Name: Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca2+-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a modificar químicamente residuos de triptófano en el dominio N de Ca²⁺-ATPasa para estudiar transferencia de energía FRET con ANS. Este método permite clarificar el papel del triptófano en la unión de ANS.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por la subvención FAI-UASLP número C19-FAI-05-89.89 y la subvención conacyt número 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Los autores agradecen la asistencia técnica de Julián E. Mata-Morales en la edición de video.

1. Determinación (in silico) de la interacción ANS y SERCA N-dominio
<ol><li>Generar una estructura tridimensional (3D) de la proteína (serca N-domain) mediante modelado molecular utilizando el software de modelado de proteínas preferido50.</li>
	<li>Identificar los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión a nucleótidos utilizando el software de estructura molecular preferido51, y determinar la presencia de residuos de Arg y Lys35; estos son necesarios para la unión al SNA y para aumentar la intensidad de la fluorescencia (rendimiento cuántico).</li>
	<li>Realizar acoplamiento molecular (utilizando el software de acoplamiento preferido)52,53,54 para determinar las interacciones de ATP, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (que forma un enlace covalente con Lys515 que marca el sitio de unión a nucleótidos) y ANS con residuos de aminoácidos en el sitio de unión a nucleótidos(Figura 1).</li>
	<li>Calcule la distancia molecular (Å) entre el residuo de Trp y el SNAN unido utilizando la herramienta de medición en el software preferido.</li>
	<li>Realizar simulación de dinámica molecular del complejo ans-N-dominio para determinar la estabilidad de la interacción52,54. Luego, realice los experimentos in vitro cuando se haya confirmado la estabilidad del complejo.</li>
</ol>2. Expresión y purificación del dominio N recombinante
<ol><li>Sintetizar el gen que codifica para el dominioN 40.</li>
	<li>Diseñar y construir el plásmido que contiene el gen sintético que codifica para el dominio N40.</li>
	<li>Expresar y purificar por cromatografía de afinidad (Ni-NTA), el dominio N recombinante diseñado. Realizar un SDS-PAGE de la proteína purificada para determinar la pureza (Figura 2)40.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteínas estudiando la absorbancia a λ de 280 nm con el coeficiente de extinción del dominio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>3. Monitorear la formación del complejo ans-N-domain basado en los cambios de intensidad de fluorescencia de ANS y N-domain.
<ol><li>Preparar una solución de caldo ans en N,N-dimetilformamida.<ol>
<li>Pesar una pequeña cantidad (1-5 mg) de SNIA, y disolverlo en 1 ml del volumen final de N,N-dimetilformamida, por ejemplo, 3,2 mg (concentración final de 10,69 mM).</li>
		<li>Preparar una solución de caldo acuoso ans de 100 μM utilizando la solución ANS en N,N-dimetilformamida, por ejemplo, añadir 9,4 μL de la solución ANS de 10,69 mM a 990,6 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8,0 para obtener un volumen final de 1 mL.</li>
		<li>Mezcle las soluciones vórtice de 3 a 5 veces durante 15 s. Nota : en el siguiente experimento, utilice sólo la solución de almacenamiento acuoso ANS. Prepare recién la solución de caldo acuoso ANS antes de iniciar los experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de stock de NBS en N,N-dimetilformamida.<ol>
<li>Pesar una pequeña cantidad (1-5 mg) de NBS, y disolverlo en 1 mL de N, N-dimetilformamida, por ejemplo, 5,3 mg en 1 mL (concentración final de 29,78 mM).</li>
		<li>Preparar una solución de stock acuoso nbS de 1 mM utilizando la solución NBS en N,N-dimetilformamida, por ejemplo, añadir 3,36 μL de la solución NBS de 29,78 mM a 96,64 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8,0 para obtener un volumen final de 0,1 mL.</li>
		<li>Mezcle las soluciones vórtice de 3 a 5 veces durante 15 s. NOTA: Prepare recién la solución de stock acuoso NBS antes de comenzar los experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valore el dominio N con ANS y registre los espectros de fluorescencia por excitación a λ=295 nm a 25 °C.<ol>
<li>Obtener la línea de base del espectro de fluorescencia.<ol>
<li>Coloque 1 ml de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia de 1 ml.</li>
			<li>Coloque la celda en la cámara celular termoestada (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.</li>
			<li>Registre el espectro de fluorescencia (305 - 550 nm). NOTA: El espectro de fluorescencia del tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0, que sirve como muestra en blanco, se resta de todos los espectros de fluorescencia obtenidos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Obtener el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N.<ol>
<li>Coloque 900 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia.</li>
			<li>Añadir 100 μL de suspensión de dominio N (10 μM) para obtener una concentración final de dominio N de 1 μM en un volumen final de 1 ml.</li>
			<li>Homogeneizar suavemente con una micropipeta 20 veces para asegurar la homogeneidad de la solución. NOTA: La proteína debe ser recién purificada para obtener espectros de fluorescencia intrínseca de alta calidad, por ejemplo, el dominio N recombinante purificado solo se puede usar durante una semana después de la purificación.</li>
			<li>Coloque la celda en la cámara celular termoestada (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.</li>
			<li>Registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N (305-550 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Añadir ANS, y obtener el espectro de fluorescencia por excitación a λ=295 nm.<ol>
<li>Añadir una alícuota de 2 μL de solución de caldo acuoso ans de 100 μM al dominio N suspendido (1 μM) para obtener una concentración final de SNA de 0,2 μM.</li>
			<li>Homogeneizar suavemente con una micropipeta 20 veces para asegurar la homogeneidad de la solución.</li>
			<li>Coloque la celda en la cámara celular termoesta (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.</li>
			<li>Registre el espectro de fluorescencia (305-550 nm).</li>
			<li>Repita las adiciones ans y los espectros de fluorescencia registrando por encima de la relación molar 1:1 ANS:N-dominio.</li>
			<li>Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.</li>
			<li>Traza todos los espectros en un solo gráfico.</li>
			<li>Determine si los espectros forman un patrón similar a FRET. Los espectros de fluorescencia del dominio ANS-N forman un patrón similar a FRET(Figura 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Titulación de fluorescencia intrínseca del dominio N por modificación química de Trp con NBS.
<ol><li>Repita los pasos 3.3.1 y 3.3.2.</li>
	<li>Añadir una alícuota de 1 μL de solución de stock acuoso de 1 mM NBS al dominio N suspendido (1 μM) para obtener una concentración final de 1 μM de NBS.</li>
	<li>Homogeneice suavemente utilizando una micropipeta 20 veces para garantizar la homogeneidad de la solución.</li>
	<li>Coloque la celda en la cámara celular termoesta (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.</li>
	<li>Registrar el espectro de fluorescencia (305-550 nm) (Figura 3B).</li>
	<li>Repita la adición de NBS y el registro de espectros de fluorescencia hasta que se observe un mínimo de enfriamiento de fluorescencia intrínseca del dominioN 40. En el dominio N, esto generalmente ocurre en una relación molar de 5-6 NBS / N-dominio40. NOTA: NBS apaga rápidamente (<5 s) la fluorescencia intrínseca del dominio N; se observa una disminución en la intensidad de la fluorescencia. Continúe inmediatamente al siguiente paso, ya que NBS también puede reaccionar con otros residuos de aminoácidos47.</li>
	<li>Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.</li>
	<li>Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3B).</li>
</ol>5. Valorar el dominio N modificado por NBS con ANS registrando espectros de fluorescencia a 25 °C.
<ol><li>Realice el paso 3.3.3 utilizando el dominio N modificado nbs que se generó en el paso 4.</li>
	<li>Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.</li>
	<li>Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3C).</li>
	<li>Los espectros de fluorescencia generados(Figura 3C)apoyan o refutan la ocurrencia de FRET, es decir, cuando se produce FRET, la fluorescencia ans no aumenta y viceversa.</li>
</ol>6. Evidencia de unión del SNA al dominio N modificado químicamente por excitación a λ=370 nm.
<ol><li>Realice el paso 3.3.3 utilizando el dominio N modificado NBS que se generó en el paso 4, pero cambiando la excitación λ a 370 nm.</li>
	<li>Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.</li>
	<li>Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3D).</li>
	<li>Confirme la unión del SNA al dominio N observando el aumento de la intensidad de la fluorescencia del SNA. La unión del SNA al dominio N muestra un aumento de fluorescencia cuando se excita a λ=370 nm (Figura 3D). Como control, se obtuvo el espectro de fluorescencia del SNA (solo) en tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 excitante a λ de 295 y 370 nm(Figura 4,no se muestra en video). NOTA: La relación estequiométrica de NBS:Trp que se requiere para la modificación química depende del grado de enterramiento de los residuos de Trp en la proteína en estudio46,47,55,56. Por lo tanto, se recomienda determinar la relación molar NBS: proteína / (Trp), de antemano.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los espectros de fluorescencia del complejo de dominio ANS-N muestran un patrón similar a FRET cuando se excitan a una λ de 295 nm, mientras que la distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y ANS parece apoyar la aparición de FRET(Figura 1). La modificación química de Trp por NBS da como resultado un dominio N menos fluorescente(Figura 3B,Espectro f); por lo tanto, la transferencia de energía no es posible. Los espectros de fluorescencia ANS son similar...

La transferencia de energía por resonancia de Föster (FRET) se ha convertido en una técnica estándar para determinar la distancia entre las estructuras moleculares después de la unión o interacción en los estudios de estructura y función deproteínas 1,2,3,4. En las ATPasas de tipo P, FRET se ha utilizado para investigar la estructura y función del retículo sarco-endoplásmico Ca2+-ATPasa (SERCA)2,5,6,7,8,por ejemplo, las fluctuaciones estructurales durante el ciclo catalítico se han analizado en toda la proteína mediante FRET7.
Los donantes de FRET son diversos, y van desde pequeñas moléculas fluorescentes (extrínsecas) hasta proteínas fluorescentes9,10. Los residuos de triptófano (Trp) (debido a su fluorescencia) son útiles para identificar cambios estructurales en las secuencias de aminoácidos proteicos11,12. La intensidad de fluorescencia de Trp depende sustancialmente de la polaridad de su entorno circundante13,14. La unión a ligando suele generar reordenamientos estructurales en proteínas/enzimas15,16. Si Trp está presente o cerca del sitio de unión a la proteína, las fluctuaciones estructurales afectan con frecuencia el grado de exposición de Trp a los medios acuosos13,14; por lo tanto, el cambio en la polaridad resulta en el enfriamiento de la intensidad de fluorescencia Trp13,14. Por lo tanto, la propiedad fluorescente de Trp es útil para realizar estudios de unión a ligandos para enzimas. Otros fenómenos físicos también pueden conducir a un enfriamiento de fluorescencia de Trp17,18,19,20, por ejemplo, FRET y cambios en la polaridad media. La transferencia de energía del estado excitado de Trp a un fluoróforo también tiene aplicaciones potenciales, por ejemplo, la determinación de afinidad de pequeños ligandos en proteínas21. De hecho, Trp se ha utilizado principalmente como donante de fluorescencia en estudios FRET en proteínas22,23,24,por ejemplo, en estudios FRET de terbio (Tb3+),un residuo de Trp se utiliza con frecuencia como antena para la transferencia de energía a Tb3+25,26,27. Trp muestra diversas ventajas sobre otros donantes de FRET debido a su carácter constitutivo inherente en la estructura de la proteína, lo que elimina la necesidad de procesos preparatorios que pueden afectar la función/estructura de la proteína estudiada24. Por lo tanto, la identificación de desintegraciones radiativas (transferencia de energía y cambios en la polaridad media que son inducidos por reordenamientos estructurales de proteínas) es importante para sacar conclusiones precisas con respecto a la unión a ligandos en estudios estructurales de proteínas13,14,19,28.
En estudios estructurales de proteínas, un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se ha utilizado principalmente en experimentos relacionados con el plegamiento / despliegue de proteínas28,29. El SNA se une a proteínas/enzimas en estado nativo, generalmente en los sitios de unión de los sustratos31,32,33; un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia ANS (ΦF) (es decir, un aumento en la intensidad de fluorescencia) es inducido por excitar la proteína a λ = 370 nm cuando se producen interacciones adecuadas de ANS con Arg y sus residuos en bolsas hidrofóbicas34,35,36,37. En diversos estudios, se ha notificado la aparición de FRET (cuando se excita a λ dentro de 280-295 nm) entre los residuos de Trp (donantes) y ANS (aceptor), que se basa en lo siguiente: 1) superposición del espectro de emisión de fluorescencia de Trp y espectro de excitación de ANS, 2) identificación de una distancia adecuada entre uno o más residuos de Trp y ANS para la transferencia de energía, 3) alto rendimiento cuántico de ANS cuando se une en bolsas de proteínas, y 4) patrón FRET característico en los espectros de fluorescencia de la proteína en presencia de ANS3,17,27,37,38.
Recientemente, la unión de ligandos al dominio de unión a nucleótidos (dominio N) en SERCA y otras ATPasas de tipo P se han investigado utilizando dominios N recombinantesdiseñados 40,41,42,43,44,45,46. La ingeniería molecular del dominio SERCA N se ha utilizado para mover el único residuo de Trp (Trp552Leu) a una estructura más dinámica (Tyr587Trp) que está cerca del sitio de unión a nucleótidos, donde las variaciones de fluorescencia (enfriamiento) se pueden utilizar para monitorear los cambios estructurales en la unión del ligando34. Los resultados experimentales han demostrado que el SNA se une (como ATP) al sitio de unión a nucleótidos en el dominio SERCA N recombinante purificado34. Curiosamente, la fluorescencia ans aumenta al unirse al dominio N tras la excitación a una λ de 295 nm, mientras que la fluorescencia intrínseca del dominio N disminuye34,produciendo así un patrón FRET que sugiere la formación de un par Trp-ANS FRET.
Se ha propuesto el uso de NBS para determinar el contenido de residuos de Trp en proteínas47 mediante ensayo de absorbancia de proteínas modificadas. NBS modifica el grupo indol altamente absorbente de Trp al oxindole menos absorbente47,48. Esto resulta en la pérdida (enfriamiento) de la propiedad fluorescente Trp40. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS de los residuos de Trp se puede utilizar como un ensayo para definir el papel de Trp (como donante) cuando se hipotetiza FRET.
Este protocolo describe la modificación química del único residuo de Trp por NBS en el dominio N recombinante diseñado de SERCA como un modelo de proteína. Los resultados experimentales demuestran que la intensidad de la fluorescencia del SÁN sigue aumentando en el dominio N34modificado químicamente por NBS, que carece de fluorescencia intrínseca. Por lo tanto, el ensayo es útil para demostrar la ausencia de FRET entre el residuo de Trp y anS cuando se une al dominio N34,40,49. Por lo tanto, este ensayo (modificación química NBS de Trp) es útil para probar la presencia del par Trp-ANS FRET en las proteínas.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-Ácido anilino-1-naftalenosulfónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluoróforo</td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Químico modificación</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12 Preparación de</td><td>la solución madre</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Etiqueta de fluorescencia química</td></tr><tr><td>Cubeta de fluorescencia</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Ensayo de fluorescencia</td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro de fluorescencia</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Ensayo</td></tr> <tr>de fluorescencia<td>HisTrap&trade; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Purificación de proteínas</td></tr><tr><td>IPTG, libre de dioxano</td><td>American Bionalytical</td><td>AB00841-00010</td><td>Expresión de proteínas</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Purificación de proteínas</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td></td><td>FA10002M Fluorescencia ensayo</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Ensayo de fluorescencia</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td></td><td>FA10005M Ensayo de fluorescencia</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Ensayo de fluorescencia</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Ensayo de fluorescencia</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19 Preparación de</td><td>tampón</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01 Preparación de</td><td>tampón</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0,2</td><td>mmm Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>Filtración de solución</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>SDS-PÁGINA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de ca2+-atpasa n para el estudio del triptófano-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

El retículo sarcolásmico Ca2+-ATPasa (SERCA) es una ATPasa de tipo P que se ha cristalizado en diversas conformaciones. No obstante, se puede obtener información funcional detallada a partir de dominios recombinantes aislados. El dominio de unión a nucleótidos recombinantes (dominio N) diseñado (Trp552Leu y Tyr587Trp) muestra un enfriamiento de fluorescencia al unirse al ligando. Un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se une al sitio de unión a nucleótidos a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas con residuos de Arg, His, Ala, Leu y Phe. La unión al SNA se evidencia por el aumento de la intensidad de la fluorescencia cuando se excita a una longitud de onda (λ) de 370 nm. Sin embargo, cuando se excita a λ de 295 nm, el aumento en la intensidad de la fluorescencia parece estar acoplado al enfriamiento de la fluorescencia intrínseca del dominio N. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón de transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), lo que sugiere la presencia de un par Trp-ANS FRET, que parece estar soportado por la corta distancia (~ 20 Å) entre Tyr587Trp y ANS. Este estudio describe un análisis del par Trp-ANS FRET por modificación química Trp (y enfriamiento por fluorescencia) que está mediado por N-bromosuccinimida (NBS). En el dominio N modificado químicamente, la fluorescencia del SN aumenta cuando se excita a una λ de 295 nm, similar a cuando se excita a una λ de 370 nm. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS del residuo de Trp se puede utilizar para sondear la ausencia de FRET entre Trp y ANS. En ausencia de fluorescencia de Trp, no se debe observar un aumento en la fluorescencia de ANS. La modificación química de los residuos de Trp en proteínas por NBS puede ser útil para examinar FRET entre residuos de Trp que están cerca del SNA unido. Este ensayo probablemente también será útil cuando se usen otros fluoróforos.

El acoplamiento molecular muestra la unión del SNA al sitio de unión a nucleótidos del dominio N a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas(Figura 1). La distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y el SNA (unido al sitio de unión a nucleótidos) apoya la aparición de FRET (Figura 1). El dominio N recombinante diseñado (diseñado) se obtuvo a alta pureza mediante cromatografía de afinidad(Figura 2)y fue adecuado ...

ANS se une al dominio N recombinante Ca2+-ATPasa. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón similar a FRET sobre la excitación a una longitud de onda de 295 nm. La modificación química del Trp mediada por NBS apaga la fluorescencia del dominio N, lo que conduce a la ausencia de transferencia de energía (FRET) entre el residuo de Trp y el ANS.

Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca2+-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Estos ensayos pueden ayudar a aclarar el papel de los residuos de triptófano en las proteínas al realizar estudios de unión al SNA. La fluorescencia del SNA aumenta al unirse a sitios estructurales específicos en las proteínas. A veces, el sitio de unión al SNA se localiza cerca de un residuo de triptófano con una distancia que sugiere la existencia de FRET entre el triptófano y el SNA.NBS media la modificación química de los residuos de triptófano en las proteínas, apagando su fluorescencia. Por lo tanto, estos ensayos permiten determinar si los residuos de triptófano contribuyen al aumento de la intensidad de fluorescencia del SÁN por FRET. En este trabajo, utilizamos un dominio de unión a nucleótidos recombinantes diseñado de SERCA que contiene mutaciones, con el objetivo de localizar un triptófano cerca del sitio de unión a nucleótidos donde también se une el SNA.Este ensayo es rápido y fácil de realizar, de ahí su principal ventaja. Determinación in silico de la interacción ANS y SERCA N-Domain. Generar una estructura tridimensional de la proteína mediante modelado molecular utilizando el software de modelado de proteínas preferido.Identifique los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión a nucleótidos utilizando el software estructural molecular preferido y determine la presencia de residuos de arginina y lisina. Estos son necesarios para la unión al SNA y aumentan la intensidad de la fluorescencia. Debido a la presencia de residuos de arginina y lisina en el sitio de unión a nucleótidos de SERCA, planteamos la hipótesis de la unión de ANS al dominio N.En el modelo 3D, los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión al ATP se identifican y resaltan en naranja. Del mismo modo, la mutación de tirosina a triptófano se localiza y resalta en azul. Realice acoplamiento molecular con ATP, FITC y ANS.Los resultados de acoplamiento muestran que anS encaja bien en el sitio de unión de nucleótidos, de manera similar a ATP y FITC. FITC etiqueta el sitio de unión de nucleótidos. Calcular la distancia molecular entre el residuo de triptófano y el SNA.20 angstroms parece ser una distancia adecuada para FRET. Realizar simulación dinámica molecular del complejo ANS N-Domain para determinar la estabilidad de la interacción. Un tiempo de simulación de 10 nanosegundos muestra la estabilidad del complejo.Proceda a realizar los experimentos in vitro. Expresión y purificación del Dominio N recombinante. Expresar y purificar, mediante cromatografía de afinidad, el dominio N recombinante diseñado.Realice un SDS-PAGE de la proteína purificada para determinar la pureza. Determinar la concentración de proteínas por absorbancia a una longitud de onda de 280 nanómetros con el coeficiente de extinción del dominio N. Monitorear la formación del complejo ANS N-Domain basado en los cambios de intensidad de fluorescencia ans y N-Domain.Preparar una solución de caldo ans en N, N-dimetilformamida. Pesar una pequeña cantidad de SAN, entre uno y cinco miligramos. Disolver el SÁN en un ml de volumen final de N, N-dimetilformamida.Preparar una solución madre de SNA micromolar de 100 micromolares utilizando la solución de SNA en N, N-Dimetilformamida. Mezcle la solución vórtice de tres a cinco veces. Preparar la solución de stock de NBS en N, N-Dimetilformamida.Pesar una pequeña cantidad de NBS, de uno a cinco miligramos. Disolver el NBS en un ml de N, N-dimetilformamida. Preparar una solución madre de NBS de un milimolar utilizando la solución de NBS en N, N-dimetilformamida.Mezcle la solución vórtice de tres a cinco veces. Valore el dominio N con ANS y registre los espectros de fluorescencia para la excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros a 25 grados. Obtener la línea de base del espectro de fluorescencia.Coloque un ml de tampón de fosfato milimolar de 50 con pH ocho en una cubeta de cuarzo de fluorescencia de un ml. Coloque la celda en la cámara de celda termostatada del espectrofotómetro y ajuste la longitud de onda de excitación a 295 nanómetros. Registre el espectro de fluorescencia.El espectro de fluorescencia del espacio en blanco muestra el pico de agua, que debe restarse más tarde. Obtener el espectro de fluorescencia intrínseca del Dominio N. Coloque 900 microlitros de tampón de fosfato milimolar de 50 con pH 8 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia.Agregue 100 microlitros de suspensión de N-Domain para producir una concentración final de N-Domain micromolar. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Coloque la celda en la cámara termostatada del espectrofotómetro.Establezca la longitud de onda de excitación en 295 nanómetros. Registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N. Agregue ANS y obtenga el espectro de fluorescencia por excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros.Añadir una alícuota de dos microlitros de solución madre de SNA micromolar de 100 micromolares al dominio N suspendido para obtener una concentración final de SNA micromolar de 0,2. Homogeneizar suavemente, utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de esta solución. Registre el espectro de fluorescencia.Repita las adiciones de ANS y el registro espectral de fluorescencia como se describió anteriormente para una relación molar N-Dominio anS 1:1. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software. Trazar todos los espectros en un solo gráfico Determinar si un patrón similar a FRET está formado por el espectro.Los espectros de fluorescencia del dominio N de ANS forman un patrón similar a FRET. Valoración de florescencia intrínseca del dominio N por modificación química de triptófano con NBS. Obtener de nuevo el espectro de fluorescencia intrínseca del Dominio N.Agregue una alícuota de un microlitro de una solución madre de NBS milimolar al dominio N suspendido para obtener una concentración final de un NBS micromolar. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Registre el espectro de fluorescencia.Repita la adición de NBS y el registro espectral de fluorescencia hasta que se observe un mínimo de enfriamiento de fluorescencia intrínseca del dominio N. Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.Traza todos los espectros en un solo gráfico. Valore el dominio N modificado NBS con ANS registrando espectros de fluorescencia a 25 grados. Agregue ANS y obtenga el espectro de fluorescencia por excitación a una longitud de onda de 295 nanómetros.Homogeneizar suavemente utilizando una micropipeta para asegurar la homogeneidad de la solución. Registre el espectro de fluorescencia. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.Traza todos los espectros en un solo gráfico. Los espectros de fluorescencia generados apoyan o refutan la ocurrencia de FRET. Es decir, cuando se produce FRET, la fluorescencia del SÁN no aumenta y viceversa.Evidencia de unión del SNA al dominio N modificado químicamente por excitación a una longitud de onda de 370 nanómetros. Agregue ANS al dominio N modificado NBS y registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N por excitación a una longitud de onda de 370 nanómetros. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando software.Traza todos los espectros en un solo gráfico. Confirme la unión del SNA al dominio N mediante el aumento de la intensidad de la fluorescencia del SNA. La unión del SNA al dominio N muestra un aumento de fluorescencia cuando se excita a una longitud de onda de 370 nanómetros.Resumen de resultados. El panel A.ANS del complejo N-Domain muestra un patrón similar a FRET cuando se excita a una longitud de onda de 295 nanómetros. El Panel B.NBS apaga la fluorescencia intrínseca del Dominio N modificando químicamente el único residuo de triptófano en el Dominio N modificado químicamente.Panel C.La fluorescencia ANS aumenta cuando se excita a una longitud de onda de 295 nanómetros. Panel D.La fluorescencia ANS también aumenta cuando se excita a una longitud de onda de 370 nanómetros. Por lo tanto, la excitación directa del SNA a una longitud de onda de 295 nanómetros es la principal fuente de fluorescencia del SNA cuando se une al sitio de unión al ATP. Conclusiones.Estos ensayos pueden utilizarse para determinar la existencia de FRET entre los residuos de triptófano y el SNA en las proteínas. La clarificación de FRET, confirmación o no, entre triptófano y SNA permitirá sacar mejores conclusiones en estudios estructurales de proteínas. El ensayo también puede ser útil cuando se usan otros fluoróforos.

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Bioquímica

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

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Se presenta un protocolo de expresión libre de células fácil de usar para la incorporación específica de residuos de análogos de aminoácidos no canónicos en proteínas, incluido el análisis posterior, para estudios médicos, farmacéuticos, estructurales y funcionales.

La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcripción-traducción libre de células

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

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Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

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Biología sintética permite la ingeniería de proteínas con propiedades sin precedentes mediante la inserción co-translational de aminoácidos no-canónico. Aquí, se presenta como una variante espectralmente rojo-cambiado de puesto de un fluoróforo tipo GFP con propiedades espectroscópicas fluorescencia novela, llamado proteína fluorescente de "oro" (GdFP), se produce en e. coli mediante incorporación de presión selectiva (SPI).

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Para superar las limitaciones de la mutagénesis clásica dirigida al sitio, se incorporaron análogos de prolina con modificaciones específicas en varias proteínas fluorescentes. Mostramos cómo la sustitución del hidrógeno por flúor o del simple por dobles enlaces en residuos de prolina ("cirugía molecular") afecta a las propiedades fundamentales de las proteínas, incluyendo su plegamiento e interacción con la luz.

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Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca2+-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET (Video) | JoVE Journal

Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca²⁺-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET

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