Name: Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a realizar imágenes ópticas mesoscópicas del corazón completo de ratón mediante microscopía de hoja de luz y técnicas de aclarado tisular. Este método preserva la organización tridimensional para estudios cardiovasculares.

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Este proyecto ha recibido fondos del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 952166 (REPAIR), MUR bajo el programa FISR, proyecto FISR2019_00320 y Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, proyecto PERCARE.

Todas las manipulaciones y procedimientos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y se ajustaron a los principios y reglamentos del Ministerio de Salud italiano. El protocolo experimental fue aprobado por el Ministerio de Salud italiano (número de protocolo 647/2015-PR). Todos los animales fueron proporcionados por ENVIGO, Italia. Para estos experimentos, se utilizaron 5 ratones machos C57BL / 6J de 6 meses de edad.
1. Preparación de la solución
<ol><li>Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.6) en una campana química. Conservar las alícuotas de PFA al 4% a -20 °C durante varios meses.</li>
	<li>Preparar solución de hidrogel: Mezclar 4% de acrilamida, 0,05% de bis-acrilamida, 0,25% de iniciador AV-044 en 0,01 M PBS en una campana química. Mantenga los reactivos y la solución en hielo durante toda la preparación. Conservar las alícuotas de hidrogel a -20 °C durante varios meses.</li>
	<li>Preparar solución de limpieza: Mezclar 200 mM de ácido bórico, 4% de dodecil-sulfato de sodio (SDS) en agua desionizada; pH 8.6 en una campana química. Conservar la solución entre 21-37 °C para evitar la precipitación SDS.</li>
	<li>Prepare una solución fresca de Tyrode el día del experimento: añadir 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 y 4,7 mM de KCl; valorar a pH 7,4 utilizando 1 M NaOH.</li>
</ol>2. Aislamiento del corazón
<ol><li>Inyecte 0.1 ml de heparina 500 U.I. por vía subcutánea 30 min antes del procedimiento de aislamiento cardíaco.</li>
	<li>Llene una jeringa de 30 ml y tres placas de Petri de 6 cm con una solución fresca de Tyrode. Haga una pequeña grieta (3-4 mm de profundidad) en el borde de una de las placas de Petri y colóquela bajo un microscopio estereoscópico.</li>
	<li>Fije una cánula de 1 mm de diámetro a la jeringa e insértela en la grieta de la placa de Petri. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa.</li>
	<li>Llene una jeringa de 20 ml con PFA al 4% y manténgala en la campana química. Prepare una placa de Petri vacía debajo del capó.</li>
	<li>Anestesiar al ratón con isoflurano/oxígeno al 3% a un caudal de 1,0 L/min y sacrificarlo por luxación cervical de acuerdo con las normas de bienestar animal vigentes.</li>
	<li>Después del sacrificio, retire el pelaje sobre el pecho y abra el pecho para tener acceso completo al corazón.</li>
	<li>Aísle el corazón, sumérjalo en la placa de Petri previamente llena con 50 ml de solución Tyrode. Use tijeras quirúrgicas para cortar la aorta inmediatamente cerca del arco aórtico para exponer el corazón.</li>
	<li>Transfiera el corazón bajo un microscopio estereoscópico y realice cuidadosamente la canulación con cuidado. No inserte la cánula demasiado profundamente en la aorta (no más de 2 mm) para evitar daños tisulares.</li>
	<li>Use una pequeña pinza y una sutura (tamaño 5/0) para fijar el corazón a la cánula.</li>
	<li>Perfundir el corazón con 30 ml de la solución Tyrode con una presión constante de 10 ml/min para eliminar la sangre de los vasos.</li>
	<li>Separe la cánula de la jeringa y coloque el corazón en la placa de Petri llena de solución Tyrode. Tenga cuidado de no tener burbujas de aire en la cánula; De lo contrario, retire las burbujas de aire correctamente.</li>
	<li>Conecte la jeringa de 20 ml llena de PFA fría al 4% en la cánula y perfunda el corazón a la misma presión constante.</li>
	<li>Incubar el corazón en 10 ml de PFA al 4% a 4 °C durante la noche (O/N). Para evitar la degradación del tejido, realice los pasos 2.6-2.13 en el menor tiempo posible.</li>
</ol>3. Limpieza del corazón
<ol><li>Al día siguiente, lavar el corazón en 0,01 M PBS 3 veces a 4 °C durante 15 min. NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0,01% de azida de sodio (NaN3) a 4 °C durante varios meses.</li>
	<li>Incubar el corazón en 30 ml de solución de hidrogel agitando (15 rpm) a 4 °C durante 3 días.</li>
	<li>Desgasifique la muestra a temperatura ambiente usando un secador, una bomba de vacío y un sistema de tubos que conecta el secador tanto a la bomba como a una tubería de nitrógeno.<ol><li>Coloque la muestra en la secadora y abra el vial, manteniendo la tapa sobre él.</li>
		<li>Cierre la secadora y retire el oxígeno del tubo abriendo la tubería de nitrógeno.</li>
		<li>Encienda la bomba de vacío para eliminar el oxígeno de la secadora durante 10 minutos.</li>
		<li>Apague la bomba y use la perilla de la secadora para abrir la tubería de nitrógeno. Una vez que la presión sea igual a la presión atmosférica, abra con cuidado el secador y cierre rápidamente el vial.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantener el corazón en la solución de hidrogel desgasificado a 37 °C durante 3 h en reposo.</li>
	<li>Cuando el hidrogel esté correctamente polimerizado y parezca completamente gelatinoso, retire con cuidado el corazón y colóquelo en el portamuestras.</li>
	<li>Inserte el portamuestras con el corazón en una de las cámaras de limpieza y ciérrelo correctamente para evitar fugas de la solución de limpieza.</li>
	<li>Encienda el baño de agua donde se coloca el recipiente de la solución de limpieza y la bomba peristáltica para iniciar la recirculación de la solución de limpieza.</li>
	<li>Cambie la solución de limpieza en el contenedor una vez a la semana para acelerar el procedimiento de clarificación.</li>
</ol>4. Tinción de la membrana celular
<ol><li>Una vez que el corazón aparezca completamente aclarado, retírelo del portamuestras y lávelo en 50 ml de PBS calentado durante 24 h. Lavar de nuevo en 50 mL de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) durante 24 h.</li>
	<li>Incubar la muestra en 0.01 mg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA) - Alexa Fluor 633 en 3 mL de PBS-T 1x en agitación (50 rpm) a temperatura ambiente durante 7 días.</li>
	<li>Después de la incubación de 7 días, lavar la muestra en 50 ml de PBS-T 1x a temperatura ambiente agitando durante 24 h.</li>
	<li>Incubar la muestra en PFA al 4% durante 15 minutos y luego lavarla 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una. NOTA: Después de este paso, el corazón puede almacenarse en PBS + 0.01% NaN3 a 4 °C durante varios meses.</li>
	<li>Incubar el corazón en concentraciones crecientes de 2,2′-tiodietanol (TDE) en 0,01 M PBS (20% y 47% TDE/PBS) durante 8 h cada una, hasta la concentración final de 68% TDE en 0,01 M PBS para proporcionar el índice de refracción requerido (RI = 1,46). Este es el medio de coincidencia de RI (RI-medium) para adquirir imágenes16.</li>
</ol>5. Montaje y adquisición del corazón
NOTA: Todos los componentes del sistema óptico se enumeran en detalle en la Tabla de materiales.
<ol><li>Llene suavemente aproximadamente el 80% de la cubeta externa (cuarzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) con el medio RI. NOTA: Aquí es posible utilizar diferentes soluciones no volátiles que garantizan un RI de 1,46.</li>
	<li>Llene suavemente la cubeta interna (cuarzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) con el mismo medio RI.</li>
	<li>Sumerja la muestra dentro de la cubeta interna. Las incubaciones de muestras descritas anteriormente permiten que la muestra permanezca estable dentro del medio RI sin ser retenida.</li>
	<li>Mueva suavemente la muestra hasta el fondo de la cubeta con pinzas finas y coloque el corazón con su eje longitudinal paralelo al eje principal de la cubeta para minimizar la trayectoria de la luz de excitación a través del tejido durante la exploración.</li>
	<li>Fije suavemente el tapón hecho a medida sobre la cubeta interna con dos tornillos.</li>
	<li>Monte la muestra en la etapa de microscopio usando los imanes.</li>
	<li>Traduzca la etapa de muestra vertical manualmente para sumergir la cubeta interna en la externa.</li>
	<li>Encienda la fuente de luz de excitación (longitud de onda de 638 nm), estableciendo una potencia baja (del orden de 3 mW).</li>
	<li>Mueva la muestra utilizando el traductor motorizado para iluminar un plano interno del tejido.</li>
	<li>Encienda el software de imágenes (HCImageLive) y configure el disparador de la cámara en modo externo (hoja de luz) para controlar el disparador de adquisición de la cámara mediante el software personalizado que controla toda la configuración.</li>
	<li>Active el guardado automático en el panel Configuración de escaneo y establezca la carpeta de salida donde se deben guardar las imágenes.</li>
	<li>Ajuste manualmente la posición de la muestra en el plano XY con los traductores lineales para mover la muestra al centro del FoV del sensor de la cámara.</li>
	<li>Mueva la muestra a lo largo del eje Z utilizando el traductor motorizado lineal para identificar los bordes del corazón para la reconstrucción tomográfica.</li>
	<li>Aumente la potencia del láser a ~ 20 mW, listo para la sesión de imágenes.</li>
	<li>Inicie la adquisición tomográfica, haga clic en el botón Inicio en el panel Secuencia del software de imágenes y, al mismo tiempo, mueva la muestra a lo largo del eje Z a una velocidad constante de 6 μm/s utilizando el traductor motorizado.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Nada que revelar.

En este trabajo, se introdujo un enfoque exitoso para limpiar, teñir e imaginar un corazón de ratón completo en alta resolución. En primer lugar, se optimizó y realizó un protocolo de transformación tisular (CLARITY), ligeramente modificado para su aplicación en el tejido cardíaco. De hecho, para obtener una reconstrucción eficiente en 3D de todo un corazón, es esencial prevenir el fenómeno de la dispersión de la luz. La metodología CLARITY nos permite obtener un corazón intacto altamente transparente, pero requiere larg...

La remodelación estructural asociada a enfermedades cardíacas puede afectar la conducción eléctrica e introducir disfunciones electromecánicas del órgano 1,2. Los enfoques actuales utilizados para predecir alteraciones funcionales comúnmente emplean MRI y DT-MRI para obtener una reconstrucción general de la deposición de fibrosis, el árbol vascular y la distribución de fibras del corazón, y se utilizan para modelar las rutas de propagación del potencial de acción preferencial (APP) a través del órgano 3,4. Estas estrategias pueden proporcionar una hermosa visión general de la organización del corazón. Sin embargo, su resolución espacial es insuficiente para investigar el impacto de la remodelación estructural en la función cardíaca a nivel celular.
Colocar este marco en un orden de magnitud diferente, donde las células individuales pueden desempeñar papeles individuales en la propagación del potencial de acción, es un desafío. La principal limitación es la ineficiencia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución (resolución micrométrica) en tejidos masivos (de tamaño centímetro). De hecho, la obtención de imágenes de tejidos biológicos en 3D a alta resolución es muy complicada debido a la opacidad del tejido. El enfoque más común para realizar reconstrucciones 3D en órganos enteros es preparar secciones delgadas. Sin embargo, la sección precisa, el ensamblaje y las imágenes requieren un esfuerzo y tiempo significativos. Un enfoque alternativo que no exige cortar la muestra es generar un tejido transparente. Durante los últimos años, se han propuesto varias metodologías para clarificar tejidos 5,6,7,8. El desafío de producir tejidos masivos, transparentes y marcados con fluorescencia se ha logrado recientemente mediante el desarrollo de verdaderos enfoques de transformación de tejidos (CLARITY9, SHIELD10). En particular, el método CLARITY se basa en la transformación de un tejido intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite conferir una alta transparencia mediante la eliminación selectiva de bicapas lipídicas de membrana. Cabe destacar que este método ha sido encontrado exitoso también en la preparación cardíaca11,12,13,14. Sin embargo, dado que el corazón es demasiado frágil para ser adecuado para una limpieza activa, debe limpiarse utilizando el enfoque pasivo, que requiere mucho tiempo para conferir una transparencia completa.
En combinación con técnicas avanzadas de imagen como la microscopía de hoja de luz, CLARITY tiene el potencial de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos en 3D a resolución micrométrica. En la microscopía de lámina de luz, la iluminación de la muestra se realiza con una lámina delgada de luz confinada en el plano focal del objetivo de detección. La emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación15. La arquitectura de detección es similar a la microscopía de campo amplio, lo que hace que la adquisición sea mucho más rápida que los microscopios de barrido láser. El desplazamiento de la muestra a través de la lámina de luz permite obtener una tomografía completa de muestras grandes, de hasta un centímetro de tamaño. Sin embargo, debido a las propiedades intrínsecas del haz gaussiano, es posible obtener una lámina de luz muy delgada (del orden de unas pocas micras) solo para una extensión espacial limitada, lo que limita drásticamente el campo de visión (FoV). Recientemente, se ha introducido un novedoso esquema de excitación para superar esta limitación y se ha aplicado para imágenes cerebrales, permitiendo reconstrucciones 3D con resolución isotrópica16.
En este documento, se presenta un enfoque de compensación pasiva, lo que permite una reducción significativa del tiempo de compensación necesario para el protocolo CLARITY. El marco metodológico descrito aquí permite reconstruir un corazón de ratón completo con resolución micrométrica en una sola exploración tomográfica con un tiempo de adquisición del orden de minutos.

<table><tbody><tr><td>2-2' Thiodiethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Iniciador</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca flash 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Software de la cámara</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Lente</td> de colimación de imágenes <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Brazo de detección</td><td>Óptica integrada</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Lente de excitación</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; cubeta de cuarzo nal</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Espejos plegables</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Espejo galvanométrico</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta interna de cuarzo</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fuente láser</td><td>Óptica integrada</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso largo</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Base magnética</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Traslatador motorizado</td><td>Instrumento Physisk</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T Lente</td><td></td></tr> de <tr><td>relé</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Lente</td><td>de tubo Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lente sintonizable</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Agua baño</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Tanto las enfermedades cardíacas genéticas como las no genéticas pueden causar procesos de remodelación severos en el corazón. La remodelación estructural, como la deposición de colágeno (fibrosis) y la desalineación celular, puede afectar la conducción eléctrica, introducir disfunciones electromecánicas y, eventualmente, conducir a arritmias. Los modelos predictivos actuales de estas alteraciones funcionales se basan en información estructural no integrada y de baja resolución. Colocar este marco en un orden de magnitud diferente es un desafío debido a la ineficacia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución en tejido masivo. En este trabajo, describimos un marco metodológico que permite obtener imágenes de corazones de ratón enteros con resolución micrométrica. La consecución de este objetivo ha requerido un esfuerzo tecnológico donde se han combinado los avances en la transformación de tejidos y los métodos de imagen. Primero, describimos un protocolo CLARITY optimizado capaz de transformar un corazón intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite una alta transparencia y tinción profunda. Luego, se describe un microscopio de lámina de luz fluorescente capaz de adquirir rápidamente imágenes de un campo de visión mesoscópico (escala mm) con la resolución a escala micrométrica. Siguiendo el proyecto mesoSPIM, el microscopio concebido permite la reconstrucción de todo el corazón del ratón con resolución micrométrica en un solo escaneo tomográfico. Creemos que este marco metodológico permitirá aclarar la participación del desorden citoarquitectónico en las disfunciones eléctricas y allanar el camino para un modelo integral que considere tanto los datos funcionales como los estructurales, permitiendo así una investigación unificada de las causas estructurales que conducen a alteraciones eléctricas y mecánicas después de la remodelación tisular.

La configuración de limpieza pasiva desarrollada permite obtener un corazón de ratón adulto despejado (con una dimensión del orden de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en aproximadamente 3 meses. Todos los componentes de la configuración están montados como se muestra en la Figura 1. El gradiente de temperatura insignificante entre cada cámara de limpieza (del orden de 3 ° C) permite mantener la temperatura en un rango adecuado en todas las cámaras.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Esta metodología combina la mejora del protocolo de aclaramiento con la capacidad ocular de seccionamiento óptico de la tecnología PIM de Mesos permitiéndonos realizar una reconstrucciones mesoscópicas a resolución micrométrica. Proporciona la posibilidad de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos o de una solución completa de corazones de ratón en una sola exploración sin perder la organización tridimensional original del tejido. Después de que el corazón ha sido canulado por la aorta proximal lavada en solución de tiro y fijada en aldehído paraformado al 4% en PBS molar 0,01, está listo para comenzar el protocolo de limpieza.Lave el corazón tres veces en PBS molar a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de este paso, el corazón se puede almacenar en PBS y azida de sodio al 0,01% a cuatro grados centígrados durante varios meses. Incubar el corazón en 20 mililitros de solución de hidrogel en condición de agitación a 15 RPM durante tres días a cuatro grados centígrados.Desgasifique la muestra a temperatura ambiente utilizando un secador, una bomba de vacío y un sistema de tubos que conecta el secador tanto a la banda de la bomba como a la tubería de nitrógeno. Coloque la muestra en la secadora y abra el vial manteniendo la tapa en ella. Cierre la secadora y retire el oxígeno del tubo abriendo la tubería de nitrógeno.Encienda la bomba de vacío para eliminar el oxígeno de la secadora durante 10 minutos. Apague la bomba y abra la perilla de la secadora a la tubería de nitrógeno. Luego abra el grifo de nitrógeno.Una vez que la presión sea igual a la presión atmosférica, abra cuidadosamente el secador y cierre rápidamente el vial. Mantenga el corazón en la solución de hidrogel desgasificado a 37 grados centígrados durante aproximadamente tres horas en reposo. Cuando el hidrogel esté correctamente polimerizado y parezca completamente gelatinoso, retire con cuidado el corazón y colóquelo en una solución de aclaramiento en el vial con solución limpiadora.Cambie la solución de limpieza en el vial una vez cada tres días para acelerar el procedimiento de clarificación. Una vez que el corazón aparezca completamente aclarado, retírelo del vial y lávelo en 50 mililitros de PBS calentado durante 24 horas en condiciones de agitación. Lavar de nuevo en 50 mililitros de un X PBS T durante 24 horas en condiciones de agitación.Incubar la muestra en 0,01 miligramos por mililitro de germen de trigo aglutinina Alexa piso 633 en tres mililitros de un X PBS T en condición de agitación a 50 RPM a temperatura ambiente durante siete días. Después de la incubación de siete días, lavar la muestra en 50 mililitros de un X PBS T a temperatura ambiente agitando durante 24 horas. Incubar la muestra en PFA al 4% durante 15 minutos y luego lavarla tres veces en PBS molar al 0,01 durante cinco minutos cada una.Incubar el corazón sucesivamente en 20 y 47% TDE en 0.01 PBS molar durante ocho horas cada uno. Y finalmente al 68% TDE en PBS molar 0.01 para proporcionar el índice de refracción requerido de 1.46. Llene suavemente aproximadamente el 80% del quvet de cuarzo externo con el medio de índice de refracción.Rellene el quvet de cuarzo interno con el mismo medio de índice de refracción. Sumerja la muestra dentro del remache interno. Mueva suavemente la muestra hasta el fondo del quvet usando pinzas finas y coloque el corazón con su eje longitudinal paralelo al eje principal del quvet para minimizar la trayectoria de la luz de excitación a través del tejido durante la exploración.Fije cuidadosamente el tapón a medida sobre el remache interno con dos tornillos. Monte la muestra en la etapa de microscopio usando imanes. Traduzca la etapa de muestra vertical manualmente para sumergir el quvet interno en el externo.Encienda la fuente de luz de excitación con una longitud de onda de 638 nanómetros y configúrela a baja potencia del orden de tres milivatios. Mueva la muestra utilizando el traductor motorizado para iluminar una placa interna del tejido. Encienda el software de cámara en vivo de imagen HC y configure el disparador de la cámara en el modo de hoja de luz de disparo de borde externo para impulsar el disparador de adquisición de la cámara mediante el software personalizado que controla toda la configuración.Habilite el guardado automático en el software de la cámara y configure la carpeta de salida donde se deben guardar las imágenes. Ajuste manualmente la posición de la muestra en el plano X Y con los traductores lineales para mover la muestra al centro del campo de visión del sensor de la cámara. Mueva la muestra a lo largo del eje Z utilizando el traductor motorizado lineal para identificar los bordes del corazón para la reconstrucción tomográfica.Aumente la potencia del láser a aproximadamente 20 milivatios antes de comenzar la sesión de imágenes. Inicie la adquisición tomográfica haciendo clic en el botón de inicio en el panel de captura del software de imágenes y, al mismo tiempo, comience a mover la muestra a lo largo del eje Z a una velocidad constante de seis micrómetros por segundo utilizando el traductor motorizado. La combinación de la metodología de claridad con TDE como medio de índice de refracción no cambia significativamente el volumen final de la muestra ni conduce a una deformación isotrópica de la muestra.La óptica de excitación produjo una lámina de luz con un desperdicio mínimo de aproximadamente seis micrómetros que divergió hasta 175 micrómetros en el borde del campo de visión. La sincronización del obturador enrollable de la cámara con el escaneo axial de los residuos de la hoja de luz aseguró recoger la señal de emisión solo en la porción de muestra excitada con el desperdicio de la hoja de luz, lo que resultó en un promedio de F W H M de aproximadamente 6.7 micrómetros a lo largo de todo el campo de visión. La función de dispersión del punto Z del microscopio también se estimó mediante una reconstrucción tomográfica de la nanoesfera fluorescente y se estimó un F W H M de 6,4 micrómetros por el ajuste.También se confirmó la potencialidad del sistema para resolver membranas celulares individuales en tres dimensiones con una relación señal / ruido suficiente en todo el órgano. El procedimiento de desgasificación es el paso más crítico del protocolo. Si no se realiza correctamente el tejido podría encontrarse con daños indicados durante la incubación en una solución limpiadora.El protocolo presentado se puede combinar con un protocolo de tinción múltiple para lograr una reconstrucción de órganos completos integrando diferentes estructuras biológicas y se puede aplicar para estudiar modelos patológicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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