Desarrollo de una tira inmunocromatográfica de flujo lateral para la detección rápida y cuantitativa de compuestos de moléculas pequeñas

El procedimiento describe la preparación de oro coloidal y el ensamblaje de las tiras inmunocromatográficas. En primer lugar, se utilizaron ácido cloroáurico y citrato de sodio para la síntesis de oro coloidal. Se agregó citrato de sodio a la solución de ácido cloroáurico y se hirvió para obtener oro coloidal con el tamaño de partícula apropiado.

Síntesis, el anticuerpo de oro coloidal conjugado. Después de la centrifugación, las partículas de oro coloidal se disolvieron en una solución adecuada y luego se resuspendieron para obtener una solución de oro coloidal. Sumerja la membrana de fibra de vidrio en la conjugación para preparar la almohadilla conjugada.

Deje caer el antígeno artificial y los anticuerpos secundarios en la membrana NC como línea T y línea C. Conecte la membrana NC, la membrana absorbente, la almohadilla de muestra y la membrana de fibra de vidrio en la placa de PVC, respectivamente. Corte el cartón ensamblado en una tira de 3,5 milímetros de ancho.

Confectar solución de ácido de cloruro de oro al por ciento completo y solución de citrato de sodio al 1%, respectivamente. Encienda el agitador magnético y coloque el matraz en una batidora. Agregue 120 mililitros de agua destilada en un matraz de fondo redondo y caliéntela hasta que hierva en un agitador magnético termostático.

Siga hirviendo y agregue rápidamente 0.5 mililitros de ácido cloroáurico al por ciento completo y cinco mililitros de citrato de sodio al 1%. Continúe calentando durante cinco a 10 minutos. Observe el color de la solución cambiando de amarillo pálido a rojo vino.

Apague la alimentación del mezclador magnético termostático, enfríe a temperatura ambiente y coloque la mezcla en una botella limpia. Almacenar a cuatro grados centígrados. Las nanopartículas de oro muestran el efecto Tyndall.

El tamaño y la morfología de las nanopartículas de oro se determinaron mediante espectroscopia ultravioleta y la imagen del microscopio electrónico de transmisión. Agregue 100 microlitros de solución de cloruro de sodio a ocho tubos. Ajuste las soluciones de oro coloidal a pH 5 a 12 usando 0.1 mol por litro de carbonato de potasio.

Agregue 100 microlitros de solución de oro coloidal a ocho tubos que contengan cloruro de sodio. Despídase por poste varios minutos después de la mezcla. Observe el cambio de color de cada solución de tubo y registre el tubo que permanece rojo.

Elija el valor de pH con la menor cantidad de carbonato de potasio agregado y un color de solución estable como el valor de pH óptimo para preparar el conjugado. Adaptó el mismo enfoque. Observó el cambio de color y registró el tubo que permanece rojo.

Elija la cantidad de anticuerpos con la concentración más baja de mAB y un color de solución estable como la cantidad óptima de mAB. Tome una solución de oro coloidal de 10 mililitros y use 0.1 mol por litro de carbonato de potasio para ajustar la solución al valor óptimo de pH. Agregue lentamente los mAB SSd con la concentración adecuada y agite a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Centrifugar la mezcla a 2000 RPM durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el precipitado que contiene impurezas del oro coloidal precipitado. Centrifugar la mezcla a 10, 000 RPM durante 40 minutos.

Deseche el sobrenadante. El precipitado es conjugado mAB de oro coloidal. Agregue ácido clorhídrico Tris, BSA, Tween 20 y PEG 20, 000, luego mezcle bien para preparar el tampón de resuspensión.

Añadir el tampón de resuspensión y disociar el precipitado. La tira de material de membrana, incluida la membrana de celulosa de vidrio, la membrana de celulosa de poliéster y la placa de PVC. El material de la membrana, necesita rastrear y evaluar por microscopio estéril para deshacerse de la inhomogeneidad.

Primero, coloque la membrana NC en la placa de PVC a dos centímetros del borde del extremo de la sección de la placa. En segundo lugar, deje caer dos miligramos por mililitro SSd-BSA en la membrana NC a dos centímetros del borde superior como línea de prueba y deje caer 1,5 miligramos por mililitro de oro anti-ratón IgG en la membrana NC a dos centímetros del borde inferior como línea de control. Conecte la almohadilla absorbente a la lámina de PVC por encima de la membrana NC y superponga con la membrana NC en dos milímetros.

Recorte la membrana de fibra de vidrio a cinco centímetros de largo y dos centímetros de ancho y úselo como almohadilla conjugada. Sumergir la membrana de fibra de vidrio en la solución conjugada mAB de nanopartículas de oro. Remoje durante un rato para hacer la absorción de mAB de nanopartículas de oro.

Seque la membrana ancha en la incubadora a 37 grados. Pegue la almohadilla conjugada pretratada debajo de la membrana NC y la longitud superpuesta con la membrana NC debe ser de 0,1 centímetros. Recorte la membrana Fusion3 en 1,8 centímetros de largo y 3,5 centímetros de ancho y úselo como almohadilla de muestra.

Luego, coloque la almohadilla de muestra en la placa de PVC y superponga con la almohadilla conjugada en dos milímetros. Corte, ensamble el cartón en tiras de 3,5 milímetros de ancho con una máquina de corte y compacte utilizando un sistema de laminación por lotes. Finalmente, coloque las tiras reactivas en la carcasa.

Sellarlos en una bolsa de papel de aluminio que contenga desecante y almacenarlos lejos de la luz. El ICS ya está montado. Deje caer 50 microlitros de solución de muestra sobre el orificio de muestra para observar el proceso de cromatografía.

A continuación, analice las tiras utilizando un lector de tiras portátil. La máquina puede proporcionar la relación entre la línea de prueba y la línea de control. Evalúe la especificidad, sensibilidad, repetibilidad y estabilidad de la prueba ICS.

Se leyeron las soluciones de oro coloidal preparadas. Los análisis del microscopio electrónico de transmisión revelaron que las partículas tenían forma poliédrica y se distribuyeron uniformemente con un diámetro promedio de 14 nanómetros. Las imágenes del microscopio electrónico de transmisión de alta resolución mostraron un patrón de franjas continuas con un espaciado de 0,117 nanómetros de nanopartículas de oro.

La absorción visible ultravioleta indicó que se pueden obtener diferentes tamaños de partículas de oro coloidal cambiando la proporción de citrato sódico y ácido cloroáurico. En el experimento cuantitativo, las tiras con los resultados de la prueba de saikosaponina D se escanearon utilizando un lector ICS portátil. Se calculó una curva estándar relacionando las no concentraciones de saikosaponina D con la absorción correspondiente en cada concentración.

Después de la investigación metodológica, el método se puede aplicar para la detección cuantitativa y semicuantrativa de compuestos de moléculas pequeñas. Este procedimiento incluye la preparación de oro coloidal, la síntesis de nanopartículas de oro mAB conjugadas, el montaje de la tira y la investigación metodológica. Este trabajo proporciona un protocolo detallado para el desarrollo de tiras inmunocromatográficas para su uso en la detección rápida y cuantitativa de moléculas pequeñas.

Después de ver este video espero que tenga una buena comprensión para la preparación de la tira inmunocromatográfica. Gracias por ver y buena suerte por sus experimentos.