Name: Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprende a visualizar dominios replicativos en cromatina mediante microscopía electrónica con marcaje EdU y Nanogold. Este protocolo de preincrustación ofrece alta resolución para estudiar la replicación del ADN in situ.

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Este trabajo fue apoyado en parte por RSF (subvención #17-15-01290) y RFBR (subvención #19-015-00273). Los autores agradecen el programa de desarrollo de la Universidad Estatal lomonosov de Moscú (PNR 5.13) y el Centro de Excelencia Nikon en imágenes correlativas en el Instituto Belozersky de Biología Físico-Química por el acceso a la instrumentación de imágenes.

El protocolo está optimizado para células adherentes y se probó en líneas celulares HeLa, HT1080 y CHO.
1. Etiquetado y fijación celular
<ol><li>Celdas de placa en fundas limpias con ácido en una placa de Petri de 3 cm. Cultivar las células en los medios recomendados para la línea celular que se está utilizando al 70% de confluencia.</li>
	<li>Añadir EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) de 10 mM de stock a 10 μM de concentración final y colocar las células en la incubadora durante 10 min o más (dependiendo del objetivo del experimento). Para pulsos más cortos (hasta 2 min), prepare una placa de Petri con medios de cultivo frescos precalentados complementados con 10 μM EdU, y transfiera hojas de cubierta en ella, en lugar de agregar EdU a las células directamente. NOTA: Todos los pasos posteriores se llevan a cabo a temperatura ambiente si no se indica lo contrario.</li>
	<li>Fijar las células marcadas con glutaraldehído al 2,5%, recién hecho diluyendo el caldo al 25% en tampón de cacodilato de 100 mM, durante 1 h. NOTA: Los pasos de detección de EdU posteriores son sensibles al tiempo de fijación. Los tiempos de fijación más largos pueden afectar negativamente al etiquetado EdU, causando una menor relación señal-ruido.</li>
	<li>Elimine el glutaraldehído lavando las muestras con PBS suplementado con 5 mM MgCl2 (PBS* a partir de entonces). Lavar tres veces con una incubación de 10 minutos para cada lavado.</li>
	<li>Permeabilizar las membranas plasmáticas con 1% de Tritón X-100 en PBS* (PBS*T a partir de entonces). Lavar dos veces con una incubación de 5 minutos para cada lavado.</li>
	<li>Lave ampliamente la muestra con PBS*. Realiza cinco cambios e incuba durante 5 min en cada cambio.</li>
	<li>Apague los grupos de aldehído libre de residuos con 20 mM de glicina en PBS*, dos veces durante 10 min cada una.</li>
	<li>Bloquee las muestras en BSA al 1% en PBS* durante 30 min.</li>
</ol>2. Reacción de clic
NOTA: Este procedimiento se modifica a partir de un protocolo19 publicado anteriormente.
<ol><li>Inmediatamente antes de su uso, prepare la mezcla Click-reaction para la detección de EdU: en un tubo de microcentrífuga, mezcle 430 μL de 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1.2 μL de biotina-azida (10 mM en DMSO) y 50 μL de ácido ascórbico de 0.5 M. Para el control de calidad del etiquetado replicativo y el procedimiento Click-procedure a nivel de microscopía fluorescente, la biotina-azida puede ser reemplazada por AlexaFluor 488-azide. NOTA: El orden de adición de componentes en la reacción anterior es importante.</li>
	<li>Realice una reacción de clic en una cámara húmeda para minimizar la evaporación y los cambios de concentración en el cóctel de reacción. Prepare la cámara húmeda colocando una hoja húmeda de papel de filtro en el fondo de la placa de Petri y cubriéndola con una película de parafina. Coloque las cubiertas en la superficie de la película con las células hacia arriba y coloque una capa de 50-100 μL del cóctel de reacción sobre la cubierta. La reacción dura 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Detenga la reacción lavando la muestra en Tritón X-100 al 0,1% en PBS* (PBS*T), cinco veces durante 5 min cada una.</li>
	<li>Bloquee en BSA al 1% en PBS* T durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare la solución de estreptavidina-nanogold con PBS*T que contenga 1% de BSA. Incubar la muestra con estreptavidina, conjugada con partículas nanogold de 1,4 nm (nanosondas) en BSA + PBS*T al 1% durante la noche a +4 °C en la cámara húmeda recién preparada.</li>
	<li>Detenga la reacción y lave la muestra en PBS*T, cinco veces durante 10 minutos cada una.</li>
	<li>Estabilizar el complejo de estreptavidina de biotina mediante la postfijación en glutaraldehído al 1% en PBS* durante 30 min.</li>
	<li>Retire el glutaraldehído mediante un lavado intenso con agua desionizada y lave la muestra en PBS*, cinco veces durante 20 minutos cada una.</li>
	<li>Apague los grupos de aldehídos libres con 1 mg/ml de NaBH4 recién preparado en agua, dos veces durante 10 minutos cada uno. Durante la incubación, se forman burbujas de H2 que pueden levantar las hojas de cubierta. Empujarlos con cuidado hacia abajo con las pinzas.</li>
	<li>Lavar con agua desionizada cinco veces durante 5 min cada una. NOTA: Para el control de calidad en la etapa de etiquetado, es recomendable realizar el etiquetado de control con estreptavidina marcada fluorescentemente (Figura 2). Esto proporcionaría una estimación de la intensidad del etiquetado y el nivel de fondo antes de cambiar a pasos posteriores tediosos y propensos a artefactos.</li>
</ol>3. Amplificación de Ag
NOTA: Este procedimiento se modifica a partir de Gilerovitch et al., 1995 (ver 20,21).
<ol><li>Resuspendir 50 g de polvo de acacia en 100 ml de agua desionizada. Disolver durante 3 días, desgasificar y filtrar a través de cuatro capas de gasa. Almacenar congelado en alícuotas de 5 ml en tubos de 50 ml. Descongelar inmediatamente antes de su uso.</li>
	<li>Añadir 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL de alícuota descongelada de solución de polvo de acacia para hacer 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) en solución de polvo de acacia. Mezclar meciendo lentamente el tubo durante 30 min. Envuelva el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz.</li>
	<li>Simultáneamente con el paso 3.2., lave las fundas con tampón de lavado (50 mM MES, pH = 5.8, sacarosa de 200 mM), tres veces durante 10 min cada una.</li>
	<li>Prepare la solución fresca de galato de N-propilo (NPG). En un tubo de 15 ml, disuelva 10 mg de NPG en 250 μL de etanol al 96% y ajuste a 5 ml con agua desionizada.</li>
	<li>Ponga 36 mg de lactato de plata en un tubo de 15 ml envuelto en papel de aluminio.</li>
	<li>Después del paso 3.2. se completa, agregue 1.5 ml de solución de NPG a la mezcla de polvo de acacia y roca durante otros 3 minutos. NOTA: Todos los pasos posteriores se llevan a cabo en un cuarto oscuro. Use luz segura no actínica (amarilla o roja).</li>
	<li>Equilibre la muestra con el tampón de lavado y proceda a la habitación oscura. Simultáneamente, agregue 5 ml de agua desionizada al lactato de plata y disuelva agitando vigorosamente durante 1-2 min.</li>
	<li>Agregue 1.5 ml de solución de lactato de plata a la mezcla de polvo de acacia, mece lentamente durante 1 min. Evite la formación de burbujas, ya que el oxígeno en la mezcla ralentizará la reacción.</li>
	<li>Escurrir la solución del plato con fundas y verter 3 ml de mezcla de polvo de lactato de plata y acacia en las células. Mece el plato varias veces e incuba durante 2-5 min. El tiempo de incubación depende del lote de polvo de acacia y la temperatura. Esto debería definirse experimentalmente. NOTA: Un tiempo de incubación más largo puede resultar en una unión de plata inespecífica.</li>
	<li>Para detener la reacción, escurra la mezcla de reacción y lave el plato extensamente con tres a cinco cambios de agua desionizada, seguidos de tres cambios más durante 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Revise la tinción bajo el microscopio de campo brillante. Una buena tinción debe ser de color marrón claro a oscuro con un fondo amarillento muy tenue. NOTA: Si la tinción no se está desarrollando, es posible repetir inmediatamente con la mezcla ya hecha (la mezcla está activa durante aproximadamente 15 minutos si se mantiene en la oscuridad). Sin embargo, la tinción en este caso podría desarrollarse demasiado rápido.</li>
</ol>4. Tonificación del oro
NOTA: Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por oxidación de OsO4 en los procedimientos posteriores, se utiliza una impregnación con oro en este paso (Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol><li>Enjuague las fundas con agua desionizada.</li>
	<li>Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por oxidación de OsO4 , incubar las muestras en ácido tetracloroáurico al 0,05% durante 2 min en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar bien con agua desionizada durante 10 min. NOTA: En esta etapa se agrega contraste adicional al material que contiene ADN. El color de la muestra debe cambiar de marrón a negro.</li>
</ol>5. ChromEM
NOTA: Este protocolo fue modificado de Ou et al., 201716.
<ol><li>Incubar los coverslips y saturar las muestras en 10 μM DRAQ5 en PBS durante 10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Preparar una solución de tetraclorhidrato de diaminobencidina (DAB) al 0,2% en Tris o PBS de 50 mM: disuelva DAB en el 90% del volumen final agitando vigorosamente en la oscuridad, luego ajuste el pH a 7.0-7.4 con NaOH. Ajuste el volumen al 100% y filtre a través de un filtro de 0.22 μM, guárdelo envuelto en papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir solución DAB a las células (2 ml por placa de Petri de 3 cm) e incubar durante 1 min.</li>
	<li>Mueva el cubrehojas en la placa de Petri con fondo de vidrio y colóquelo en la etapa de un microscopio invertido. Irradiar la muestra (varios campos de visión) en un microscopio invertido con fuente de luz de halogenuros metálicos y conjunto de filtros Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 en el plano focal) a través de la lente Plan Apo λ 40х (NA = 0.95) durante 10 min. NOTA: Una indicación de fotoconversión DAB exitosa es el fotoblanqueo DRAQ5 completo y la formación de precipitados DAB oscuros en núcleos irradiados. Sin embargo, esto último no siempre es evidente sobre la intensa señal EdU-plata-oro (especialmente cuando se utilizan pulsos EdU extendidos).</li>
	<li>Lavar con agua desionizada tres veces durante 5 min cada una.</li>
</ol>6. Deshidratación e incrustación de resina epoxi
<ol><li>En un tubo de microcentrífuga, prepare una solución de tetraóxido de osmio parcialmente reducida mezclando una solución acuosa al 2% de K4Fe(CN)6 con una cantidad igual de solución acuosa al 2% de OsO4, para obtener una concentración final del 1% de ambos componentes. Incubar los cubrehojas en OsO4 reducido durante 1 h y lavar en agua desionizada tres veces durante 5 min cada una. NOTA: En esta etapa, el compuesto de osmio reducido reacciona con las deposiciones de DAB y aumenta el contraste del ADN. PRECAUCIÓN: El osmio es tóxico, trabaje bajo una campana de humos y maneje los desechos de acuerdo con las normas de seguridad locales.</li>
	<li>Deshidratar las muestras en una serie de soluciones de etanol graduadas en porcentajes crecientes: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.</li>
	<li>Para la infiltración y la incrustación, utilice la fórmula de resina con la relación volumétrica del componente de la siguiente manera: monómero de resina epoxi: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (p / w). Esta fórmula es miscible con etanol.<ol>
<li>Incubar el coverslip en la mezcla etanol-resina (3 partes 100% EtOH:1 parte resina epoxi) durante 30 min.</li>
		<li>Incubar el coverslip en la mezcla etanol-resina (1 parte 100% EtOH:1 parte resina epoxi) durante 2 h.</li>
		<li>Incubar el coverslip en la mezcla de etanol-resina (1 parte 100% EtOH:3 partes resina epoxi) durante la noche.</li>
		<li>Reemplace la mezcla de etanol y resina con resina pura recién preparada. Incubar en mezcla de resina pura durante 8 h. Abra el plato para dejar que los restos de etanol se evaporen.</li>
		<li>Transfiera los recubiertos a un nuevo plato con resina pura e incube durante 2 h a 37-42 °C.</li>
		<li>Llene un molde de silicio con resina recién preparada. Coloque las fundas con las células hacia abajo en el molde de silicio apropiado lleno de resina epoxi. Curar la resina durante 24 h a 37 °C, luego a 60 °C durante al menos 2 días. PRECAUCIÓN: Los componentes de la mezcla de resina epoxi son carcinógenos potenciales. Use guantes y trabaje debajo de la campana de humos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la losa de resina del molde, limpie la superficie de la funda con el bisturí o la cuchilla de afeitar. Para quitar el coverslip, deje caer el coverslip en nitrógeno líquido y luego transfiera la losa al agua hirviendo. Repetir si es necesario.</li>
	<li>Localice el área irradiada debajo de un estereomicroscopio y córtela de la losa con una sierra o cualquier otro instrumento adecuado. Precaliente la losa a 70 °C en una placa caliente, si es necesario.</li>
	<li>Sujete el recorte en un soporte de muestra ultramicrotómico para el recorte final del bloque. Usando la maquinilla de afeitar, prepare la muestra en forma de pirámide. Monte el soporte con pirámide en el ultramicrotomo e instale el cuchillo.<ol>
<li>Recorte el bloque para que se incluyan las celdas irradiadas que llevan la etiqueta EdU. Preparar una sección semifina (250 nm de espesor) adecuada para la tomografía electrónica. NOTA: El grosor de la sección se puede ajustar para adaptarse a los requisitos experimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separe la sección del filo de la navaja y colóquela en las rejillas de una sola ranura. Para la tomografía electrónica, las secciones de 250 nm se recogen en rejillas de una sola ranura de 1 mm y, después del secado, estas secciones se pueden recubrir con carbono desde ambos lados. No es necesario ningún contraste adicional. NOTA: Dado que las secciones ya contienen partículas Au-Ag de alto contraste, no hay necesidad de agregar partículas de oro fiduciario a la superficie de la sección.</li>
	<li>Examine las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión a bajo aumento (aproximadamente 600x) para localizar las células con patrones de replicación apropiados. NOTA: Este protocolo genera una densidad de etiquetado lo suficientemente alta como para una fácil detección de focos de replicación incluso con un aumento bajo. Es recomendable primero crear un mapa de la sección para la posterior navegación y la colección de proyecciones angulares para tomografía. Cambie a un aumento más alto y tome imágenes de alta resolución.</li>
</ol>7. Tomografía electrónica
<ol><li>Inserte la rejilla en el microscopio electrónico de transmisión con un soporte de alta inclinación. Cargue la muestra en el microscopio electrónico y localice la región de interés.</li>
	<li>Alinee el microscopio en modo EFTEM en modo de iluminación casi paralela. Ajuste el filtro de energía con una ranura de selección de energía de 20 eV colocada en el pico de pérdida cero.</li>
	<li>Pre-irradiar el área de adquisición de la tomografía a una tasa de dosis de 40 e/Å2/s durante al menos 1,5-2 min, lo que corresponde a la dosis total de al menos 3000 e/Å2.</li>
	<li>Ajuste la altura eucéntrica con la tarea automática en SerialEM. Compruebe la tarea de enfoque automático para asegurarse de que funciona correctamente en ángulo de inclinación cero y valor de desenfoque objetivo de -0,8 mkm.</li>
	<li>Incline el soporte de muestra a -60° con la tarea Walk-Up.</li>
	<li>Configure la adquisición de la tomografía de -60 a +60° con el paso 2.0°. La exposición debe ajustarse en función del ángulo de inclinación para mantener la intensidad media de la cámara. Limite el cambio de imagen en caso de que cause un cambio de energía y, por lo tanto, una desalineación de la ranura. Los datos de la tomografía deben guardarse como archivo .mrc.</li>
	<li>Importe el archivo .mrc en el software IMOD para la reconstrucción de tomografías. Elimine los valores de píxeles atípicos debido a los rayos X.</li>
	<li>Alinee la serie de inclinación. Realice una correlación cruzada inicial, luego marque manualmente 10-12 partículas de oro como fiduciales. Realice un seguimiento del modelo fiduciario e inspeccione que cada fiduciario se rastrea correctamente a través de la serie de inclinación. Cree tomogramas de muestra (cortes) y marque manualmente los bordes de la sección delgada para evitar la posible inclinación de la densidad reconstruida dentro del volumen. El error residual medio para la alineación fina fue inferior a 1,2 pix.</li>
	<li>Reconstruya el tomograma con un algoritmo de retroproyección filtrada y luego recorte la salida para que se ajuste a la región de interés en el volumen final.</li>
</ol>

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<li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed%2C+Epon-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El método descrito aquí tiene varias ventajas sobre los protocolos publicados anteriormente. En primer lugar, el uso de Click-chemistry para etiquetar el ADN replicado elimina la necesidad de un requisito previo de desnaturalización del ADN para la detección de BrdU con anticuerpos, preservando así mejor la ultraestructura de la cromatina. 
En segundo lugar, la utilización de la biotina como ligando secundario que se genera después de la fijación del glutaraldehído y el enfriamiento adecuado d...

La replicación del ADN es un proceso biológico básico requerido para la copia fiel y la transmisión de la información genética durante la división celular. En eucariotas superiores, la replicación del ADN está sometida a una estrecha regulación espacio-temporal, que se manifiesta en la activación secuencial de los orígenes de replicación1. Los orígenes de replicación vecinos que se activan sincrónicamente forman grupos de replicons2. A nivel de microscopía óptica, los sitios de replicación continua del ADN se detectan como focos de replicación de varios números y tamaños. Los focos de replicación muestran patrones específicos de distribución espacial dentro del núcleo celular dependiendo del momento de replicación del ADN marcado 3,4, que, a su vez, está estrechamente correlacionado con su actividad genética. Gracias a una secuencia bien definida de replicación de ADN, estrictamente ordenada en el espacio y el tiempo, el etiquetado replicativo es un método poderoso de etiquetado preciso de ADN no solo para el estudio del proceso de replicación per se, sino también para discriminar una subfracción específica de ADN con actividad de transcripción definida y nivel de compactación. La visualización de la cromatina replicante se realiza generalmente a través de la detección de los principales componentes proteicos de la maquinaria de replicación del ADN (ya sea por inmunotinción o por expresión de etiquetas de proteínas fluorescentes 5,6) o mediante la incorporación de precursores de síntesis de ADN modificados 7,8,9,10 . De estos, solo los métodos basados en la incorporación de nucleótidos modificados en el ADN recién replicado permiten la captura de cambios conformacionales en la cromatina durante la replicación, y rastrean el comportamiento de los dominios replicativos después de que se completa su replicación.
En los eucariotas superiores, el empaquetamiento del ADN en cromatina agrega otro nivel de complejidad a la regulación de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, reparación, etc.). El plegamiento de la cromatina afecta la accesibilidad del ADN a los factores trans reguladores y a los cambios conformacionales del ADN (desenrollamiento de doble hélice) necesarios para la síntesis de la plantilla. Por lo tanto, generalmente se acepta que los procesos sintéticos dependientes del ADN en el núcleo celular requieren una transición estructural de la cromatina de su estado condensado y represivo a una conformación más accesible y abierta. Citológicamente, estos dos estados de cromatina se definen como heterocromatina y eucromatina. Sin embargo, todavía no hay consenso sobre el modo de plegamiento del ADN en el núcleo. Las hipótesis van desde un modelo11 de "fusión polimérica", donde la fibra nucleosómica se comporta como un polímero aleatorio para el cual la densidad de empaquetamiento está controlada por mecanismos de separación de fases, hasta modelos de plegamiento jerárquico que postulan la formación secuencial de estructuras similares a fibras de cromatina de espesor creciente12,13. Los modelos de plegamiento jerárquico recientemente obtuvieron apoyo de enfoques moleculares basados en el análisis de contactos ADN-ADN in situ (captura de conformación cromosómica, 3C), demostrando la existencia de la jerarquía de dominios estructurales de cromatina14. Es importante tener en cuenta que las unidades de replicación se correlacionan muy bien con estos dominios de cromatina15. La principal crítica de estos modelos se basa en la posible agregación artificial de cromatina causada por procedimientos de preparación de muestras, como la permeabilización de las membranas celulares y la eliminación de componentes que no son de cromatina, con el fin de mejorar el contraste de cromatina para estudios ultraestructurales al tiempo que mejora la accesibilidad de la cromatina para varias sondas (por ejemplo, anticuerpos). Los recientes avances técnicos en la tinción selectiva de ADN para microscopía electrónica mediante fotooxidación mediada por fluoróforos de unión al ADN de diaminobenzidina (ChromEMT6) han permitido la eliminación de este obstáculo. Sin embargo, las mismas consideraciones son válidas para la visualización de microscopía electrónica de la replicación del ADN17,18. Aquí describimos una técnica que permite el mapeo ultraestructural simultáneo de alta resolución del ADN recién sintetizado y la cromatina total en células intactas reticuladas por aldehído. La técnica combina la detección de ADN marcado con EdU por Click-chemistry con sondas biotiniladas y streptavidin-Nanogold, y ChromEMT.

<table><tbody><tr><td><reactivo fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-morfolino)etano Ácido sulfónico (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azida</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>biotina-azida</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de resina epoxi</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído (25%, grado EM)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>Goma arábiga</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>N-galato de propilo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de plata</td><td>ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-AlexaFluor 488 conjugado</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado estreptavidina-nanooro</td><td>Nanosondas</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>ácido tetracloroáurico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper rejillas de una sola ranura</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 juego de filtros de fluorescencia (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>Alternativas: Ted</td></tr><tr><td>Pella Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Portamuestras de alta inclinación</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión que funciona a 200 kV en modo EFTEM, con goniómetro de alta inclinación</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>Alternativas: FEI, Pinzas Hitachi</td></tr><tr><td></td><td>Ultramicrótomo Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td></td><td>UltraCut-E</td><td>Alternativas: RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image</td><td>acquisition Open Source</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>Procesamiento de imágenes</td><td>Open Source</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Los principios del plegamiento del ADN en el núcleo celular y sus transformaciones dinámicas que ocurren durante el cumplimiento de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, segregación, etc.) siguen siendo poco conocidos, en parte debido a la falta de enfoques experimentales para la visualización de alta resolución de loci de cromatina específicos en núcleos estructuralmente conservados. Aquí presentamos un protocolo para la visualización de dominios replicativos en cultivo celular monocapa in situ, combinando el etiquetado EdU de ADN recién sintetizado con la posterior detección de etiquetas con amplificación ag-amplificación de partículas Nanogold y tinción ChromEM de cromatina. Este protocolo permite el etiquetado preincrustante de alto contraste y alta eficiencia, compatible con la fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Otra ventaja del etiquetado de preincrustación es la posibilidad de preseleccionar celdas de interés para el seccionamiento. Esto es especialmente importante para el análisis de poblaciones celulares heterogéneas, así como la compatibilidad con los enfoques de tomografía electrónica para el análisis 3D de alta resolución de la organización de la cromatina en los sitios de replicación, y el análisis del reordenamiento de la cromatina post-replicativa y la segregación de cromátidas hermanas en la interfase.

Los focos de replicación en los núcleos celulares de mamíferos muestran patrones distintos de distribución dentro del núcleo dependiendo de la progresión de la fase S. Estos patrones se correlacionan con la actividad transcripcional de los loci que se replican. Dado que el método presentado aquí utiliza un procedimiento de fijación bastante fuerte, es bastante sencillo utilizar el etiquetado de pulsos replicativos para la detección específica de loci de cromatina en varios estados transcripcionales, incluso en condicione...

Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.

Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Presentamos un protocolo para la visualización microscópica electrónica de los dominios replicativos en la célula mediante el etiquetado EdU del ADN recién sintetizado y la detección de etiquetas con mejora de plata de partículas de Nanogold y tinción ChromEM de la cromatina. Este protocolo proporciona el etiquetado de preincrustación de alto contraste con fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Este protocolo está optimizado para la adherencia celular que crece en las cubiertas de la placa de Petri.Agregue EdU a la concentración final de 10 micro moles y coloque las células en la incubadora durante el tiempo de etiquetado deseado. Fije las células marcadas con 2.5% de gluaradehidrato en una solución de cacodilato de sodio de 100 milimoles durante una hora. Un tiempo de fijación más largo puede afectar negativamente al etiquetado de EdU.Elimine el glutaraldehído enjuagando las muestras con PBS suplementado con cinco milimoles de cloruro de magnesio, considerado además como PBS star. Lavar tres veces durante 10 minutos. Permeabilizar las membranas plasmáticas con una solución al 1% de Trione X-100 en PBS star, realizar dos cambios durante cinco minutos cada uno.Esta solución se conoce además como PBS star T.Lave ampliamente la muestra con PBS star. Cinco cambios durante cinco minutos cada uno. Apague los grupos aldehídos residuales con 20 milimoles de glicina en la estrella PBS, dos veces durante 10 minutos.Coloque la muestra en PBS star con 1% BSA durante media hora. Mientras bloquea en BSA, prepare el cóctel de reacción para la detección de EdU. El orden de adición de los componentes es importante.La conjugación biotina-azida de EdU se realiza en la cámara húmeda para minimizar la evaporación y los cambios de concentración en el cóctel de reacción. Prepare la cámara húmeda. Coloque el coverslip en la parapelícula con las células hacia arriba y coloque de 50 a 100 microlitros del cóctel de reacción en el coverslip.La reacción tarda 30 minutos a temperatura ambiente. Detenga la reacción lavando la muestra en PBS estrella T, cinco veces durante cinco minutos cada una. Bloquee de nuevo con 1% BSA en PBS estrella T durante otra media hora.Preparar la solución de estreptavidina-Nanogold en PBS estrella T con 1%BSA. Incubar la muestra con estreptavidina durante la noche a más cuatro grados en una cámara húmeda recién preparada. El procedimiento es el mismo que con la conjugación biotina-azida EdU.Detenga la reacción y lave la muestra, cinco veces durante 10 minutos cada una con PBS estrella T.Estabilizar el complejo de estreptavidina de biotina mediante una fijación adicional del 1% de glutaraldehído PBS estrella durante media hora. Eliminar el glutaraldehído mediante un lavado intenso con agua desionizada. Apague los grupos aldehído residual con un miligramo por mililitro de borohidruro de sodio.Lavar de nuevo a fondo. El siguiente paso es aumentar el tamaño de las partículas de Nanogold por medio de la deposición de plata en el curso de oro. Prepare premezclas para minimizar la actividad en el cuarto oscuro.Equilibre las muestras con el tampón de lavado y proceda a un cuarto oscuro. En el cuarto oscuro mezclar los componentes para preparar la solución de lavado y aplicarla a las muestras. La solución de polvo de acacia es altamente visible.Por lo tanto, durante la mezcla de los componentes, balancee el tubo lentamente para evitar la formación de burbujas y espuma. La reacción dura de dos a cinco minutos. Recomendamos realizar una prueba para determinar el tiempo de reacción óptimo.Un tiempo de incubación más largo puede resultar en una deposición de plata inespecífica. Para detener la reacción, enjuague rápidamente la muestra con tres a cinco cambios del agua desionizada. Seguido de tres cambios más durante cinco minutos cada uno.Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por el tetróxido de osmio, incube las muestras en ácido tetracloroáurico al 0,05% durante dos minutos en la oscuridad. Lavar bien con agua desionizada. En esta etapa, se agrega contraste adicional al material que contiene ADN.Saturar la muestra con tinción de ADN DRAQ5. Agregue la solución de diamionobenzidina a la muestra e incube durante un minuto. Mueva el cubrehojas en la placa de Petri con fondo de vidrio y colóquelo en el escenario del microscopio invertido.Irradia varios campos de visión con luz roja de 640 nanómetros. El panel izquierdo muestra el blanqueamiento fotográfico completo de DRAQ5. En el panel derecho, el mismo campo de visión se visualiza en la luz transmitida que muestra el precipitado DAB.Lavar las muestras con agua desionizada. La siguiente etapa debe realizarse bajo el capó de humos. Preparado solución de tetróxido de osmio parcialmente reducida.Ten cuidado. Esta sustancia es altamente volátil y tóxica. Aplique la solución preparada sobre la muestra.En esta etapa, los compuestos reducidos de osmio reaccionan con las deposiciones de diamionobencidina y aumentan el contraste del ADN. Deseche la solución que contiene osmio de acuerdo con su regulación local y lave las muestras tres veces durante cinco minutos cada una. La muestra se deshidrata aún más en una serie de concentraciones crecientes de etanol seguidas de la infiltración de las células con mezclas de resina de etanol.Reemplace la mezcla de resina alcohólica con resina pura recién preparada. Llene el molde de incrustación del tamaño adecuado con una resina recién preparada. Coloque el trozo de cubierta con una celda hacia abajo sobre la cavidad llena de resina.Curar la resina durante 24 horas a 37 grados. Luego a 60 grados durante al menos dos días. Retire la resina de la superficie inferior de una cubierta.Deje caer la losa en un nitrógeno líquido y luego transfiérala al agua hirviendo. El vidrio debe desprenderse. Repita si es necesario.Los campos de visión irradiados deben ser claramente visibles debido a la deposición de diamionobencidina y la tinción de DAB. Recorte el área de interés de la losa utilizando la sierra o cualquier otro instrumento adecuado. Coloque el recorte en el soporte simple ultramicrotomo.Configure el ultramicrotomo para el recorte final del bloque. Usando la hoja de afeitar, prepare el pasto en forma de pirámide. El tamaño de un área plana en la parte superior de la pirámide debe ser de aproximadamente 400 por 200 micras.Monte la pirámide preparada en el brazo del ultramicrotomo e instale el cuchillo. Preparar las secciones. El grosor de la sección se puede ajustar para adaptarse a los requisitos experimentales.Nuestro objetivo es la tomografía EM. Así que preparamos secciones con un espesor de 250 nanómetros también conocidas como secciones semidelgadas. Separe las secciones del filo de la navaja y móntelas en una rejilla de ranura.Usamos una rejilla de ranura, eran redondas de un milímetro para estar alrededor, una abertura lateral de un milímetro. El pequeño tamaño de apertura proporciona una mejor estabilidad de las secciones. Deje que las muestras se sequen en la rejilla.En este momento, las secciones están listas para la observación. Coloque la rejilla en el soporte de muestra del microscopio electrónico. Cargue la muestra en el microscopio electrónico.Adquirir series basculantes. Los focos de replicación en los núcleos celulares de mamíferos muestran distintos patrones de distribución dependiendo de la progresión de la fase S. El etiquetado exitoso de EdU confirmado por la reacción de clic con azida marcada fluorescentemente demuestra el patrón de replicación típico en la población celular heterogénea después de la fijación de glutaraldehído en la parte superior.El etiquetado de la estreptavidina puede ser influenciado por el glutaraldehído. Así que primero verifique la tinción de estreptavidina de fluorescencia en la misma condición que el nanooro de estreptavidina en la parte inferior. El buen resultado del procedimiento de mejoras de plata es una tinción marrón oscuro de algunos núcleos y una mancha de citotrito amarillo muy débil, que se muestra en la parte inferior.La ventaja de un etiquetado de preincrustación es la posibilidad de seleccionar celdas para la sección. Es posible en esta etapa porque los patrones de etiquetado se vuelven visibles bajo un microscopio de campo brillante. El etiquetado apropiado da como resultado los sitios de replicación bien demarcados.La punta de flecha muestra las fibras de cromatina teñidas de DAB. El etiquetado de fondo a la derecha está limitado a unas pocas nanopartículas por micra cuadrada. Las secciones semidelgadas están listas para la tomografía y no requieren la adición de nanopartículas de oro.El enfoque descrito utilizado para los estudios de organización de la cromatina en sitios con replicación habilitada. Para el análisis del reordenamiento post replicativo de la cromatina, incluidas las imágenes de alta resolución de la segregación de cromatina. También se utiliza para el etiquetado replicado de grandes dominios cromosómicos y estudios de plegamiento de cromatina de orden superior y heterocromatina.Esta técnica de imagen también es importante como punto de referencia para los datos generados por otros enfoques no microscópicos. El método también se puede acomodar en estudios microscópicos correlacionados, incluidas las técnicas de súper resolución. Esto abre nuevos horizontes en los estudios de la estructura de orden superior de la cromatina y su dinámica en los diversos estados fisiológicos de la célula.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

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Investigación

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Biology

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