Name: Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende el método de inmersión manual para preparar muestras biológicas en microscopía electrónica criogénica. Esta técnica accesible y rentable permite conservar especímenes con alta calidad para análisis estructural.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Herzik por pensar críticamente y proporcionar comentarios sobre este manuscrito y el contenido del video. M.A.H.Jr. cuenta con el apoyo de NIH R35 GM138206 y como Searle Scholar. H.P.M.N cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Biofísica Molecular (NIH T32 GM008326). También nos gustaría agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman y al Dr. Gabriel Lander en el Instituto de Investigación Scripps por su ayuda para diseñar, ensamblar y probar el émbolo manual que se muestra en el video.

No tenemos nada que revelar.

La vitrificación de especímenes biológicos para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) sigue siendo un paso de importancia crítica para la determinación exitosa de la estructura. El método manual de borrado y inmersión descrito en este protocolo representa un método rentable, confiable y robusto para congelar rápidamente muestras biológicas en películas delgadas de hielo vítreo para imágenes crioEM. Utilizando los métodos descritos en el manuscrito, los investi...

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de electrones4,11,12,13,14 y la estabilidad de las lentes electromagnéticas15, junto con el desarrollo continuo de la adquisición de datos 16,17 y los paquetes de software de análisis18,19, han permitido a los investigadores determinar ahora rutinariamente estructuras de especímenes de buen comportamiento a una resolución de 3 Å o mejor4,11,13,14,20,21,22,23 . A pesar de estas capacidades mejoradas de procesamiento de imágenes y datos, la preparación de la red cryoEM sigue siendo el mayor impedimento para la determinación exitosa de la estructura de alta resolución y, a menudo, sirve como un cuello de botella considerable en el flujo de trabajo de EM24,25,26,27.
CryoEM se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas en soluciones acuosas que se congelan para formar una película delgada de hielo "similar al vidrio", un proceso conocido como vitrificación, que preserva el estado bioquímico nativo. La vitrificación de muestras biológicas para crioEM se remonta a más de 40 años28,29,30 y muchas técnicas y equipos que se han desarrollado para este proceso se basan en el método de blot-and-plunge originalmente detallado31,32,33,34,35 , mediante el cual se aplica un pequeño volumen de muestra (por ejemplo, 1-5 μL) a una rejilla EM especializada antes de eliminar el exceso de solución mediante la interacción física de la rejilla con papel secante. El momento de este proceso generalmente se determina empíricamente para cada espécimen, ya que un componente crítico de las muestras de congelación es el grosor de la película de hielo vítreo: si el hielo es demasiado grueso, la calidad de la imagen se deteriora dramáticamente debido al aumento de la dispersión del haz de electrones, mientras que el hielo que es demasiado delgado puede restringir las orientaciones de las proteínas y / o excluir partículas del centro de los orificios de la lámina de la rejilla36 . Esta dependencia del espesor de hielo perfecto para la crioEM de una sola partícula ha dado lugar a una amplia gama de técnicas y equipos que pueden congelar muestras, incluida la robótica37,38, la microfluídica42 y los dispositivos ultrasónicos o de pulverización27,39,40,41,42,43,44 . En los últimos años, algunos de los dispositivos de preparación de muestras más populares se basan en el uso de la robótica para la congelación automatizada de muestras utilizando la técnica de blot-and-plunge45. Si bien estos dispositivos están diseñados para crear de manera reproducible un espesor de hielo adecuado para las imágenes, a menudo siguen siendo demasiado caros para que los laboratorios individuales los compren y operen y generalmente se encuentran dentro de las instalaciones de crioEM a precios por hora para su uso. En los últimos años, la técnica manual original de blot-and-plunge ha vuelto a ser un uso cada vez mayor3,47,48,49,50,51,52. De hecho, un dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente puede lograr rejillas crioEM de alta calidad a una fracción del costo de las contrapartes robóticas. Además, el blotting manual también ofrece a los usuarios más control sobre el blotting, ya que los investigadores pueden ajustar el tipo de blotting (es decir, el back-blotting de la cuadrícula, el front-blotting de la cuadrícula, etc.), y el tiempo de blotting en función de cada muestra individual y preguntas de investigación.
En este artículo, proporcionamos detalles sobre cómo congelar eficazmente muestras biológicas utilizando un dispositivo de vitrificación manual tradicional de borrado y inmersión junto con una plataforma dewar diseñada a medida53. Se proporcionan las mejores prácticas, incluida la preparación del criógeno, el manejo de la rejilla, la aplicación de muestras y el borrado, así como las trampas comunes y las recomendaciones sobre cómo superar estos obstáculos. Se discuten consejos sobre cómo aumentar la reproducibilidad del espesor del hielo entre las preparaciones de rejilla y cómo modificar el borrado de muestras en función del tipo de muestra biológica. Dado el bajo costo asociado con la compra y operación del émbolo manual descrito en este manuscrito, los laboratorios de todo el mundo pueden preparar especímenes biológicos para crioEM de una manera rentable y reproducible.

<table><tbody><tr><td>Caja de almacenamiento de rejilla de 4 ranuras</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Punta dispensadora de metal plano de calibre 14</td><td>Amazon</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio cuadrados de 22x22 mm</td><td>Sigma</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio de 60 mm para almacenar rejillas</td><td>Fisher</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio de 100 mm para almacenar papel Whatman</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio de 150 mm para almacenar papel Whatman</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 250 mL</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Espuma de poliestireno azul dewar</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de etano de latón</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de sujeción</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas para tareas delicadas</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de doble etapa con válvula de control</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Base de rejilla de desagüe</td><td>UCSD</td> Plataforma de etano UCSD <td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque de propano</td><td>de etano UCSAIR</td><td></td><td></td>ET PR50ZU-G etano (50%) : propano (50%) en un tanque de alta presión Tanque de</tr><tr><td></td><td></td> etano Praxair UN1035 etano (100%)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de trabajo de brazo flexible</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Humidificador</td><td>Objetivo 719438</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Higrómetro</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>Bata de laboratorio</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido dewar</td><td>Worthington</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrógeno líquido</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de émbolo manual (soporte negro + pedal)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (plataforma de inmersión)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td>Guantes</tr> de <tr><td>nitrilo</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P20</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>E0030124286</tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>ibis scientific</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de anillo</td><td>Amazon B07HMR4H8G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gafas de seguridad</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Amazon</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>Destornillador</td><td>Ironside</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Fisher</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Pinza para transferir caja de rejilla</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Papel secante Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

La obtención de imágenes de especímenes biológicos con electrones para la determinación de la estructura de alta resolución mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) requiere una capa delgada de hielo vítreo que contenga las biomoléculas de interés. A pesar de los numerosos avances tecnológicos en los últimos años que han impulsado el crioEM de una sola partícula a la vanguardia de la biología estructural, los métodos por los cuales los especímenes se vitrifican para imágenes de alta resolución a menudo siguen siendo el paso limitante de velocidad. Aunque numerosos esfuerzos recientes han proporcionado medios para superar los obstáculos que se encuentran con frecuencia durante la vitrificación de muestras, incluido el desarrollo de nuevos soportes de muestra e instrumentación de vitrificación innovadora, el émbolo tradicional operado manualmente sigue siendo un elemento básico en la comunidad crioEM debido al bajo costo de compra y la facilidad de operación. Aquí, proporcionamos métodos detallados para el uso de un dispositivo estándar de blot-and-plunge operado manualmente estilo guillotina para la vitrificación de especímenes biológicos para imágenes de alta resolución mediante crioEM de una sola partícula. Además, también se describen los problemas más comunes y las recomendaciones de solución de problemas para cuando una preparación estándar no produce una muestra adecuada.

La ejecución exitosa del protocolo de blot-and-plunge descrito aquí dará como resultado una capa delgada y uniforme de hielo vítreo que está libre de cualquier hielo hexagonal, contaminantes y grandes gradientes de hielo inutilizable que se pueden observar bajo el microscopio electrónico (Figura 3). El contacto inconsistente del papel secante con la superficie de la rejilla, la eliminación prematura del papel secante o el movimiento del papel secante durante el contacto con la rejilla pueden...

Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

El método de inmersión manual descrito aquí es un método rentable y confiable para preparar muestras para microscopía electrónica de transmisión. En este video, demostraremos cómo configurar el émbolo manual, preparar criógenos y realizar borrados y hundimientos manuales de rejillas EM. Prepare el entorno de inmersión manual.Este procedimiento debe realizarse en una cámara frigorífica mantenida a 40 grados centígrados con una humedad superior al 95%Recomendamos utilizar los materiales que se muestran aquí y como se describe en el protocolo en línea para el secado y la inmersión manual. Prepara el criógeno Dewar y el émbolo manual. Para ensamblar el criógeno Dewar, primero instale la base de la plataforma en la parte inferior de la espuma de poliestireno azul Dewar, asegurándose de que sea plana y nivelada.Luego coloque el soporte del recipiente de etano en la parte superior de la base de la plataforma e inserte el recipiente de etano de latón. Finalmente, sitúe la plataforma de almacenamiento de la red giratoria. A continuación, ubique el Dewar que se hunde en la base del émbolo manual.Centra el recipiente de etano debajo del brazo que se hunde y asegura el Dewar que se hunde a la base. Para ajustar la altura de inmersión manual, primero coloque cinta nueva en la base del brazo de inmersión. A continuación, sujete un par de pinzas de sujeción envolviendo de forma segura la cinta alrededor del brazo de inmersión y la base de la pinza.Asegúrese de que las pinzas estén firmemente unidas golpeándolas ligeramente. Sostenga el brazo que se hunde y baje lentamente las pinzas en el recipiente de etano de latón presionando el pedal. Ajuste la ubicación del Dewar que se hunde para que las pinzas se ubiquen en el centro del recipiente de etano de latón.Las puntas de las pinzas no deben entrar en contacto con el tamaño o el fondo del recipiente de etano de latón para evitar daños en las pinzas y el émbolo manual. Una vez que se haya establecido la posición, restablezca el brazo de inmersión manual. Preparar el criógeno.La preparación de criógenos debe realizarse en una habitación bien ventilada y se debe usar el equipo de protección personal adecuado en todo momento. Para empezar, el nitrógeno líquido pobre directamente en el Dewar que se hunde, deteniéndose cuando el nivel de nitrógeno líquido alcanza la parte superior del recipiente de etano de latón. El sistema debe estar lo suficientemente frío como para continuar después de que el nitrógeno líquido deje de burbujear violentamente.Esto tomará aproximadamente cinco minutos. El etano viene como un gas comprimido y necesita ser condensado. Para ajustar el flujo de gas para una condensación óptima de etano, inserte la punta de la línea de gas etano en un vaso de agua de 250 mil millas y observe el burbujeo.El flujo de gas debe producir un flujo constante de burbujas que no interrumpa violentamente la superficie del agua. Para comenzar a condensar etano, coloque la punta de la línea de gas etano en la parte inferior del recipiente de etano de latón. Revuelva lentamente la punta de metal y comience a licuar el etano.Tan pronto como el etano comience a enfriarse, hará un ruido audible. Llene el recipiente de etano de latón hasta tres cuartos lleno de etano líquido. Rellene el Dewar sumergido con nitrógeno líquido, asegurándose de que toque el recipiente de etano de latón pero no se derrame en él.La adición de nitrógeno líquido es necesaria para la congelación uniforme del etano. Coloque la tapa de espuma en el Dewar azul y permita que el etano se solidifique por completo. Reinicie el flujo de gas etano y coloque cuidadosamente la punta de la línea de gas en el etano sólido.Es importante colocar la punta verticalmente en el recipiente y dispensar etano en la parte inferior. Revuelva lentamente la punta de metal para derretir el etano y lleve el nivel de etano líquido hasta la parte superior del recipiente. Cierre la tapa durante aproximadamente un minuto y permita que el etano se solidifique alrededor de los bordes del recipiente de latón hasta que se vean de dos a tres milímetros de etano sólido.El etano está ahora a una temperatura ideal para congelar muestras biológicas. Fije el Dewar hundido con cuidado a la base del émbolo manual. Sujete un par de pinzas de sujeción envolviendo de forma segura la cinta alrededor del brazo de inmersión y la base de la pinza.Sostenga el brazo que se hunde y baje lentamente las pinzas en el etano líquido presionando el pedal. Ajuste la ubicación del Dewar de inmersión para que las pinzas se ubiquen en el medio del etano líquido, evitando el contacto con el anillo de etano sólido. Preparar materiales y accesorios de inmersión.Prepare el papel secante cortando cada papel de filtro circular en tiras de aproximadamente un centímetro de ancho. Evite tocar el centro del papel secante y deseche las piezas finales más pequeñas. Es importante asegurarse de que las tiras de papel secante estén secas, limpias y libres de contaminantes.Antes de sumergirse, coloque las cajas de rejilla en el Dewar sumergido en las ranuras adecuadas. Asegúrese de que la rejilla cubra nuestro libre para girar. Prepare especímenes de CryoEM por congelación por inmersión.Debido a la diversidad de preparaciones de la cuadrícula y la red, siga los protocolos recomendados para hacer que las rejillas sean hidrófilas. Para manejar adecuadamente las rejillas, use pinzas de sujeción limpias y secas para recoger las rejillas hidrofílicas en el anillo exterior. Deslice la abrazadera de plástico para asegurar la rejilla y golpee las pinzas suavemente para asegurarse de que la rejilla esté correctamente sujeta.Aplique tres microlitros de muestra en la parte frontal de la rejilla sostenida en las pinzas de sujeción. Fije las pinzas firmemente al brazo de inmersión manual envolviendo la cinta alrededor de la base de la pinza. La muestra ya está lista para ser borrada y sumergida congelada.Sostenga cada extremo de una tira limpia de papel secante entre los dedos índice y los pulgares. Apoya tus manos en el borde del Dewar para establecer una posición estable. El papel secante debe estar aproximadamente a un centímetro de la superficie de la rejilla.Doble el papel secante hasta que el centro entre en contacto con la rejilla. Es importante que el papel secante sea paralelo a la superficie de la rejilla para permitir un contacto uniforme y evitar daños en la rejilla. Cuando el frente líquido móvil deje de extenderse, comience a contar.Borra la cuadrícula durante cinco segundos. Separe los dedos, forzando el papel secante y retirándolo rápidamente de la superficie de la rejilla. Simultáneamente, presione el pedal para soltar el brazo de inmersión manual, sumergiendo las pinzas que sostienen la rejilla en el etano líquido.Manteniendo la rejilla recién congelada en el etano líquido, separe cuidadosamente las pinzas del brazo de inmersión manual. Desenganche cuidadosamente las pinzas para que la rejilla sea extraíble. Mueva la rejilla hacia el depósito de nitrógeno líquido debajo del recipiente de etano de latón con un movimiento rápido desde el etano hasta el nitrógeno líquido.Coloque la cuadrícula en el cuadro de cuadrícula. Resultados representativos. A partir de este video, los investigadores deberían poder preparar rejillas CryoEM, como esta, con muchos cuadrados que contienen películas delgadas de hielo vítreo para imágenes de alta resolución.La concentración de la muestra y el tiempo de borrado se pueden ajustar para optimizar la densidad de partículas. Aquí, demostraremos el flujo de trabajo completo para congelar muestras cryoEM utilizando el método de borrado y inmersión. Use una pinza de sujeción limpia para recoger una rejilla nueva y asegurar la rejilla en su lugar.Aplique tres microlitros de muestra en el lado hidrófilo de la rejilla y asegure las pinzas al brazo de inmersión manual envolviendo la cinta alrededor del mango de la pinza. Coloque el papel secante paralelo a la superficie de la rejilla y doble suavemente el papel secante hacia la rejilla para iniciar el borrado. Después de la cantidad de tiempo deseada, mueva el papel secante en un movimiento de chasquido lejos de la superficie de la rejilla mientras presiona el pedal para liberar el brazo que se hunde, sumergiendo la rejilla en el etano líquido.Desenrolle con cuidado la cinta alrededor de las pinzas y el brazo de inmersión manual. Con un movimiento rápido, transfiera rápidamente la rejilla desde el recipiente de etano al depósito de nitrógeno líquido. Coloque la rejilla en la caja de almacenamiento de la rejilla y envuelva las pinzas en una toallita Kim para que se sequen; repita.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a "macromoleculares" (~ 4 nm) de resolución.

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Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

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