Name: Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a etiquetar vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en explantes de cartílago mediante microscopía confocal. Este protocolo facilita el estudio de terapias para osteoartritis.

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Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124); por el PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares; por la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); por el programa postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro de la FUTURMed, financiado al 50% por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares y al 50% por el FSE; y por el Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

NOTA: Los explantes de cartílago se obtuvieron del Biobanco IdISBa (IB 1995/12 BIO) de conformidad con las directrices institucionales tras la aprobación ética del proyecto por parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparación de la columna
<ol><li>Equilibre las columnas siguiendo las instrucciones del fabricante o de la siguiente manera:<ol>
<li>Retire la tapa de la columna y equilibre la columna. Elimine el búfer de almacenamiento por elución.</li>
		<li>Lave la columna 3 veces con 2,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Durante cada lavado, espere a que la columna absorba todo el volumen. NOTA: No deje secar la columna.</li>
		<li>Cubra la columna con la tapa después del último lavado y hasta la preparación de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etiquetado EV
NOTA: Este protocolo de etiquetado EV utiliza una muestra PL-EV previamente aislada por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) con las condiciones previamente descritas21,22. Sin embargo, cualquier muestra de EV de cualquier fuente se puede utilizar con este protocolo.
<ol><li>Concentre la muestra EV y el control (PBS) utilizando un tubo concentrador.<ol>
<li>Coloque las muestras en un tubo de concentración de 15 ml o 500 μL, dependiendo del volumen inicial de la muestra EV de partida. Centrifugar los tubos de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta obtener una muestra casi seca. NOTA: La muestra de control es necesaria para comprobar si hay fondo de tinte. Aunque este método no requiere ningún volumen inicial específico, se debe considerar que alrededor del 10% de las partículas se perderán durante los pasos de purificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender las muestras concentradas con diluyente C. Resuspend muestras EV con 200 μL y el grupo control con 100 μL y transferirlas a nuevos tubos centrífugos de 1,5 mL.</li>
	<li>Separe la muestra EV en dos alícuotas de 100 μL. Marque una con tinte y úsela como tratamiento (PKH-PL-EV); deje el otro sin marcar, pero procesarlo (NTA-PL-EV) como la muestra EV y úselo para cuantificar la concentración de EV por NTA.</li>
	<li>Prepare 2x solución de colorante, dando como resultado una solución de PKH26 de 8 μM en el diluyente C.</li>
	<li>Mezclar 1 μL de enlazador PKH26 de 1 mM por 125 μL de diluyente C en la muestra. Prepare un volumen necesario para agregar a las muestras en una proporción de 1:1.</li>
	<li>Agregue 2x solución de tinte a PKH-PL-EV y controle muestras en una proporción de 1: 1 para lograr una concentración de colorante de 1x y una concentración de PKH26 de 4 μM. Agregue el mismo volumen de PBS a la muestra NTA-PL-EV. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue una solución de albúmina-PBS sérica bovina al 5% a las muestras en una proporción de 1: 1 y asegúrese de que el volumen final sea de ~ 400 μL. NOTA: Este paso permite la eliminación de interacciones de tinte inespecífico o tinte no unido.</li>
	<li>Proceda a separar los EV etiquetados del tinte no unido y las interacciones no específicas del tinte con la columna.</li>
</ol>3. Aislamiento de EV etiquetado
<ol><li>Retire la tapa de la columna, agregue 400 μL de la muestra (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV o control) y deseche todo el líquido eluido.</li>
	<li>Espere a que la muestra entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso. Añadir 600 μL de PBS y desechar todo el líquido eluido.</li>
	<li>Espere a que el PBS ingrese la columna por completo antes de continuar con el siguiente paso. Añadir 600 μL de PBS y recoger una fracción de 600 μL en un 1,5. tubo centrífugo mL (EV o control). NOTA: Estos pasos son necesarios para eliminar el exceso de tinte de las muestras. Se necesita otra separación por columna para obtener vehículos eléctricos más puros. Por lo tanto, los siguientes pasos deben realizarse en una nueva columna equilibrada (paso 4.1.) o la misma columna después de un paso de lavado inicial (paso 4.2).</li>
	<li>Prepare la columna para un nuevo paso de separación de EV para obtener EV más puros. Si se trata de una columna nueva, repita los pasos 2.1. y 2.2. Si es la misma columna, lave la columna con 2,5 ml de isopropanol al 20% y luego repita los pasos 2.1 y 2.2.</li>
	<li>Agregue 600 μL de evs previamente eluidos obtenidos en el paso 2.5 a la columna y descarte el volumen eluido. Espere a que el líquido entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso.</li>
	<li>Agregue 400 μL de PBS y deseche todo el volumen eluido. Espere a que el líquido entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso.</li>
	<li>Añadir 600 μL de PBS y recoger una fracción de 600 μL en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Utilice los vehículos eléctricos y las muestras de control para análisis adicionales o guárdelos durante la noche a 4 oC.</li>
	<li>Almacene las columnas usadas para su uso futuro.<ol>
<li>Lavar la columna con 25 mL de isopropanol al 20% y desechar el volumen eluido. Lave la columna 3 veces con 2,5 ml de PBS.</li>
		<li>Agregue el búfer de almacenamiento eliminado en el paso 1.1.1 y espere a que el búfer entre en la columna. Cubra la columna con la tapa y guárdela a 4 oC hasta su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cuantificación ev
<ol><li>Prepare diluciones 1:1,000 de la muestra NTA-PL-EV y la muestra pl-EV inicial como se describe en los dos pasos siguientes.<ol>
<li>Preparar 1 mL de NTA-PL-EV diluido 1:10 y 1 mL de PL-EV inicial diluido 1:10 con PBS filtrado a través de un filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Preparar 1 ml de una dilución de 1:100 de las muestras diluidas anteriores con PBS filtrado a través de un filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyecte la muestra de NTA-PL-EV diluida 1:1,000 o la muestra inicial de PL-EV con una jeringa estéril en la bomba NTA. Siga las instrucciones y recomendaciones del fabricante para la determinación de la concentración de partículas y la distribución del tamaño. NOTA: Como la concentración de EV depende del volumen de arranque de la muestra, puede ser necesario leer las diluciones intermedias y realizar ajustes para obtener una determinación correcta de NTA.</li>
</ol>5. EV utilizados como tratamiento para la OA impulsada por la inflamación
<ol><li>Lave el cartílago dos veces con PBS y apóselo con una punción de biopsia de 3 mm de diámetro en condiciones estériles. NOTA: Realice el procedimiento de los pasos 5.1 a 5.6 en una campana de cultivo celular.</li>
	<li>Coloque los explantes en placas de cultivo de 96 pocillos con medio DMEM-F12 suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina a 37 oC, 5% de CO2y 80% de humedad.<ol>
<li>Para establecer un modelo de OA impulsado por la inflamación, complemente el medio de cultivo celular con 10 ng/mL de oncostatina M y 2 ng/mL de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratar los explantes con 1 × 109 partículas/pocillo de EV marcados (PKH-PL-EV) o control en medio de cultivo celular suplementado con oncostatina M y TNFα. NOTA: Mida el volumen de la muestra que contiene 1 × 109 partículas/pozo y utilice el mismo volumen para el control.</li>
	<li>Retire el medio de las placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen explantes de cartílago. Añadir 200 μL del medio de cultivo celular descrito en el paso 5.3 a cada pocillo. NOTA: Si las placas de 96 pocillos han estado en contacto con suero fetal bovino (FBS), lave cada pozo tres veces con 200 μL de PBS para eliminar cualquier EV del FBS.</li>
	<li>Detener el ensayo in vitro en diferentes momentos: 0, 1, 2, 3, 4 y 5 h.</li>
	<li>Lave los pocillos de cultivo celular que contienen los explantes de cartílago dos veces con 200 μL de PBS.</li>
	<li>Añadir 100 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) al tejido para fijarlo durante 3 h a 4 oC. NOTA: Los pasos que involucran PFA deben realizarse en una campana de humos siguiendo las recomendaciones de la Hoja de datos de seguridad.</li>
	<li>Retire el PFA, agregue 100 μL de PBS, almacene el tejido fijo a 4 °C y procese las muestras dentro de las 48 h.</li>
</ol>6. Preparación y visualización de microscopía
NOTA: Este procedimiento histológico consiste en pasos de deshidratación, incrustación de parafina y rehidratación. Estos pasos pueden reducir la fluorescencia general del colorante (una limitación mencionada en la hoja de datos para PKH26). Por lo tanto, otros procedimientos, como la sección congelada, pueden ser más adecuados para la visualización de EV por microscopía confocal.
<ol><li>Incrustar los tejidos fijos en bloques de parafina. Cortar el tejido en secciones de 6 μm de espesor.</li>
	<li>Desparafinar las secciones de tejido. NOTA: Todos los pasos que usan xileno deben realizarse en una campana extractora de humos.<ol>
<li>Sumergir las secciones de tejido en xileno durante 30 min, 100% etanol durante 2 min, 96% etanol durante 2 min, 75% etanol durante 1 min, y finalmente en agua destilada durante 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilizar las secciones de tejido.<ol>
<li>Prepare una solución de citrato de sodio Triton-0.1% al 0.1% para permeabilizar el tejido. Agregue una gota de 20 μL a cada sección de tejido e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave cada sección dos veces con 20 μL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En una diapositiva microscópica, agregue una gota de medio de montaje que contenga 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) con un medio de montaje acuoso para preservar la fluorescencia. Cubra la diapositiva que contiene 3 secciones de tejido del paso 6.3.1.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente, protegidos de la luz.</li>
	<li>Conservar a 4 °C, protegido de la luz hasta la microscopía confocal.</li>
</ol>

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<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las imágenes EV ayudan a comprender las propiedades ev, como sus mecanismos de liberación y absorción. Su imagen permite el seguimiento de su biodistribución y la caracterización de sus propiedades farmacocinéticas como vehículos farmacológicos. Sin embargo, las imágenes y el seguimiento de EV pueden ser difíciles debido a sus pequeños tamaños, aunque se han desarrollado muchos dispositivos de imágenes y técnicas de etiquetado para ayudar a los investigadores a monitorear los EV en condiciones in vitro e in ...

La artrosis (OA) es una enfermedad articular degenerativa que implica una inflamación y destrucción progresiva e irreversible de la matriz extracelular del cartílago articular1. Aunque varias formas de artritis tienen numerosos tratamientos2,3,4,estos están restringidos por sus efectos secundarios y eficacia limitada. Las técnicas de ingeniería tisular que utilizan la implantación autóloga de condrocitos se aplican rutinariamente para el tratamiento regenerativo del cartílago lesionado en lesiones tempranas de cartílago OA4. Las terapias basadas en células están restringidas principalmente debido al número limitado de condrocitos fenotípicamente estables o condroprogenitores capaces de reparar eficazmente el cartílago3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la progresión de la enfermedad y regenerar grandes lesiones de cartílago es de suma importancia.
Las vesículas extracelulares (EV) han sido sugeridas como tratamiento para la OA por diferentes autores5,6. Los EV son cuerpos membranosos secretados por la mayoría de los tipos de células, están involucrados en la señalización intercelular y se ha demostrado que ejercen los efectos terapéuticos de las células madre7,8,9, debido a lo cual recientemente han despertado interés en la medicina regenerativa10. Los EV derivados de células estromales mesenquimales (MSC) son los principales EV terapéuticos investigados para la OA, aunque se han utilizado otras células relacionadas con las articulaciones como fuentes de EV, por ejemplo, condroprogenitores o células inmunes11,12.
Los concentrados plaquetarios, como los lisados plaquetarios (PL), se utilizan para potenciar la cicatrización de heridas en diferentes lesiones, como las úlceras corneales13,14, 15 o en la regeneración del tejido tendinoso16,debido a la hipótesis de que el componente EV de los concentrados plaquetarios puede ser responsable de estos efectos17 . Algunos estudios relacionados con enfermedades relacionadas con las articulaciones utilizan EV derivados de plaquetas (PL-EV) como tratamiento para mejorar las afecciones osteoartríticas. Los PL-EV mejoran la proliferación de condrocitos y la migración celular activando la vía Wnt/β-catenina18,promoviendo la expresión de marcadores condrogénicos en condrocitos osteoartríticos19,o mostrando mayores niveles de proteínas condrogénicas y menos anomalías tisulares en conejos osteoartríticos tratados con PL-EV18.
Los EV contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos que se liberan a la célula diana, estableciendo la comunicación célula a célula, que es la principal característica relacionada con sus aplicaciones terapéuticas20. Los efectos de los vehículos eléctricos dependen de sus células de alcance y posterior liberación de carga. Este efecto puede confirmarse indirectamente por cambios causados en las células, como la actividad metabólica o la modificación de la expresión génica. Sin embargo, estos métodos no permiten la visualización de cómo los EV llegan a las células para ejercer su función. Por lo tanto, este documento presenta un método para etiquetar estos EV derivados de PL para ser utilizados como tratamiento para explantes de cartílago de OA impulsados por la inflamación. Se utilizó microscopía confocal para monitorizar la captación de EV y la progresión a los condrocitos presentes en los explantes en un lapso de tiempo de 5 h.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de centrífuga</td><td>SPL ciencias de la vida</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Preparado al 20% con agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 96 pocillos</td><td>SPL ciencias de la</td> <td>vida</td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Etanol absoluto Pharmpur</td><td>Scharlab ET0006005P</td><td></td><td>Se utiliza para preparar etanol al 96% y al 75% con agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia con émbolo de 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino&nbsp; Albúmina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Preparado al 5% con PBS</td></tr><tr><td>Explantes de cartílago</td> Biobanco <td></td><td></td><td>IdISBa</td></tr><tr><td>Tubo concentrador 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Tubo concentrador 500 &micro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall OD003C33</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX medio</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td> Bloques de tejido de parafina <td></td></tr><tr><td>integrados</td><td>Biobanco</td><td></td> IdISBa <td>Tarifa por servicio</td></tr><tr><td>Columnas mini-HD Exo-spin</td><td>Sistemas de guiado de células</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro; m filtro de jeringa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Prepare una solución madre hasta una concentración final de 0,1 &micro; g/&micro; L diluido en PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Preparado al 4% con PBS y almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 y Dliuent C incluido</td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNFy alfa;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA-005</td><td>Prepare una solución madre hasta una concentración final de 0,01 &micro; g/&micro; L diluido en PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Se utiliza para preparar una solución de citrato de sodio Triton-0.1% al 0.1% con agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>R Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11</td></tr><tr><td>rotor NanoSight NS300</td><td>Dispositivo Malvern</td><td>NS300</td><td>con láser integrado a &lambda;= 532 nm y cámara sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Microtomo manual</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal A78100101 TCS-SPE</td><td>5200000271</td><td></td> <td>Leica Microsystems</td></tr></tbody></table>

etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Las vesículas extracelulares (EV) se utilizan en diferentes estudios para demostrar su potencial como tratamiento libre de células debido a su carga derivada de su fuente celular, como el lisado plaquetario (PL). Cuando se usan como tratamiento, se espera que los EV ingresen a las células diana y efectúen una respuesta a partir de estas. En esta investigación, los EV derivados de PL se han estudiado como un tratamiento libre de células para la osteoartritis (OA). Por lo tanto, se estableció un método para etiquetar los EV y probar su absorción en los explantes de cartílago. Los EV derivados de PL se etiquetan con el tinte lipofílico PKH26, se lavan dos veces a través de una columna y luego se prueban en un modelo de OA impulsado por inflamación in vitro durante 5 h después de la cuantificación de partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Cada hora, los explantes de cartílago se fijan, se parafinan, se cortan en secciones de 6 μm para montar en portaobjetos y se observan bajo un microscopio confocal. Esto permite verificar si los EV ingresan a las células diana (condrocitos) durante este período y analizar su efecto directo.

En la Figura 1se muestra una descripción general esquemática para el etiquetado de vehículos eléctricos y el monitoreo de la absorción. La concentración de partículas y el tamaño de EV detectados por NTA en la Tabla 1 muestran que la concentración de EV disminuye durante el proceso debido al paso de purificación realizado dos veces después del etiquetado con la columna. Sin embargo, la cantidad obtenida está en el rango óptimo del número de partículas a utilizar para el trat...

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Este protocolo simple permite etiquetar los vehículos eléctricos y monitorearlos a través de microscopía confocal. Por ejemplo, las imágenes EV podrían ayudar a evaluar la distribución EV cuando se usan en terapias. Esta técnica permite monitorear la migración y absorción de EV en los explantes de cartílago fácilmente, con microscopía confocal sin ninguna función especial.El mismo protocolo se puede utilizar para vehículos eléctricos para experimentos in vitro o in vivo. Asegúrese de que las columnas estén preparadas de antemano y que el volumen inicial de vehículos eléctricos sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada, teniendo en cuenta que alrededor del 10% de las partículas se perderán durante el paso de purificación. Comience concentrando la muestra de vesícula extracelular, o EV, y el control.Coloque las muestras en un tubo de concentración de 15 mililitros o 500 microlitros, dependiendo del volumen inicial de la muestra EV. Centrifugar los tubos según las instrucciones del fabricante hasta obtener una muestra casi seca. Vuelva a suspender las muestras concentradas de EV con 200 microlitros, y el grupo de control con 100 microlitros de diluyente C, y transfiéralas a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.Separe la muestra EV en dos alícuotas de 100 microlitros cada una. Marque una de las alícuotas con tinte y úsela como tratamiento. Deje el otro sin marcar, pero procese como la muestra EV y úselo para cuantificar la concentración de EV mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas.Prepare la solución de colorante 2x de tal manera que la concentración resultante de la solución de PKH26 en el diluyente C sea de ocho micromolares. Mezcle un microlitro de enlazador PKH26 milimolar por 125 microlitros de diluyente C en la muestra. Prepare el volumen necesario para agregar a las muestras en una proporción de 1:1.Agregue 2x solución de colorante a los EV derivados del lisado plaquetario PKH y muestres de control en una proporción de 1: 1, para lograr una concentración de colorante 1x y una concentración de PKH26 micromolar. Agregue el mismo volumen de PBS a la muestra ev derivada del lisado plaquetario NTA. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue una solución de albúmina-PBS sérica bovina al 5% a las muestras en una proporción de 1: 1 y asegúrese de que el volumen final sea de aproximadamente 400 microlitros. Proceda a separar los EV etiquetados del tinte no unido y las interacciones de tinte no específico con la columna. Retire la tapa de la columna, agregue 400 microlitros de EV derivados del lisado plaquetario PKH, EV derivados del lisado plaquetario NTA o controle y deseche todo el líquido eluido.Espere a que la muestra entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso. Agregue 600 microlitros de PBS y deseche todo el líquido eluido. Espere a que el PBS ingrese la columna por completo antes de continuar con el siguiente paso.Agregue 600 microlitros de PBS y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Para una nueva columna, repita los pasos que implican la concentración de las muestras mencionadas al principio del protocolo. Agregue 600 microlitros de vehículos eléctricos previamente eluidos a la columna y deseche el volumen eluido.Luego agregue 400 microlitros de PBS y deseche todos los volúmenes eluidos. Agregue 600 microlitros de PBS a la columna y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Lave el cartílago dos veces con PBS y apóselo con una punción de biopsia de tres milímetros de diámetro en condiciones estériles.Coloque los explantes en placas de cultivo de 96 pocillos con medio DMEM-F12, complementado con estreptomicina de penicilina al 1% a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y 80% de humedad. Para establecer un modelo de OA impulsado por la inflamación, complemente el medio de cultivo celular con 10 nanogramos por mililitro de oncostatina M y dos nanogramos por mililitro de factor de necrosis tumoral alfa. Tratar los explantes con 1 veces 10 a la 9ª partícula por pocillo de EV derivados del lisado plaquetario PKH, o control, en medio de cultivo celular suplementado con oncostatina M y factor de necrosis tumoral alfa.Retire el medio de las placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen explantes de cartílago. Agregue 200 microlitros del medio de cultivo celular a cada pozo como se describe en el manuscrito. Detenga el ensayo in vitro cada hora de cero a cinco horas.Lave los pocillos de cultivo celular que contienen los explantes de cartílago dos veces con 200 microlitros de PBS. Agregue 100 microlitros de paraformaldehído al 4% al tejido para fijarlo durante tres horas a cuatro grados centígrados. Retire el PFA, agregue 100 microlitros de PBS, almacene el tejido fijo a cuatro grados Celsius y procese las muestras dentro de las 48 horas.Las imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo muestran cómo los EV ingresan al tejido hasta que alcanzan los condrocitos y entran en los condrocitos con el tiempo. Los EV marcados ya estaban localizados alrededor de los condrocitos después de una hora de incubación. Asegúrese de que el volumen inicial de evs sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada.Otra cosa importante a recordar es usar los vehículos eléctricos etiquetados dentro de las próximas 24 horas. Si no lo usa dentro de las 24 horas, puede ocurrir una disminución en la fluorescencia. Esta técnica ayudará a los investigadores a mejorar las imágenes ev y a estudiar los EV en biología y terapéutica.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Objetivo de la presentación es mostrar un método altamente reproducible para generar la matriz asociada implantes de células madre en los defectos del cartílago, que puede ser visualizado con RM. Las células madre son etiquetados con aprobación de la FDA Ferumoxides, mezclado con agarosa, se implantan en los defectos del cartílago y la imagen con un escáner de MR 7T.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

En este video, demostramos un ensayo para visualizar y cuantificar la absorción celular de vesículas extracelulares o EV. Este ensayo utiliza imágenes fluorescentes en 3D utilizando un microscopio confocal y permite distinguir los EV internalizados de los adheridos a la superficie celular.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares: un método para visualizar y cuantificar la captación celular de vesículas extracelulares mediante la técnica de imágenes de fluorescencia 3D

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

Describimos un protocolo para etiquetar pequeñas vesículas extracelulares derivadas de macrófagos con colorantes PKH y observar su captación in vitro y en la médula espinal después del parto intratecal.

Captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la clasificación de las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales. En particular, se centra en el ajuste del instrumento y la optimización de las condiciones de clasificación. El objetivo es clasificar las vesículas extracelulares preservando sus características.

Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares

Aprende a etiquetar vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en explantes de cartílago mediante microscopía confocal. Este protocolo facilita el estudio de terapias para osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

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