Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)

Este método puede ayudar a resolver los problemas con los métodos convencionales de cultivo microbiano. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable en los resultados para el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. Esta tecnología automatiza las operaciones y reduce en mayor medida el consumo de mano de obra.

Y al mismo tiempo, tiene un buen rendimiento de cultivo con resultados confiables y operaciones simples. La tecnología se utiliza principalmente en los campos de investigación de microbiología, como la medición de la curva de crecimiento, la evolución adaptativa del laboratorio y un análisis multinivel de un solo factor. Comience los preparativos del experimento conectando la aguja de la jeringa con un diámetro interno de 0,41 milímetros y un diámetro exterior de 0,71 milímetros a un conector rápido A y una botella de reactivo.

Luego autoclave todo el equipo a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Para instalar el chip microfluídico, abra la puerta de la cámara de operación y levante la sonda de fibra óptica. Después de alinear los orificios del campo eléctrico con las agujas, coloque suavemente el chip en el pedestal del chip, luego inserte las dos columnas de posicionamiento en los orificios de posicionamiento y coloque la sonda de fibra óptica.

A continuación, conecte el conector rápido A en el chip al puerto correspondiente del sistema de cultivo de microgotas microbianas o MMC de acuerdo con el número de posición como se describe en el manuscrito. Cuando haya terminado, cierre la puerta de la cámara de operación. Diluir la suspensión cultivada de Escherichia coli MG1655 con el medio a un OD600 de 0,05 a 0,1 para obtener 10 mililitros de solución bacteriana inicial.

Para inicializar el MMC, haga clic en la pestaña Inicialización. Cuando aparezca la interfaz de inicialización, establezca la temperatura de cultivo en 37 grados Centígrados y el valor de la señal fotoeléctrica en 0,6. La inicialización tardará unos 20 minutos.

Más tarde, coloque una botella de reactivo esterilizada en el banco limpio y apriete la tapa. Use una jeringa estéril de 10 mililitros para inyectar de tres a cinco mililitros de aceite MMC desde la aguja de la jeringa hasta el tubo lateral en el frasco de reactivo. Luego incline y gire la botella de reactivo lentamente para que el aceite se infiltre completamente en la pared interior.

Después de inyectar cinco mililitros de una solución inicial de bacterias en la botella, llene la botella de reactivo inyectando de cinco a siete mililitros de aceite MMC. Extraiga el conector rápido independiente A del frasco de reactivo e inserte el conector rápido A en el conector rápido B del frasco para completar la operación de inyección de muestra. Una vez hecho esto, abra la puerta de la cámara de operación para colocar la botella de reactivo en el baño de metal.

Extraiga el conector C2 del chip y el conector rápido A de la botella de reactivo. Conecte el conector de tubo lateral de la botella de reactivo al conector C2 y el conector de tubo superior al conector de O2. Luego cierre la puerta de la cámara de operación.

Para elegir la función de medición de la curva de crecimiento, haga clic en Curva de crecimiento en la interfaz de configuración de parámetros para ingresar el número como 15. Luego encienda el interruptor de detección OD y establezca la longitud de onda como 600 nanómetros. Haga clic en la pestaña Inicio para iniciar la generación de gotas.

El proceso tardará 15 minutos en completarse. Cuando aparezca una ventana emergente en la interfaz principal que solicite un mensaje, abra la puerta de la cámara de operación para sacar la botella de reactivo y conectar los conectores C2 y O2. Después de cerrar la puerta, haga clic en el botón Aceptar en la ventana emergente para cultivar automáticamente las gotas y detectar los valores de OD.

A medida que la curva de crecimiento alcanza la fase estacionaria, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos OD. Seleccione la ruta de guardado de datos y exporte el valor de OD registrado durante el período de cultivo en el formato CVS Para trazar la curva de crecimiento, utilice software de mapeo como Excel y Origin 9.0. Inyecte los volúmenes requeridos de la solución inicial de bacterias, el medio fresco y el aceite MMC en las botellas de reactivo esterilizadas separadas para la solución inicial de bacterias en el medio fresco como se explicó anteriormente.

Para elegir la función de evolución adaptativa, haga clic en ALE en el software. En la interfaz de configuración de parámetros, active el interruptor de detección de OD, luego configure todos los parámetros descritos en el manuscrito y presione la pestaña Inicio para iniciar la generación de gotas. El proceso durará unos 25 minutos.

Durante cada período de subcultivo, observe si los valores máximos de OD de las gotas han aumentado significativamente. Si el aumento se produce y cumple con los requisitos del experimento, haga clic en el botón de exportación de datos para exportar los datos OD. Para extraer las gotas objetivo del MMC, haga clic en la pestaña de selección para seleccionar la función de extracción de gotas.

Luego elija la opción Recopilar y haga clic en los números de las gotas de destino. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar. Espere a que la ventana emergente le pida un mensaje. Luego coloque el conector rápido CF en el tubo de la microcentrífuga para su recolección y haga clic en Aceptar. Después de uno o dos minutos, cuando la interfaz del software aparezca una nueva ventana que solicita un mensaje, vuelva a insertar el conector rápido CF y haga clic en Aceptar para que MMC continúe ejecutándose.

Cuando la siguiente gota de destino llegue al sitio de reconocimiento de gotas, recójala como se especificó anteriormente. Use una pipeta de 2.5 microlitros para sacar y colocar la gota en una placa sólida de 90 milímetros, seguido de extender la gota uniformemente con una varilla recubierta triangular de vidrio con una longitud lateral de tres centímetros, luego cultive la gota en una incubadora de temperatura constante de 37 grados Celsius durante 72 horas. Más tarde, elija de tres a cinco colonias independientes de bacterias para cultivar cada colonia por separado en un matraz de agitación de 50 mililitros con 10 mililitros de medio fresco en una incubadora de agitación a 200 rotaciones por minuto y 37 grados Celsius durante 48 a 72 horas.

Después de la incubación, siga las regulaciones estándar relacionadas para almacenar la solución de bacterias cultivadas en el tubo de glicerol. El análisis representativo muestra las curvas de crecimiento de 50 gotas en todo el proceso de evolución adaptativa. Se observó que la cepa esencial de metanol Escherichia coli o MeSV2.2 mostró un crecimiento lento inicial seguido de un crecimiento rápido.

La curva de crecimiento de la gota seis en todo el proceso de evolución adaptativa se trazó por separado. El valor máximo de OD600 en la primera generación fue de 0,37, que aumentó a 0,58 en el último período de subcultivo, lo que indica que la cepa en la gota seis ha realizado una evidente evolución adaptativa. Además, se compararon las curvas de crecimiento de la cepa de gota seis y la deformación inicial.

La cepa de gota seis exhibió una tasa máxima de crecimiento específico y una concentración celular más altas en la fase estacionaria que la cepa inicial. Lo más importante es asegurarse de que la conexión del chip del instrumento y la botella de reactivo sea correcta, que son las gotas para que las operaciones procedan normalmente. Este método proporciona a los investigadores una nueva idea para el cultivo de microorganismos y también proporciona una plataforma eficiente y de bajo costo para la evolución adaptativa de las cepas.