Name: Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprende a inducir expresión génica controlada por luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120. Este método permite un control espacial y temporal preciso para estudios de trazado de linaje y ensayos de ganancia de función.

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Agradecemos a Stefan Materna y a los miembros de los laboratorios Woo y Materna por sus útiles sugerencias y comentarios sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner y Laura Motta-Mena por su valiosa discusión y conocimientos durante el desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; R03 DK106358) y el Comité Coordinador de Investigación del Cáncer de la Universidad de California (CRN-20-636896) a S.W.

Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California Merced.
1. Cruce de peces cebra y recolección de embriones
<ol><li>Mantenga líneas separadas de pez cebra transgénico que contengan el activador transcripcional TAEL o el gen reportero controlado por C120 para minimizar la activación espuria.</li>
	<li>Cruce de 6 a 8 peces cebra adultos de cada línea utilizando métodos estándar9 para producir embriones transgénicos dobles que contengan los componentes TAEL y C120(Figura 1B). NOTA: Alternativamente, ambos componentes pueden expresarse transitoriamente a través de la microinyección de ARNm o ADN plásmido utilizando métodos estándar10.</li>
	<li>Recolectar embriones en placas de Petri que contengan agua de huevo (60 μg / ml de sal marina instantánea del océano disuelta en agua destilada), con aproximadamente 30 embriones por condición para ser probados.</li>
	<li>Coloque los platos en una caja o cubierta a prueba de luz con papel de aluminio para minimizar la activación involuntaria por la luz ambiental (ver Tabla 1).</li>
</ol>2. Inducción de luz global
<ol><li>Utilice un panel LED de luz azul (465 nm) para administrar luz azul activadora a varios embriones a la vez.</li>
	<li>Coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones de modo que la potencia real de la luz recibida por los embriones sea de aproximadamente 1,5 mW / cm2 medida por un medidor de potencia y energía de la luz (Figura 2A).</li>
	<li>Pulsar la luz a intervalos de 1 h encendido/1 h apagado utilizando un relé temporizador si se ilumina durante más de 3 h para reducir el riesgo de fotodaje al activador transcripcional TAEL5,8. NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la duración exacta de la iluminación para aplicaciones específicas. En este protocolo, se proporcionan ejemplos de duración de iluminación de 30 min, 1 h, 3 h y 6 h.</li>
	<li>Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación.</li>
	<li>Coloque las placas de Petri que contienen embriones de control en una caja a prueba de luz o cubra con papel de aluminio para controles oscuros.</li>
</ol>3. Evaluación cuantitativa de la inducción por qRT-PCR
<ol><li>Retire los embriones de la iluminación después de la duración de activación deseada.</li>
	<li>Extraiga el ARN total de 30-50 embriones activados por la luz y 30-50 embriones oscuros utilizando un kit de aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del kit.<ol>
<li>Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y elimine el exceso de agua de huevo. Añadir tampón de lisis y homogeneizar los embriones con un mortero de plástico.</li>
		<li>Transfiera el lisate a una columna proporcionada por el kit y continúe con las instrucciones del kit. Proceda inmediatamente al paso 3.3 o almacene el ARN purificado a -20 °C a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice 1 μg de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del kit.<ol>
<li>Tome un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml, agregue 1 μg de ARN a 4 μL de mezcla maestra de reacción de ADNc 5x (que contiene tampón optimizado, oligo-dT y cebadores aleatorios, y dNTP), 1 μL de solución de transcriptasa inversa 20x y agua libre de nucleasa a un volumen total de 20 μL.</li>
		<li>Coloque el tubo en un termociclador programado de la siguiente manera: 22 °C durante 10 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min, y luego manténgalo a 4 °C. Proceda inmediatamente al paso 3.4 o almacene el ADNc a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare reacciones de qPCR que contengan una mezcla maestra de enzimas verdes SYBR, ADNc diluido 5 veces (paso 3.3) y 325 nM de cada imprimación para GFP. NOTA: Los cebadores utilizados en este protocolo de la siguiente manera. GFP adelante: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP reverso: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').</li>
	<li>Realizar reacciones de qPCR en una máquina de PCR en tiempo real. NOTA: Programa de PCR: activación inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 72 °C.</li>
	<li>Realice un análisis de la curva de fusión una vez que se complete la PCR para determinar la especificidad de la reacción. Realice tres réplicas técnicas para cada muestra.</li>
	<li>Calcular la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones mantenidos en la oscuridad utilizando el método2 -ΔΔCt 11. La significación estadística se puede determinar con un paquete de software de estadísticas.</li>
</ol>4. Evaluación cualitativa de la inducción por microscopía de fluorescencia
<ol><li>Retire los embriones de la iluminación después de la duración deseada de la activación.</li>
	<li>Inmovilizar embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio.</li>
	<li>Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un estereomicroscópica fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Utilice una configuración de adquisición de imágenes idéntica para todas las muestras.</li>
	<li>Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
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<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
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<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
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<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

Este protocolo describe el uso del sistema optogenético TAEL/C120 para lograr la expresión génica inducible por la luz azul. Este sistema consiste en un activador transcripcional, TAEL, que se dimeriza al iluminar con luz azul y activa la transcripción de un gen de interés aguas abajo de un elemento regulador C120. La expresión inducida de un reportero GFP se puede detectar después de tan solo 30 minutos de exposición a la luz, lo que sugiere que este enfoque posee una cinética relativamente rápida y receptiva.
<p cl...

Los sistemas de expresión génica inducibles ayudan a controlar la cantidad, el momento y la ubicación de la expresión génica. Sin embargo, lograr un control espacial y temporal exacto en organismos multicelulares ha sido un desafío. El control temporal se logra más comúnmentemediante la adición de compuestos de moléculas pequeñas 1 o la activación de promotores de choquetérmico 2. Aún así, ambos enfoques son vulnerables a problemas de tiempo, fuerza de inducción y respuestas de estrés fuera del objetivo. El control espacial se logra principalmente mediante el uso de promotores específicos de tejidos3, pero este enfoque requiere un promotor o elemento regulador adecuado, que no siempre está disponible, y no es propicio para la inducción a nivel de subsulares.
En contraste con tales enfoques convencionales, los activadores transcripcionales optogenéticos activados por la luz tienen el potencial de un control espacial y temporal más fino de la expresióngénica 4. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul fue desarrollado y optimizado para su uso en embriones de pez cebra5,6. Este sistema se basa en un factor de transcripción endógeno activado por la luz de la bacteria E. litoralis7,8. El sistema TAEL/C120 consiste en un activador transcripcional llamado TAEL que contiene un dominio de transactivación Kal-TA4, un dominio LOV (detección de luz-oxígeno-voltaje) sensible a la luz azul y un dominio de unión al ADN de hélice-giro-hélice (HTH)5. Cuando se iluminan, los dominios LOV sufren un cambio conformacional que permite que dos moléculas TAEL se dimericen, se unan a un promotor C120 sensible a TAEL e inicien la transcripción de un gen de interés aguasabajo 5,8. El sistema TAEL/C120 exhibe una inducción rápida y robusta con una toxicidad mínima, y puede ser activado por varias modalidades diferentes de suministro de luz. Recientemente, se realizaron mejoras en el sistema TAEL/C120 agregando una señal de localización nuclear a TAEL (TAEL-N) y acoplando el elemento regulador C120 a un promotor basal cFos (C120F)(Figura 1A). Estas modificaciones mejoraron los niveles de inducción en más de 15 veces6.
En este protocolo, se utiliza un panel LED simple para activar el sistema TAEL/C120 e inducir la expresión ubicua de un gen reportero, GFP. La inducción de la expresión se puede monitorear cualitativamente observando la intensidad de la fluorescencia o cuantitativamente midiendo los niveles de transcripción utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo demostrará el sistema TAEL/C120 como una herramienta versátil y fácil de usar que permite una regulación robusta de la expresión génica in vivo.

<table><tbody><tr><td>BioRender herramienta de ilustración científica basada en la web</td><td>BioRender</td><td></td><td></td></tr> Cámara <tr><td>digital CCD</td> de https://biorender.com/ color <td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>Consola compacta de medidor de potencia y energía, LCD digital de 4"</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación, 545 nm</td><td>Olympus</td><td>ET545/25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini kit</td><td>GE Cuidado de la salud</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sal marina</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA Regulable 165 W LED Luz de acuario (azul y blanco)</td><td>Amazon</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW Interruptor temporizador digital programable</td><td>Amazon</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR verde mezcla rápida</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop software de procesamiento de imágenes</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism software de gráficos y estadísticas</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 Fluorescencia Fuente de luz LED</td><td>Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>Descontinuado. Ha sido reemplazado por el X-Cite mini+</td></tr></tbody></table>

expresión de gfp inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético tael/c120

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Los sistemas de expresión génica inducibles son una herramienta invaluable para estudiar los procesos biológicos. Los sistemas de expresión optogenética pueden proporcionar un control preciso sobre el tiempo, la ubicación y la amplitud de la expresión génica utilizando la luz como agente inductor. En este protocolo, se utiliza un sistema de expresión optogenética para lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra. Este sistema se basa en un factor de transcripción diseñado llamado TAEL basado en un factor de transcripción activado por la luz natural de la bacteria E. litoralis. Cuando se ilumina con luz azul, TAEL se dimeriza, se une a su elemento regulador cognado llamado C120 y activa la transcripción. Este protocolo utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan el factor de transcripción TAEL bajo el control del omnipresente promotor ubb. Al mismo tiempo, el elemento regulador C120 impulsa la expresión de un gen reportero fluorescente (GFP). Utilizando un panel LED simple para entregar luz azul activadora, la inducción de la expresión de GFP se puede detectar primero después de 30 minutos de iluminación y alcanza un pico de inducción de más de 130 veces después de 3 h de tratamiento de luz. La inducción de la expresión puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y mediante microscopía de fluorescencia. Este método es un enfoque versátil y fácil de usar para la expresión génica optogenética.

Para esta demostración, se cruzó una línea reportera GFP sensible aC120 ( Tg (C120F: GFP)ucm107) )con una línea transgénica que expresa TAEL-N ubicuamente desde el promotor de ubiquitina b (ubb) (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113)) para producir embriones transgénicos dobles que contienen ambos elementos. 24 h después de la fertilización, los embriones fueron expuestos a la activación de la luz azul, pulsados a una frecuencia de 1 h encendido / 1 h apagado. La inducción de l...

La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.

Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Este protocolo es significativo porque es un método optogenético, o activado por la luz, para inducir la expresión génica, en un organismo intacto. En nuestro caso, un embrión de pez cebra. La ventaja de esta técnica, es que utiliza la luz, como agente inductor, lo que permite un control muy preciso, espacial y temporal de la inducción.Este protocolo sería útil para cualquier situación en la que la expresión génica inducible sería útil. Esto incluye cosas como el rastreo de linaje, ensayos de ganancia de función o experimentos de rescate. Para empezar, coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones para entregar 1,5 milivatios por centímetro cuadrado de potencia de luz a varios embriones a la vez.Para reducir el riesgo de daño fotográfico al activador transcripcional de la cola, coloque la luz a intervalos de una hora de encendido y apagado utilizando un relé de temporizador, si se ilumina durante más de tres horas. Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación. Coloque placas de Petri que contengan embriones de control y una caja a prueba de luz para controles oscuros.Retire los embriones de la iluminación, después de la duración de activación deseada. Para la extracción total de ARN, utilice un kit de extracción de ARN. Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y elimine el exceso de agua de huevo.Después de agregar el tampón de lisis, homogeneice los embriones con el mortero de plástico. Transfiera el lisato a una columna provista del kit y siga las instrucciones del fabricante para purificar el ARN. Almacene el ARN purificado, a menos 20 a menos 80 grados Celsius, hasta que use o sintetice inmediatamente el ADNc a partir de un microgramo, ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.Agregue un microgramo de ARN en una pared delgada de 0,2 mililitros, tubo de PCR, que contiene cuatro microlitros, de cinco veces la mezcla maestra de reacción de ADNc, seguido de la adición de un microlitro, de 20 veces la solución enzimática de transcriptasa inversa. A continuación, conscierre un volumen final de 20 microlitros, con agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en un termociclador programado para la síntesis de ADNc.Almacene el ADNc sintetizado a menos 20 grados centígrados hasta su uso o úselo inmediatamente para la evaluación cuantitativa. Configure las reacciones cuantitativas de PCR que contienen una mezcla maestra de enzimas verdes cibernéticas. Cinco cebadores diluidos de ADNc y GFP a una concentración nanomolar de 325 en triplicados y conducen la reacción en una máquina de PCR programada en tiempo real.Al finalizar la reacción, analice la curva de fusión para determinar la especificidad de la reacción. Calcule la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones de control utilizando el método de TC Delta doble. Y use software estadístico para determinar la significación.Después de retirar los embriones de la iluminación, inmovilice los embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio. Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un microscopio estéreo fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.La cuantificación de la expresión de GFP indicó la inducción de la expresión tan pronto como 30 minutos después de la exposición a la luz azul. Los niveles de expresión de GFP continuaron aumentando hasta seis horas, después de la activación de manera constante. La inducción de GFP también se evaluó cualitativamente examinando la intensidad de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo posteriores a la activación.La fluorescencia GFP por encima de los niveles de fondo se observó por primera vez a las tres horas posteriores a la activación y se volvió notablemente más brillante a las seis horas después de la activación. En contraste, los embriones de control para todos los puntos de tiempo, mantenidos en la oscuridad, no exhibieron ninguna fluorescencia GFP apreciable. La luz activadora debe estar en el rango azul del espectro de luz visible.Tanto la luz de la habitación como la luz solar contienen algo de luz azul. Así que tenga cuidado de proteger sus controles negativos de cualquier fuente de luz ambiental. El sistema TAEL C120, está codificado genéticamente y es modular y puede impulsar la expresión de cualquier gen de interés.Por lo tanto, combinado con otras técnicas, se puede utilizar para responder a una variedad de preguntas biológicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Este video describe técnicas optogenéticas mediante la activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente y el registro de la respuesta conductual provocada con una cámara de video de alta velocidad.

Optogenética del pez cebra: activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente para estudiar las respuestas conductuales de las larvas

En este video, demostramos un procedimiento para generar una línea transgénica estable de pez cebra que expresa constitutivamente una proteína indicadora de voltaje fluorescente después de la coinyección del sistema de transposón Tol2 que comprende el ARNm de la transposasa y la construcción del transposón Tol2 que codifica el indicador de voltaje fluorescente.

Transgénesis del pez cebra mediada por transposones Tol2: un procedimiento para generar peces cebra transgénicos tras la coinyección del sistema Tol2 en embriones fertilizados de pez cebra

Técnicas optogenético han hecho posible el estudio de la contribución de las neuronas específicas de comportamiento. Se describe un método en larvas de pez cebra para la activación de las neuronas somatosensoriales individuales que expresan una variante canalrodopsina (Chef) con un bombeado por diodos de estado sólido (DPSS) láser y el registro de los comportamientos provocados con una cámara de vídeo de alta velocidad.

Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.

Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.

El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Aprende a inducir expresión génica controlada por luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120. Este método permite un control espacial y temporal preciso para estudios de trazado de linaje y ensayos de ganancia de función.

Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

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