Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120
August 19th, 2021
La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.
Este protocolo es significativo porque es un método optogenético, o activado por la luz, para inducir la expresión génica, en un organismo intacto. En nuestro caso, un embrión de pez cebra. La ventaja de esta técnica, es que utiliza la luz, como agente inductor, lo que permite un control muy preciso, espacial y temporal de la inducción.
Este protocolo sería útil para cualquier situación en la que la expresión génica inducible sería útil. Esto incluye cosas como el rastreo de linaje, ensayos de ganancia de función o experimentos de rescate. Para empezar, coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones para entregar 1,5 milivatios por centímetro cuadrado de potencia de luz a varios embriones a la vez.
Para reducir el riesgo de daño fotográfico al activador transcripcional de la cola, coloque la luz a intervalos de una hora de encendido y apagado utilizando un relé de temporizador, si se ilumina durante más de tres horas. Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación. Coloque placas de Petri que contengan embriones de control y una caja a prueba de luz para controles oscuros.
Retire los embriones de la iluminación, después de la duración de activación deseada. Para la extracción total de ARN, utilice un kit de extracción de ARN. Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y elimine el exceso de agua de huevo.
Después de agregar el tampón de lisis, homogeneice los embriones con el mortero de plástico. Transfiera el lisato a una columna provista del kit y siga las instrucciones del fabricante para purificar el ARN. Almacene el ARN purificado, a menos 20 a menos 80 grados Celsius, hasta que use o sintetice inmediatamente el ADNc a partir de un microgramo, ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Agregue un microgramo de ARN en una pared delgada de 0,2 mililitros, tubo de PCR, que contiene cuatro microlitros, de cinco veces la mezcla maestra de reacción de ADNc, seguido de la adición de un microlitro, de 20 veces la solución enzimática de transcriptasa inversa. A continuación, conscierre un volumen final de 20 microlitros, con agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en un termociclador programado para la síntesis de ADNc.
Almacene el ADNc sintetizado a menos 20 grados centígrados hasta su uso o úselo inmediatamente para la evaluación cuantitativa. Configure las reacciones cuantitativas de PCR que contienen una mezcla maestra de enzimas verdes cibernéticas. Cinco cebadores diluidos de ADNc y GFP a una concentración nanomolar de 325 en triplicados y conducen la reacción en una máquina de PCR programada en tiempo real.
Al finalizar la reacción, analice la curva de fusión para determinar la especificidad de la reacción. Calcule la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones de control utilizando el método de TC Delta doble. Y use software estadístico para determinar la significación.
Después de retirar los embriones de la iluminación, inmovilice los embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio. Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un microscopio estéreo fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.
La cuantificación de la expresión de GFP indicó la inducción de la expresión tan pronto como 30 minutos después de la exposición a la luz azul. Los niveles de expresión de GFP continuaron aumentando hasta seis horas, después de la activación de manera constante. La inducción de GFP también se evaluó cualitativamente examinando la intensidad de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo posteriores a la activación.
La fluorescencia GFP por encima de los niveles de fondo se observó por primera vez a las tres horas posteriores a la activación y se volvió notablemente más brillante a las seis horas después de la activación. En contraste, los embriones de control para todos los puntos de tiempo, mantenidos en la oscuridad, no exhibieron ninguna fluorescencia GFP apreciable. La luz activadora debe estar en el rango azul del espectro de luz visible.
Tanto la luz de la habitación como la luz solar contienen algo de luz azul. Así que tenga cuidado de proteger sus controles negativos de cualquier fuente de luz ambiental. El sistema TAEL C120, está codificado genéticamente y es modular y puede impulsar la expresión de cualquier gen de interés.
Por lo tanto, combinado con otras técnicas, se puede utilizar para responder a una variedad de preguntas biológicas.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este protocolo demuestra el uso de la optogenética para lograr la expresión génica inducible por luz en embriones de pez cebra. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul permite un control preciso sobre la expresión génica en un organismo intacto.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Optogenética
- Expresión génica
- Modelos de pez cebra
Antecedentes
- La optogenética es un método activado por luz para inducir la expresión génica.
- Esta técnica proporciona un control espacial y temporal de la inducción.
- Es particularmente útil para el trazado de linaje y ensayos de ganancia de función.
- Los embriones de pez cebra sirven como un modelo para estudiar la expresión génica in vivo.
Propósito del estudio
- Demostrar un método para la expresión génica inducible por luz.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en aplicaciones optogenéticas.
- Facilitar experimentos que requieran un control preciso sobre la expresión génica.
Métodos utilizados
- Colocación de un panel LED en relación con platos de Petri que contienen embriones.
- Entrega de 1.5 miliwattios por centímetro cuadrado de luz.
- Inducción de la expresión génica en múltiples embriones simultáneamente.
- Utilización del sistema optogenético TAEL/C120 para el control génico.
Resultados principales
- Inducción exitosa de la expresión génica en embriones de pez cebra.
- Control espacial y temporal demostrado sobre la activación génica.
- Protocolo confiable proporcionado para futuros estudios optogenéticos.
- Destacó las ventajas de usar la luz como agente inductor.
Conclusiones
- La optogenética ofrece una herramienta poderosa para estudiar la función génica.
- El sistema TAEL/C120 es efectivo para inducir la expresión génica in vivo.
- Este método puede aplicarse a varios escenarios de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
