Name: Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprende a preparar rejillas de muestra a alta temperatura para crio-EM usando un aparato de vitrificación. Este protocolo permite estudiar estructuras proteicas dependientes de la temperatura hasta 70 °C.

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Los autores agradecen al Dr. Hervé Remigy de Thermo Fisher Scientific sus útiles consejos. Los experimentos crio-EM se realizaron en la Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM cuenta con el apoyo de la Academia Sínica (Subvención No. AS-CFII-108-110) y Taiwan Protein Project (subvención No. AS-KPQ-109-TPP2). Los autores también agradecen a la Sra. Hui-Ju Huang por la ayuda con la preparación de la muestra.

NOTA: Este protocolo tiene como objetivo utilizar un aparato de vitrificación comercial modificado para preparar las muestras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) a temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. La configuración experimental general se muestra en la Figura 1. El protocolo utiliza 55 °C como ejemplo. Para las condiciones específicas a otras temperaturas, véase el cuadro complementario 2 en la referencia12.
1. Preparación del aparato de vitrificación
<ol><li>Haga un orificio de 1 cm en un tubo de centrífuga de 50 ml en su extremo cerrado.</li>
	<li>Coloque el tubo en la cámara del aparato de vitrificación en la salida de agua ultrasónica, como se muestra en la Figura 2. NOTA: El propósito es minimizar la condensación de agua guiando el vapor de agua al intercambiador de calor a través del tubo antes de llegar a toda la cámara.</li>
	<li>Ajuste la temperatura del aparato de vitrificación a la temperatura especificada (por ejemplo, 55 °C, como se muestra en la Figura 3) y permita que la cámara del aparato de vitrificación alcance los 55 °C y el 100% de humedad relativa. Déjelo reposar durante al menos media hora para estabilizar las condiciones antes de comenzar el experimento.</li>
</ol>2. Calentamiento de la muestra y las herramientas
<ol><li>Coloque el baño de agua en una placa calefactora y ajuste la placa a la temperatura deseada (aquí 55 ° C). Verifique con un termómetro para asegurarse de que el agua alcance los 55 ° C.</li>
	<li>Incubar la muestra en el baño maría y precalentar la punta de la pipeta en el borde de la placa calefactora durante 2 minutos o más antes del experimento de secado. NOTA: El ajuste de temperatura más alto para la cámara del aparato de vitrificación es de 60 °C. Para preparar rejillas de temperatura más altas para el experimento cyro-EM (por ejemplo, 70 °C), la muestra se incuba en el baño maría a 80 °C, y el promedio entre la temperatura de la muestra y la temperatura del aparato de vitrificación se estima como la temperatura real de la muestra en la rejilla (70 °C en este caso). Consulte la sección Discusión para obtener más detalles y limitaciones sobre esta estimación.</li>
</ol>3. Preparación para el experimento de transferencia
<ol><li>Descarga incandescente una rejilla agujereada soportada por carbono a 25 mA durante 30 s, o alternativa a los valores dependiendo del dispositivo utilizado.</li>
	<li>Incubar las pinzas con la rejilla en el aparato de vitrificación durante 2 min o más.</li>
	<li>Llene el recipiente de etano con etano de acuerdo con los procedimientos estándar. No dejes que el etano se desborde. NOTA: Este paso dura unos 10 minutos y debe seguirse inmediatamente con el experimento de secado para evitar la congelación.</li>
	<li>Coloque el papel de filtro de vitrificación en la cámara del aparato de vitrificación no antes de 5 minutos antes del experimento de secado. NOTA: Colocar el papel de filtro en la cámara demasiado pronto hará que se humedezca demasiado.</li>
</ol>4. Experimento de transferencia
NOTA: Cuando sostenga la rejilla, asegúrese de que la rejilla sea estable y que haya un área de contacto mínima con las pinzas (Figura 4). Esto se hace para mantener la mejor eficiencia de enfriamiento del etano y para evitar el hielo no vítreo.
<ol><li>Utilice una punta de pipeta para aplicar 7-9 μL de la muestra a la rejilla. Luego espere 1-2 s, seque durante 1-1.5 s y sumerja rápidamente la muestra en etano líquido.</li>
	<li>Transfiera la rejilla del etano líquido a la caja criogénica, que se almacena en nitrógeno líquido. NOTA: Este paso debe realizarse con mucho cuidado porque las pinzas todavía están calientes, por lo que todo el tanque de enfriamiento está lleno de vapor en este momento.</li>
</ol>5. Control de calidad de las redes
<ol><li>Recorte las cuadrículas y cárguelas en un instrumento crio-EM.</li>
	<li>Utilice la pantalla de visualización del instrumento crio-EM y la función de dosis baja del software para detectar la condición del hielo en la rejilla y la distribución de la muestra en la rejilla. NOTA: A menudo, las rejillas están muy secas o la capa de hielo es demasiado gruesa. La tasa de éxito de las rejillas preparadas a altas temperaturas es sustancialmente inferior a la de las rejillas a temperatura ambiente o a 4 °C. Los resultados representativos de las cuadrículas buenas y las cuadrículas no satisfactorias se muestran en la siguiente sección.</li>
	<li>Si la calidad de la rejilla resultante no es buena, repita el proceso de preparación de la rejilla con condiciones variadas (como tiempo de espera, tiempo de borrado, etc.). Si la calidad de la rejilla resultante es buena, repita los mismos pasos para hacer rejillas a una temperatura diferente.</li>
</ol>6. Recopilación de datos
<ol><li>Transfiera las rejillas de buena calidad a un instrumento crio-EM de alta resolución.</li>
	<li>Realizar la recopilación y el análisis de datos de acuerdo con los procedimientos establecidos. NOTA: Como se muestra en nuestra publicación anterior, la resolución de la estructura no se ve afectada por la alta temperatura12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

En el paso 1 del protocolo, asegúrese de que el tubo de centrífuga se haya instalado bien y no se caiga cuando el experimento esté en curso. Debido a la acumulación de una gran cantidad de gotas de agua en la cámara, lo que podría cambiar la capacidad de adsorción del papel de filtro, se recomienda que el tiempo total del experimento no exceda los 30 minutos después de que la cámara del aparato de vitrificación haya alcanzado la temperatura de equilibrio. Si el tiempo de operación excede los 30 minutos, el operador debe ...

La tecnología crio-EM para resolver las estructuras de complejos proteicos ha continuado mejorando, particularmente en la dirección de la obtención de estructuras de alta resolución 1,2. Mientras tanto, el panorama de su aplicación también se ha ampliado variando las condiciones de la muestra, como el pH o los ligandos, antes del proceso de vitrificación3, que implica la preparación de rejillas de muestra seguidas de congelación por inmersión 4,5. Otra condición importante es la temperatura. Aunque los experimentos crio-EM, como la cristalografía de rayos X, se realizan a bajas temperaturas, la estructura resuelta por cryo-EM refleja la estructura en el estado de solución antes de la vitrificación. Hasta hace poco, la mayoría de los estudios crio-EM de análisis de partículas individuales (SPA) utilizan muestras que se mantienen en hielo (es decir, a 4 °C) antes de la vitrificación6, aunque varios estudios utilizan muestras a una temperatura ambiente de alrededor de 7,8,9,10 o tan alta como 42 °C 11. En un informe reciente, realizamos estudios dependientes de la temperatura de la enzima cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) de la arquea termófila Sulfolobus solfataricus (Sso) a seis temperaturas diferentes de 4 ° C a 70 ° C12. Nuestros estudios sugieren que es importante preparar rejillas de muestra a temperaturas funcionalmente relevantes y que la crio-EM es el único método estructural que es prácticamente factible para resolver la estructura del mismo complejo proteico a múltiples temperaturas.
La principal dificultad para la vitrificación a altas temperaturas es minimizar la condensación de vapor y lograr hielo delgado. Aquí informamos el protocolo detallado utilizado para preparar rejillas de muestra a altas temperaturas en nuestro estudio previo del Sso-KARI 12. Asumimos que los lectores o espectadores ya tienen experiencia en la preparación general de muestras y los procedimientos de procesamiento de datos para experimentos crio-EM y enfatizamos los aspectos relevantes para la alta temperatura.

<table><tbody><tr><td>Tubo</td><td>Falcon</td><td>Falcon 352070</td><td>tamaño: 50 mL</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash; 55/20 mm, grado 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Baño de agua</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>K100X</td><td>Microscopía electrónica Ciencias de</td><td></td><td>descarga incandescente</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Rejilla de Cu</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>imágenes de baja dosis</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Vitrobot</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Las rejillas de muestreo para experimentos de criomicroscopía electrónica (crio-EM) se preparan generalmente a una temperatura óptima para el almacenamiento de muestras biológicas, principalmente a 4 °C y ocasionalmente a temperatura ambiente. Recientemente, descubrimos que la estructura de proteínas resuelta a baja temperatura puede no ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de arqueas termófilas. Se desarrolló un procedimiento para preparar muestras de proteínas a temperaturas más altas (hasta 70 °C) para el análisis crio-EM. Demostramos que las estructuras de muestras preparadas a temperaturas más altas son funcionalmente relevantes y dependientes de la temperatura. Aquí describimos un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a alta temperatura, utilizando 55 ° C como ejemplo. El experimento utilizó un aparato de vitrificación modificado con un tubo centrífugo adicional, y las muestras se incubaron a 55 °C. Los procedimientos detallados se ajustaron para minimizar la condensación de vapor y obtener una fina capa de hielo en la rejilla. Se proporcionan ejemplos de experimentos exitosos y no exitosos.

La descripción general de bajo aumento se muestra en la Figura 5A,B. El panel A es un ejemplo de una cuadrícula exitosa. Hay un gradiente de hielo desde la parte superior izquierda (más gruesa) hasta la parte inferior derecha (más delgada o vacía). Dicha cuadrícula hace que sea más fácil encontrar un espesor apropiado de la capa de hielo en el área media adecuada para la recopilación de datos, como las cajas azul y verde. La rejilla B está demasiado seca. Los cuadrados en la...

Este documento proporciona un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a temperaturas de hasta 70 ° C, antes de la congelación por inmersión para experimentos crio-EM.

Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Las funciones de las proteínas dependen de la temperatura y son óptimas a la temperatura. Este protocolo proporciona una forma de resolver estructuras de proteínas a temperaturas más altas. Este enfoque puede proporcionar estructuras funcionalmente relevantes y mejorar la comprensión de la dependencia de la temperatura de las estructuras de proteínas.Demostrando el procedimiento estará Yuan-Chih Chang, Gerente de las instalaciones de Academia Sinica Cryo EM. Comience haciendo un agujero de un centímetro en un tubo de centrífuga de 50 milímetros en su extremo cerrado. Coloque el tubo en la cámara del aparato de vitrificación en la salida de agua ultrasónica.Configure la temperatura del aparato de vitrificación a la temperatura especificada y permita que la cámara del aparato de vitrificación alcance los 55 grados centígrados y el 100% de humedad relativa. Déjelo reposar durante al menos media hora para estabilizar las condiciones antes de comenzar el experimento. Coloque el baño de agua en una placa caliente y ajuste la placa caliente a la temperatura deseada.Verifique con un termómetro para asegurarse de que el agua alcance los 55 grados centígrados. Incubar la muestra en el baño maría y precalentar la punta de la pipeta en el borde de la placa caliente durante dos minutos o más antes del experimento de secado. Descarga incandescente una rejilla soportada por carbono agujereado a 25 miliamperios durante 30 segundos.Coloque el papel de filtro de vitrificación en la cámara del aparato de vitrificación no antes de cinco minutos antes del experimento de secado. Incubar las pinzas con la rejilla en el aparato de vitrificación durante dos minutos o más. Construya el recipiente de etano con etano de acuerdo con los procedimientos estándar, asegurándose de que el etano no se desborde.Use una pipeta para aplicar de siete a nueve microlitros de la muestra a la rejilla. Luego espere uno o dos segundos, seque de uno a un segundo y medio y sumerja rápidamente la muestra en etano líquido. Transfiera la rejilla del etano líquido a la caja criogénica almacenada en nitrógeno líquido.Recorte las rejillas y descárguelas para adquirir un microscopio electrónico o un instrumento Cryo EM. Utilice la pantalla de visualización del instrumento Cryo EM y la función de dosis baja del software, para detectar la condición del hielo en la rejilla y la distribución de la muestra en la rejilla. Si la calidad de la rejilla resultante no es buena, repita el proceso de preparación de la rejilla con condiciones variadas, como tiempo de espera, tiempo de borrado, etc.Si la calidad de la rejilla resultante es buena, repita los mismos pasos para hacer rejillas a una temperatura diferente. Transfiera las rejillas de buena calidad a un instrumento Cryo EM de alta resolución. Realizar la recopilación y el análisis de datos de acuerdo con los procedimientos establecidos.En el caso de la cuadrícula exitosa, se formó un gradiente de hielo con hielo más grueso en la parte superior izquierda de la cuadrícula y hielo más delgado en la parte inferior derecha. Se observaron recuadros azules y verdes adecuados para la recolección de datos en la cuadrícula exitosa. Se observó un contraste brillante en la otra cuadrícula.Indicando una capa delgada, de hielo o ausencia de hielo. Solo dos cuadrados resultaron ser adecuados para la recopilación de datos en la segunda cuadrícula. Una de las rejillas consistía en hielo principalmente en forma de cristalina, que no era adecuada para la recopilación de datos.Por otro lado, la otra cuadrícula mostró que la capa de hielo estaba en su mayoría en un estado amorfo adecuado para la recopilación de datos. La preparación del como un contenedor y otros deben completarse de acuerdo con un punto de tiempo. El control del tiempo y terminar el experimento de forma rápida y precisa son lo más importante.Dependiendo de los resultados obtenidos utilizando este protocolo, el investigador puede tener que ser más cuidadoso en la configuración de las condiciones simples.

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