7.2) y 4.5 mM de glutamato de magnesio (utilizando una solución madre de 1 M en agua) (concentraciones finales) para compensar el alto uso de ATP por ClpXP, así como la quelación de magnesio por el ATP adicional.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expresión génica libre de células utilizando lecturas basadas en LacZ (incluyendo colorimétricas)<ol>
<li>En el paso 2.1, utilice celdas de autolisado que no expresen LacZ de forma nativa (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, prepare el lisado directamente de las células liofilizadas.<ol>
<li>Realice todos los pasos de 1.1 a 3.7.</li>
		<li>Mezclar 8 μL de suspensión celular con 8,9 μL de premezcla.</li>
		<li>Agregue ADN plásmido (si lo desea), otros reactivos personalizados y agua para alcanzar un volumen final de 20 μL.</li>
		<li>Transfiera la reacción a una microplaca de 384 pocillos y séquela con liofilización. NOTA: Las muestras liofilizadas se pueden almacenar hasta por una semana y posiblemente más.</li>
		<li>Para comenzar la reacción, rehidrate con 18 μL de agua desionizada suplementada con cualquier ADN deseado u otros reactivos.</li>
		<li>Siga la dinámica de fluorescencia en un lector de placas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>NOTA 1: Las células de autolisado están diseñadas para lisarse en un ciclo de congelación-descongelación, por lo que es particularmente importante usar crioprotector al hacer existencias congeladas. Congelamos las existencias en un 24% en peso/vol de glicerol y las almacenamos a -80 °C.
NOTA 2: Los iones de magnesio y PEG 8000 son críticos para el rendimiento del lisado. La premezcla base 2.5x, basada en datos publicados anteriormente, contiene 6 mM de glutamato de magnesio y 4.8% en peso / vol PEG 8000, que se convierten en 2.4 mM y 1.9%, respectivamente, en la reacción final. El autolizado preparado con el protocolo aquí generalmente funciona mejor con un Mg-glutamato adicional de 5 mM y 1.5% PEG 8000 en la reacción final. Sin embargo, esto se puede optimizar en el rango de un glutamato adicional de 0-10 mM Mg y un 0-3% adicional de PEG 8000 (en comparación con la premezcla base). Para preparar la premezcla con los 5 mM Mg-glutamato adicionales recomendados y 1,5% PEG 8000 (concentraciones finales), mezcle 380 μL de premezcla con 4,75 μL de glutamato de magnesio a 1 M y 36,1 μL de PEG 8000 al 40% de peso/volumen.

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
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</ol>

J.H. es cofundador de GenCirq Inc, que se centra en la terapéutica del cáncer. Está en el Consejo de Administración y tiene participación en GenCirq.

El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efectivamente, el ...

La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores5,6 hasta la rápida creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos7,8 y el desarrollo de células artificiales9. La mayoría de la expresión génica libre de células utiliza lisados celulares que han sido altamente procesados, generalmente requieren protocolos largos y complejos, equipos especializados y / o pasos sensibles que pueden conducir a una variación significativa entre los usuarios y los lotes10,11.
Este documento describe un método simple y eficiente para producir lisado libre de células que requiere un procesamiento y experiencia mínimos(Figura 1A)12. El método se basa en células de E. coli que están diseñadas para lisarse después de un simple ciclo de congelación-descongelación. Las células expresan una endolisina del fago lambda que degrada la pared celular. A medida que las células crecen, esta endolisina permanece en el citoplasma, secuestrada de la pared celular. Sin embargo, un simple ciclo de congelación-descongelación interrumpe la membrana citoplasmática, liberando la endolisina en el periplasma, donde degrada la pared celular, lo que resulta en una rápida lisis celular. El protocolo se puede completar con solo unas pocas horas de trabajo práctico y solo requiere un congelador, una centrífuga capaz de 30,000 × g (para obtener resultados óptimos; se pueden usar velocidades más bajas con más cuidado para no molestar el pellet), un mezclador de vórtice y una solución tampón simple. El lisado funcional puede incluso producirse mediante la liofilización de las células y su rehidratación in situ. Sin embargo, este método produce lisados con menor actividad, presumiblemente debido a los restos celulares restantes.
Los lisados son altamente activos para la expresión génica libre de células, y se pueden mejorar de varias maneras dependiendo del uso final. La tasa de síntesis de proteínas se puede aumentar aún más concentrando el lisado utilizando concentradores de espín estándar. El ADN lineal se puede proteger de la degradación mediante la adición de proteína GamS purificada. La degradación de proteínas, necesaria para una dinámica de circuitos más compleja como la oscilación, se puede lograr coexpresando un hexámero ClpX en la cepa productora de autolisato13. Finalmente, las lecturas visuales basadas en LacZ se habilitan mediante el uso de una tensión de autolisado que carece de lacZ. En general, este método produce lisado libre de células altamente activo que es adecuado para una amplia gama de aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>2xYT medios</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>o unidad de</td></tr><tr><td>filtro centrífugo Amicon Ultra-15 equivalente, corte de 3 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>opcional, se puede utilizar para concentrar lisado, seleccione la capacidad del concentrador adecuada para el volumen a concentrar</td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>o carbenicilina, una variante más estable</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente D-glucosa (dextrosa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>o equivalente</td></tr>, <tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>o</td></tr><tr><td>E. coli equivalente BL21-Gold (DE3) portador de pAD-LyseR</td>, <td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr>, <tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) y Delta; lacZ portador de pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>o medios LB equivalentes</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific DF0446075</td><td></td><td>o</td></tr><tr><td>glutamato</td> <td>de magnesio equivalenteSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente glutamato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>para ajustar el pH</td></tr><tr><td>fosfato de potasio dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>o mezcla de</td></tr><tr><td>ARNt</td> equivalente <td>Roche</td><td>10109541001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>UTP</td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>o equivalente</td></tr></tbody></table>

producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.

Los resultados representativos se pueden observar mediante el uso de autolisado para expresar GFP a partir de un plásmido que expresa constitutivamente, aquí pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, y registrando un curso de tiempo de fluorescencia de GFP en un lector de placas (Figura 1B). Una serie de dilución de ADN plásmido encontró una fuerte expresión incluso a 1 nM de ADN. En comparación con un lisado disponible comercialmente, el autolisato puede producir un mayor rendimiento total y lograr...

Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.

Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Usando este protocolo, los lisados celulares bacterianos de alta calidad se pueden producir utilizando solo equipos de laboratorio comunes ampliamente disponibles, lo que hace que la expresión génica libre de células sea fácilmente accesible para la mayoría de los investigadores. La combinación de la autólisis celular del programa con un ciclo de congelación-descongelación o liofilización permite crear un enfoque práctico, laboral y rentable para la producción rápida de lisados bacterianos para la expresión génica libre de células. Comience usando un asa de inoculación para rayar las células de una cepa de E. coli de autólisis en placas de agar LB que contienen 50 microgramos por mililitro de ampicilina, luego incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, usando una punta de pipeta, recoja una sola colonia de la placa de agar y agréguela a un tubo de cultivo que contenga medio LB con ampicilina. Cultive este cultivo iniciador a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue 400 microlitros del cultivo iniciador en un matraz Erlenmeyer de un litro que contenga 400 mililitros de medio 2xYTPG complementado con 50 microgramos por mililitro de ampicilina.Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a 300 RPM. Utilizando un espectrofotómetro y una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de un centímetro, mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Cuando la densidad óptica exceda una, comience a diluir el cultivo cinco veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico.Una vez que la densidad óptica del cultivo diluido quíntuple alcance 0.3, retire el matraz de la incubadora y proceda a preparar el lisado. Para preparar el lisado, cosecha las células por centrifugación a 1, 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante y retire el líquido restante con una pipeta.Agregue 45 mililitros de tampón frío S30A al pellet y vuelva a suspender el pellet mediante vórtice. Luego, pese un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros antes de transferir las células al tubo. Centrifuga las células de nuevo y descarta el sobrenadante.Aspire cualquier sobrenadante restante usando una pipeta. Pesar el tubo de nuevo y restar el peso del tubo vacío del peso mostrado para obtener el peso del pellet. Por cada miligramo de pellet celular, agregue dos microlitros de tampón frío S30A complementado con dos ditiotreitol milimolar.Luego, resuspende las células mediante vórtice vigoroso. A continuación, congele las células colocándolas en un congelador negativo de 20 o 80 grados centígrados negativos hasta que el pellet esté completamente congelado, luego descongele las células en un baño de agua a temperatura ambiente y vórtice vigorosamente durante dos o tres minutos. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 45 minutos con agitación a 300 RPM, luego limpiar la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30, 000 x g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius.Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita la centrifugación. Transfiera el sobrenadante a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.Y centrifugar una vez más a 21, 000 x g o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa durante cinco minutos. Aliquote el autolisado despejado en los volúmenes deseados y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para la expresión génica libre de células utilizando el autolizado, mezcle ocho microlitros de autolizado y 8,9 microlitros de premezclado en hielo.Añadir ADN a una concentración final de ocho nanomoles, cualquier otro reactivo necesario y agua para obtener un volumen final de 20 microlitros. Agregue la reacción a una microplaca de 384 pocillos y use un lector de placas para medir el curso del tiempo de fluorescencia y los puntos finales. La expresión de GFP utilizando el autolizado con una serie de dilución de ADN plasmático da como resultado una expresión fuerte incluso con un ADN nanomolar.Al comparar la expresión GFP entre un lisado disponible comercialmente y el autolizado, el autolisato produjo niveles comparables de GFP. La variabilidad entre los lotes de lisado producidos en dos laboratorios diferentes por diferentes investigadores fue de aproximadamente dos veces. Las tres variables más críticas son la relación de pellet celular a tampón, la transferencia de sobrenadante libre de escombros y el uso de una concentración óptima de PEG y magnesio en la reacción final.Una vez que se ha preparado el extracto, se puede utilizar un gran arsenal de protocolos existentes desarrollados para los sistemas de expresión libre de células de E. coli, como la degradación mediada por ClpXP o la detección de quórum mediada por AHL.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

Fuente: Wiegand, D. J., et al. Expresión de proteínas libres de células utilizando la bacteria de rápido crecimiento Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra el uso de un sistema de expresión de proteínas libres de células bacterianas basado en lisado crudo de Vibrio natriegens para realizar transcripción y traducción in vitro acopladas. Destaca la preparación de una mezcla maestra con componentes esenciales y la síntesis paso a paso de proteínas funcionales a partir de una...

Expresión de proteínas libres de células utilizando un extracto celular crudo bacteriano

Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Sistemas de expresión libre son herramientas poderosas y costo-eficiente para la síntesis de alto rendimiento y detección de proteínas importantes. Aquí, describimos la preparación del sistema de expresión de proteínas libres de células con Vibrio natriegens para la producción de la proteína rápida usando la DNA del plasmid DNA linear y plantilla del mRNA.

Sin células proteína expresión usando el crecimiento rápido de bacteria Vibrio natriegens

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Presentamos un método rápido y rentable para producir el sistema TX-TL recombinante PURE libre de células utilizando equipos de laboratorio estándar.

Sistema OnePot PURE Cell-Free

El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.

Métodos rápidos y enzimáticos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células

Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

El extracto traslacional de Leishmania (LTE) es un sistema de expresión de proteínas eucariotas libres de células derivado del parásito unicelular, Leishmania tarentolae. Este protocolo optimizado hace que la fabricación de LTE sea sencilla y rentable. Es adecuado para diversas aplicaciones centradas en la expresión y el estudio multiparalelo de proteínas eucariotas complejas y sus interacciones.

Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Presentamos un protocolo actualizado para la producción del sistema OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) y ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células, centrándonos en el control del crecimiento celular para minimizar las variaciones de lote a lote.

Refinamiento de OnePot PURE y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles

Aprende a producir lisados bacterianos de alta calidad para expresión génica sin células usando una cepa de Escherichia coli con autólisis programada. Este método accesible facilita la investigación en biología sintética.

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