Name: Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Aprende una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación. Este método facilita la investigación genética en parasitología.

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La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Comité de Subvenciones para Investigadores de Élite bajo el número de premio 958680 del Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica (NIMAD), Teherán, Irán.

Este estudio fue aprobado por el Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica y el Comité de Revisión de Ética en investigación, No. 958680. Los lentivirus se clasifican como organismos BSL-2; por lo tanto, todos los procedimientos de cultivo de laboratorio en este protocolo se llevaron a cabo utilizando prácticas de laboratorio estériles y se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con las pautas de los NIH. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las diferentes etapas de E. granulosus .
1. Recolección de quistes hidatídicos
<ol><li>Recolecte quistes hidatídicos hepáticos de ovejas infectadas naturalmente que se sacrifican rutinariamente en un matadero.</li>
	<li>Esterilizar completamente la superficie del quiste con gasa estéril y alcohol al 70% antes de aspirar los protoescoces (PSC).</li>
	<li>Aspire 20-50 ml de líquido hidatídico en tubos cónicos estériles de 50 ml.</li>
	<li>Después del drenaje, elimine el quiste con una cuchilla afilada, transfiera la capa germinal a un tubo cónico estéril de 50 ml y agítelo durante un corto período (~ 2 min) para aumentar la acumulación de PSC. Transfiera la capa germinal a un nuevo tubo de 1,5 ml para la caracterización molecular.</li>
	<li>Lave las PSC 3-5x con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Observe las PSC en eosina al 0,1% durante 5 minutos para determinar la viabilidad de la PSC bajo un microscopio de luz. Utilice PSC con al menos un 95% de viabilidad para la cultura.</li>
	<li>Tratar el precipitado de PSC con 2 ml de pepsina (2 mg/ml, pH 2) durante 15-20 min.</li>
	<li>Para aislar PSC individuales, resuspender el sedimento PSC en PBS y pasarlo a través de dos capas de gasa estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. NOTA: Calcule el promedio de tres recuentos en 50 μL de sedimentos PSC utilizando un microscopio de luz. Para ensayos posteriores, utilice el valor estimado para determinar las PSC/μL. Cada aislado de quiste hidatídico debe caracterizarse en base a polimorfismos de nucleótidos por métodos moleculares, como la secuenciación por PCR17 o el análisis de la curva de fusión de alta resolución18.</li>
</ol>2. Cultivo bifásico de PSCs de E. granulosus para obtener gusanos adultos
NOTA: Las PSC aisladas deben cultivarse en condiciones estériles bajo un gabinete de flujo laminar Clase II. Prepare las fases sólida y líquida del medio de cultivo bifásico por separado antes de continuar con los siguientes pasos19.
<ol><li>Preparar el medio de cultivo bifásico para que conste de dos fases.<ol>
<li>
Para la fase sólida, añadir 10 ml de suero bovino a un matraz de 25 ml y dejar coagular a 76 °C durante 20-30 min.</li>
		<li>
Para la fase líquida (CMRL modificado), mezcle 100 ml de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 36 ml de extracto de levadura al 5%, 5,6 ml de glucosa al 30 % (en agua destilada), 1,4 ml de bilis de perro al 5 % en PBS, tampón HEPES de 20 mM y 10 mM naHCO3 en 260 ml de medio CMRL-1066. Finalmente, agregue penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) a la mezcla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 ml del medio en fase líquida a cada matraz de cultivo de25 cm 2 .</li>
	<li>Agregue ~ 5,000 PSC al matraz de cultivo y transfiera el matraz a la incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2).</li>
	<li>Después de 24-48 h, transfiera las PSC a un nuevo matraz con la fase sólida (suero bovino) y agregue 1 ml del mismo medio de fase líquida fresca por matraz. Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Cada 5-7 días, reemplace el medio con un medio de fase líquida fresca en función de los cambios en el color del medio de cultivo y la proporción estimada de PSC diferenciadas. NOTA: Los protoescoleces responden rápidamente a los cambios ambientales después de ser cultivados, y la mayoría de ellos experimentan diferenciación dentro de 2-3 semanas. Debido al consumo de nutrientes y al crecimiento y desarrollo de los protoscoleces, el pH del medio de cultivo cambia y su color cambia hacia el naranja y el amarillo.</li>
</ol>3. Cultivo monofásico de PSCs de E. granulosus
<ol><li>Asegúrese de que el cultivo monofásico se realiza 24-48 h antes de la transducción.<ol>
<li>Cultivo ~ 5,000 PSCs en un matraz de cultivo de 25 cm2 con RPMI y suero bovino fetal al 10% (FBS).</li>
		<li>Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2) hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cultivo celular para la producción y preparación de virus
NOTA: Las células 293T (HEK293T) del riñón embrionario humano se obtuvieron para la producción de vectores del Centro de Investigación de Patología y Células Madre de la Universidad de Ciencias Médicas de Kerman.
<ol><li>Transfiera 5 × 105 células HEK293T a un matraz de25 cm 2 que contenga 5 ml de DMEM con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.</li>
	<li>Incubar las células HEK293T a 37 °C en 5% de CO2 y pasarlas en el medio de cultivo completo cada 48 h. Finalmente, utilice células HEK293T de paso bajo para la transducción20.</li>
</ol>5. Producción y preparación del virus con los vectores lentivirales de tercera generación
NOTA: El vector lentivirus pCDH513b (vector de transferencia) y PLPII, PLPI y PMD2G (vectores ayudantes) se utilizaron para expresar el gen reportero GFP. Véase la Tabla de Materiales y la Figura Suplementaria S1.
<ol><li>Día 1:<ol>
<li>Después de tripsinizar las células HEK293T21 en placas de cultivo de 6 pocillos, sembrar 7 × 104 células por pozo con DMEM fresco libre de antibióticos que contiene 10% de FBS.
</li>
		<li>Utilice células con una confluencia del 50% al 60% para la transducción por el método del fosfato de calcio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 2:<ol>
<li>Reemplace el medio de cultivo celular 2-3 h antes del experimento con DMEM fresco libre de antibióticos que contenga 2% de FBS.</li>
		<li>En un tubo de 1,5 ml, mezcle los plásmidos lentivirales de tercera generación, incluidos 7 μg/μL pCDH513b (vector de transferencia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI y 2 μg/μL PMD2G (vectores auxiliares).</li>
		<li>Agregue el tampón HEPES (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES y 1.5 mM Na2HPO4; rango de pH óptimo, 7.00-7.28) a la mezcla a un volumen de 422 μL.</li>
		<li>Agregue 16 μL de tampón Tris-EDTA (TE) al 1% a la mezcla.</li>
		<li>Añadir 62 μL de cloruro de calcio de 2,5 mM a los tubos y mezclar bien.</li>
		<li>Agregue 500 μL de solución salina tamponada (HBS) 2x HEPES a la mezcla, gota a gota, dentro de 1-2 min usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente hasta obtener una solución semiopaca, e incubar la mezcla durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos.</li>
		<li>Incubar las placas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% y reemplazar el medio después de 4-6 h con DMEM libre de antibióticos que contenga 10% de FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3:<ol>
<li>Confirme el éxito de la transducción transitoria y la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 4:<ol>
<li>Cosechar los virus del medio de cultivo recolectando el sobrenadante de cada pozo y almacenarlos a -70 °C hasta su uso. NOTA: Los lentivirus cosechados podrían concentrarse y titularse para una transfección precisa22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Transducción transitoria de diferentes etapas de E. granulosus con el virus
<ol><li>Día 1:<ol>
<li>Use una placa de cultivo de 12 pocillos para la transferencia de genes. Cultivo 5 × 103-5 × 104 células HEK293T en triplicado, con medio DMEM completo como referencia interna.</li>
		<li>Cultiva 150 PSCs frescos por triplicado en RPMI y 10% FBS.</li>
		<li>Cultivo de 30 gusanos estrobilados por triplicado en DMEM que contienen un 10% de FBS inactivado por calor. NOTA: Todos los medios de transducción deben estar libres de antibióticos. Mantenga tres pozos de control no tratados para células HEK293T, PSC y gusanos estrobilados en el proceso.</li>
		<li>Preparar una mezcla de 1 × 106 virus con reactivo de transfección de 4 μg/ml (ver la Tabla de Materiales) para transducir las células HEK293T y las diferentes etapas del gusano.</li>
		<li>Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos. Incubar las placas durante 4-6 h en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2). Reemplace el medio para cada muestra con el mismo medio de cultivo completo para minimizar los efectos tóxicos del reactivo de transfección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 2:<ol>
<li>Repita los pasos 6.1.4-6.1.5 para aumentar la eficiencia de la transducción transitoria para las células HEK293T, las PSC y los gusanos estrobilados.</li>
		<li>Incubar todas las placas durante 24-48 h en una incubadora de CO2 con las mismas condiciones de cultivo en función del tipo de medio celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3:<ol>
<li>Compruebe si la transducción es exitosa mediante el uso de microscopía de fluorescencia. NOTA: Considere el uso de ensayos confirmatorios adicionales como PCR / qPCR20,23 o técnicas de Western blotting24 en el procedimiento de transferencia de genes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Borhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcoses+in+Iran%2C+Turkey%2C+and+Pakistan%3A+Old+diseases+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium.</a> Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).</li>
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<li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).</li>
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<li>Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+transgenic+schistosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Establishing transgenic schistosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Comprender las bases moleculares de los nematodos y la biología de Platyhelminthes es crucial para comprender la patogenicidad de los parásitos zoonóticos27. La falta de un sistema eficaz de evaluación de genes es un obstáculo importante para la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus 12,27. El presente estudio demuestra el excelente potencial del lentivirus...

La equinococosis quística (CE) es una de las enfermedades helmínticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia dentro de la familia Taeniidae 1,2. Se han llevado a cabo extensos estudios sobre el inmunodiagnóstico y el desarrollo de vacunas para E. granulosus. Sin embargo, el conocimiento inadecuado sobre las bases moleculares de la biología del parásito plantea importantes limitaciones en el diagnóstico, manejo y prevención de la enfermedad hidatídica 3,4,5,6.
En los últimos años, debido al desarrollo de la secuenciación del genoma y los métodos transcriptómicos, varios grupos de investigación 7,8,9 han realizado una amplia gama de estudios moleculares sobre gusanos planos. Sin embargo, en el mundo de los parásitos, los avances en la tecnología de transferencia de genes en gusanos planos parásitos siguen siendo limitados en comparación con los métodos de transducción transitoria altamente reproducibles desarrollados para algunos protozoos 10,11,12.
El uso de sistemas de administración viral se ha convertido en una herramienta esencial para la administración de transgenes y las investigaciones de genes / proteínas en las últimas dos décadas13. El lentivirus infecta tanto a las células en división como a las que no se dividen, lo que permite infectar las células postmitóticas 14,15,16. La evidencia reciente indica que el uso de un sistema de transducción basado en lentivirus en células de mamíferos ofrece el potencial de superar la mayoría de las limitaciones de las técnicas anteriores de knock-in/knock-down. El diseño y construcción de vectores lentivirales de expresión con marcadores moleculares apropiados, como la expresión GFP, han sido descritos previamente16. Por lo tanto, evaluamos la transducción transitoria lentiviral de un gen reportero GFP en los protoescoleces y gusanos estrobilados de E. granulosus.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo de 12 pocillos</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de 25 cm2</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>Concentración de trabajo: 2.5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>incubadora memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Bilis</td><td></td><td></td><td>de perro Aislado de un perro sacrificado y esterilizado por 0.2 &mu; m filtro de jeringa</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td>preparar 0.1% de Eosina para la prueba de exclusión</td></tr><tr><td>de trabajo Suero fetal bovino (FBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>Inactivación de calor&nbsp; de&nbsp; FBS (30 min en 40 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Suero de ternera fetal (FCS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>Inactivación del calor&nbsp; de&nbsp; FCS (30 min en 40 &deg; C)</td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>Riñón embrionario humano 293T</td></tr><tr><td>HEPES solución salina tamponada (HBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x concentrado</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU Concentración de</td><td>trabajo: 100 UI/mL</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Roche</td><td>10108057001</td><td>Concentración de trabajo: 2 mg/mL, pH 2</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td><td>Este reactivo se resuelve en menos de 1 min en D.W</td></tr><tr><td>Polybrene (reactivo de transfección)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Medio RPMI</td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>Concentración de trabajo: 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Plásmido lentiviral de tercera generación (pCDH513b)</td><td>SBI System Biosciences (BioCat GmbH)</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>Vector de transferencia (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)</td></tr><tr><td>Plásmido lentiviral de tercera generación (pLPI y pLPII)</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>K4975-00</td><td>Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)</td></tr><tr><td>Plásmido lentiviral de tercera generación (pMD2G)</td><td></td><td>Plásmido Addgene 12259</td><td>Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)</td></tr><tr><td>Tampón Tris/EDTA (TE)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x soluciones de trabajo (pH 7.4&ndash; 7.6)</td></tr></tbody></table>

transducción transitoria de las formas estrobiladas de echinococcus granulosus

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

La equinococosis quística o enfermedad hidatídica es una de las enfermedades parasitarias zoonóticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia que se alberga en el intestino de los caninos. Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada para comprender los mecanismos de patogénesis y control y prevención de enfermedades. Sin embargo, la falta de un sistema eficaz de evaluación de genes impide la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus . El presente estudio demuestra el potencial de transducción transitoria del gen lentiviral en las formas metacestoide y estrobilada de E. granulosus. Los protoescoleces (PSC) se aislaron de quistes hidatídicos y se transfirieron a medios de cultivo bifásicos específicos para convertirse en gusanos estrobilados. Los gusanos fueron transfectados con lentivirus cosechados de tercera generación, junto con células HEK293T como control del proceso de transducción. Se detectó una pronunciada fluorescencia en los gusanos estrobilados durante 24 h y 48 h, lo que indica una transducción lentiviral transitoria en E. granulosus. Este trabajo presenta el primer intento de transducción transitoria basada en lentivirus en tenias y demuestra los resultados prometedores con implicaciones potenciales en estudios experimentales sobre la biología de los gusanos planos.

Aquí, describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en E. granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos PSCs en un medio de cultivo bifásico para obtener gusanos estrobilados, como se describió anteriormente25,26. Los protoscoleces se convierten en gusanos estrobilados después de 6 semanas in vitro. Se observaron diferentes etapas de E. granulosus en el medio de cultivo bi...

Describimos una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación.

Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Transacción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus. Describimos una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación. La equinococosis quística o enfermedad hidatídica es una de las enfermedades parasitarias zoonóticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia que se alberga en el intestino de los caninos.Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada para comprender los mecanismos de patogénesis y el control y la prevención de enfermedades. Sin embargo, la falta de un sistema eficaz de evaluación de genes impide la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus. Los avances en la transferencia de genes en gusanos planos parásitos siguen siendo limitados en comparación con el parásito protozoario.El uso del sistema de administración viral se ha convertido en una herramienta esencial para la entrega de transgenes y la investigación de genes / proteínas en las últimas dos décadas. Así que evaluamos la transducción transitoria lentiviral del gen reportero GFP a los protoescoleces y gusanos estrobilados de Echinococcus granulosus. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las etapas de Echinococcus granulosus.Uno, la recolección de quistes hidatídicos. Recolecte quistes hidatídicos hepáticos de ovejas infectadas naturalmente que se sacrifican rutinariamente en un matadero. Esterilizar completamente la superficie del quiste con gasa estéril y alcohol al 70% antes de aspirar los protoescoleces.Aspire de 20 a 50 ml de líquido hidatídico en tubos cónicos estériles de 50 ml. Después de drenar, borre el quiste con una cuchilla afilada, transfiera la capa germinal a un tubo cónico estéril de 50 ml y agítelo durante un corto período para aumentar la acumulación de protoescoces. Lave los protoescoces con tampón PBS de tres a cinco veces.Observe los protoescoleces en 0,1% de eosina durante cinco minutos para determinar la viabilidad de los protoscoleces bajo un microscopio de luz. Utilizar protoscoleces con al menos un 95% de viabilidad para el cultivo. Trate el precipitado de protoescoleces con dos ml de pepsina durante 15 a 20 minutos.Para aislar protoescoleces individuales, resuspenda el sedimento de protoscoleces en PBS y páselo a través de dos capas de gasa estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. Dos, cultivo bifásico de protoscoleces de Echinococcus granulosus para obtener gusanos adultos. Añadir 10 ml del medio en fase líquida a cada matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros.Añadir aproximadamente 5.000 protoescoleces al matraz de cultivo y transferirlo a la incubadora de CO2. Después de 24 a 48 horas, transfiera los protoescoleces a un nuevo matraz con la fase sólida y agregue un ml del mismo medio de fase líquida fresca por matraz. Transfiera los matraces a la incubadora, 37 grados centígrados, 5% co2.Cada cinco a siete días, reemplace el medio con un medio de fase líquida fresca. Tres, cultivo monofásico de protoscoleces de un Echinococcus granulosus. Asegúrese de que el cultivo monofásico se realice de 24 a 48 horas antes de la transducción.Cultiva aproximadamente 5.000 protoescoleces en un matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros con RPMI y 10%FBS. Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 hasta su uso. Cuatro, cultivo celular para la producción y preparación de virus.Transfiera 500. 000 células HEK a un matraz cuadrado de 25 centímetros que contenga 5 ml de DMEM con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina. Incubar las células HEK2 a 37 grados centígrados en un 5% de CO2 y pasarlas en el medio de cultivo completo cada 48 horas. Finalmente, utilice células HEK de paso bajo para la transducción.Cinco, producción y preparación del virus con los vectores lentivirales de tercera generación. El primer día, después de tripsinizar las células HEK en placas de cultivo de 6 pocillos, sembrar 70, 000 células por pozo con DMEM fresco libre de antibióticos que contiene 10% FBS. Utilice células de 50 a 60% de confluencia para la transducción por el método de fosfato de calcio.Día dos, reemplace el medio de cultivo celular dos o tres horas antes del experimento con DMEM fresco libre de antibióticos que contenga 2% de FBS. En un tubo de 1,5 ml, mezcle plásmidos lentivirales de tercera generación, incluidos 7 microgramos/vector de transferencia pCDH513b de microlitro, PLPII de 4 microgramos/microlitro, PLPI de 4 microgramos/microlitro y 2 vectores auxiliares PMD2G de microgramos/microlitro. Agregue el tampón HEPES a la mezcla para alcanzar el volumen de 422 microlitros.Agregue 16 microlitros de tampón 1% TE a la mezcla. Agregue 62 microlitros de cloruro de calcio de 2.5 ml a los tubos y mezcle bien. Agregue 500 microlitros de tampón HBS 2x a la mezcla, gota a gota en uno o dos minutos con una pipeta Pasteur.Mezclar suavemente hasta obtener una solución semiopaca e incubar la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al final, añade la mezcla a cada plato lentamente y distribúyela con movimientos circulares lentos. Incubar las placas a 37 grados Celsius en una incubadora de 5% de CO2 y reemplazar el medio después de cuatro a seis horas con DMEM libre de antibióticos que contenga 10% de FBS.Día tres, confirme la transducción transitoria exitosa y la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia invertida. Día cuatro, cosechar virus del medio de cultivo recolectando el sobrenadante de cada pozo y almacenarlos a 70 grados centígrados negativos hasta su uso. Seis, transducción transitoria de diferentes estadios de Echinococcus granulosus con el virus.El primer día, use una placa de cultivo de 12 pocillos para la transferencia de genes. Cultivo de 5.000 a 50.000 células HEK en triplicados con un medio DMEM completo como referencia interna. Cultivo 150 protoescoleces frescos en triplicados en RPMI y 10%FBS.Cultiva 30 gusanos estrobilados por triplicado en DMEM y FBS 10% inactivado por calor. Prepare una mezcla de 1 millón de virus con cuatro microgramos/ml de reactivo de transfección para transducir las células HEK y las diferentes etapas del gusano. Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos.Incubar las placas durante cuatro a seis horas en una incubadora de CO2, 37 grados Centígrados, 5% CO2. Reemplace el medio para cada muestra con el mismo medio de cultivo completo para minimizar los efectos tóxicos de los reactivos de transfección. Día dos, repita dos pasos anteriores para aumentar la eficiencia de la transducción transitoria para las células HEK, protoescoces y gusanos estrobilados.Incubar todas las placas durante 24 a 48 horas en una incubadora de CO2 con las mismas condiciones de cultivo en función del tipo de medio celular. Día tres, asegúrese de que la transducción sea exitosa mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Resultados representativos.Aquí describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en Echinococcus granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos protoescoleces en medios de cultivo bifásicos para obtener gusanos estrobilados según nuestros estudios previos. Los protoescoleces se desarrollan en los gusanos estrobilados después de un cultivo in vitro de seis semanas.Se observaron diferentes etapas de Echinococcus granulosus en el medio de cultivo bifásico, incluyendo protoscoleces invaginados, Figura 2A, protoscoleces evaginados, Figura 2B, y gusanos estrobilados con primera y tercera formación proglotides, Figura 2C a E.Protoscoleces y los gusanos estrobilados obtenidos de cultivos monofásicos y bifásicos, respectivamente, fueron transfectados por lentivirus que expresan GFP, Figura 3. Las células HEK expresaron claramente la GFP como control transitorio del proceso de transducción. Los gusanos adultos expresaron GFP más claramente en la capa tegumental.Sin embargo, los protoescoleces han demostrado un nivel algo más bajo de expresión de GFP después de 48 horas. Algunos residuos de líquido de quiste y/o restos de la capa germinal alrededor de los protoscoleces causaron algún fondo de fluorescencia en las muestras transfectadas. La intensidad de la fluorescencia en las células HEK y los gusanos estrobilados aumentó después de 24 y 48 horas.Comprender las bases moleculares de los nematodos y la biología de Platyhelminthes es una de las fronteras más importantes en la patogenicidad de los parásitos zoonóticos. La falta de un sistema eficaz de evaluación de genes es un obstáculo importante para la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus. El objetivo principal de este trabajo fue ilustrar el proceso de transducción vectorial lentiviral que será crítico en la futura investigación de la equinococosis.Los resultados muestran que los gusanos estrobilados son más sensibles a la transducción transitoria del gen que los protoscoleces, que pueden ser el resultado de una extensa estructura tegumental en las formas estrobiladas. Sin embargo, debido a la naturaleza de la transducción lentiviral, la intensidad de la fluorescencia en los protoescoces multicelulares y los gusanos estrobilados suele ser mucho menor que en las células HEK monocapa. Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada a nivel genómico y transcriptómico para Echinococcus, así como una amplia variedad de sistemas modelo de gusanos planos parásitos y de vida libre.Por lo tanto, el desarrollo del proceso de transferencia de genes a las tenias allana el camino para el uso potencial de las nuevas técnicas, como el mapeo de genes basado en virus o la edición de genes mediada por CRISPR-Cas9. Este trabajo presenta la transducción lentiviral en un modelo de tenia y demuestra resultados prometedores con implicaciones potenciales para la biología del gusano plano. Sin embargo, se requieren estudios más profundos para mejorar los métodos y desarrollar la aplicabilidad de estas técnicas para futuros experimentos.

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Research

Investigación

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Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus

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