Name: Imágenes y análisis automatizados para la cuantificación de macropinosomas marcados fluorescentemente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a cuantificar macropinocitosis mediante imágenes automatizadas en formato de microplaca de 96 pocillos. Este protocolo mejora la reproducibilidad y permite estudiar la metabolismo del cáncer con microscopía de fluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de nih/NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. ha recibido un Premio de Beca Postdoctoral TRDRP (T30FT0952). La Citación BioTek 5 es parte del Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, que recibe apoyo financiero de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico del NCI (P30 CA030199). Las figuras 1-3 se crearon utilizando BioRender.

<ol><li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+different+cell+types%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21(2020).</li>
<li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li>
<li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer%3A+a+complex+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li>
<li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li>
<li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li>
<li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%2C+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li>
<li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li>
<li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li>
<li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li>
<li>Lee, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li>
<li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2%2FARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li>
<li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBar-Sagi%2C+D+%22Science%22">Science</a>. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).</li>
<li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li>
<li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li>
<li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).</li>
<li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinosome+quantitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li>
<li>Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).</li>
<li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).</li>
</ol>

C.C. es inventor de una patente emitida titulada "Diagnóstico del cáncer, terapéutica y descubrimiento de fármacos asociados con la macropinocitosis", Patente No.: 9,983,194.

La calidad de los experimentos y la adquisición de datos depende en gran medida de la calidad de los reactivos, la optimización de la configuración y la limpieza de las cubiertas y la microplaca. Los resultados finales deben dar una variación mínima entre las réplicas; sin embargo, las variaciones biológicas ocurren naturalmente o pueden ser causadas por una serie de factores. La densidad celular puede hacer que las células respondan más o menos a los inductores o inhibidores de la macropinocitosis. Por lo tanto, es cruc...

La vía endocítica inespecífica de la macropinocitosis permite a las células internalizar una variedad de componentes extracelulares, incluidos nutrientes, proteínas, antígenos y patógenos, a través de la absorción masiva de líquido extracelular y sus constituyentes1. Aunque es importante para la biología de numerosos tipos celulares, cada vez más, se describe que la vía de la macropinocitosis desempeña un papel esencial en la biología tumoral, donde, a través de la captación macropinocítica, las células tumorales son capaces de sobrevivir y proliferar en presencia de un microambiente agotado de nutrientes2,3. La absorción de macromoléculas extracelulares, incluyendo albúmina y matriz extracelular, y restos de células necróticas, proporciona una fuente alternativa de nutrientes para la producción de biomasa mediante la creación de aminoácidos, azúcares, lípidos y nucleótidos a través del catabolismo de carga mediado por fusión de macropinosomas y lisosomas4,5,6,7,8.
La inducción y regulación de la macropinocitosis son complejas y pueden variar dependiendo del contexto celular. Hasta el momento, se han identificado varios inductores de macropinocitosis e incluyen ligandos, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la galectina-3 y Wnt3A9,10,11,12,13. Además, las condiciones de cultivo que imitan el microambiente tumoral pueden desencadenar la activación de la vía. Los tumores de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) carecen de nutrientes, especialmente para el aminoácido glutamina, que hace que tanto las células cancerosas como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) dependan de la macropinocitosis para la supervivencia7,13,14,15. Además, el estrés tumoral, como la hipoxia y el estrés oxidativo, puede activar esta vía carroñera16. Además de los numerosos influenciadores extrínsecos que pueden inducir macropinocitosis, una variedad de vías intracelulares controlan la formación de macropinosomas. La transformación oncogénica mediada por Ras es suficiente para iniciar la maquinaria macropinocítica, y múltiples tipos de cáncer exhiben macropinocitosis constitutiva oncogénica impulsada por Ras4,5,9,17. Alternativamente, se han identificado la activación de Ras de tipo salvaje y las vías independientes de Ras para activar la macropinocitosis en células cancerosas y CAF10,11,15,18. El uso de varios modelos in vitro en combinación con tratamientos con inhibidores ha dado como resultado la identificación de varios moduladores de macropinocitosis, que incluyen intercambiadores de sodio-hidrógeno, la pequeña GTPasa Rac1, fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), quinasa activada por p21 (Pak) y proteína quinasa activada por AMP (AMPK)4,13,15 . Sin embargo, dada la multitud de factores y condiciones descritos que regulan la macropinocitosis, es concebible que muchos más moduladores y estímulos permanezcan sin descubrir. La identificación de nuevos moduladores y estímulos puede facilitarse mediante la evaluación automatizada de una multitud de condiciones en un solo experimento. Esta metodología puede arrojar luz sobre los factores involucrados en la formación de macropinosomas y puede permitir el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas o productos biológicos que se dirigen a esta vía.
Aquí, hemos adaptado nuestro protocolo previamente establecido para determinar el grado de macropinocitosis en células cancerosas in vitro a un formato de microplaca de 96 pocillos e imágenes y cuantificación automatizadas19,20. Este protocolo se basa en la microscopía fluorescente, que se ha convertido en un estándar en el campo para determinar la macropinocitosis in vitro e in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Los macropinosomas se pueden distinguir de otras vías endocíticas por su capacidad para internalizar macromoléculas grandes, como el dextrano de alto peso molecular (es decir, 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Por lo tanto, los macropinosomas se pueden definir a través de la absorción de dextrano de 70 kDa marcado con fluoróforo administrado extracelularmente. Como resultado, las vesículas macropinocíticas se manifiestan como grupos intracelulares de puntúas fluorescentes con tamaños que oscilan entre 0,2 y 5 μm. Estos puntos pueden ser fotografiados microscópicamente y posteriormente cuantificados para determinar el alcance de la macropinocitosis en la célula- 'el índice macropinocítico'.
En este protocolo, se describen los pasos esenciales para visualizar macropinosomas en células adherentes in vitro en una microplaca de 96 pocillos y cubiertas utilizando equipos de laboratorio estándar (Figura 1). Además, se proporcionan las instrucciones para automatizar la adquisición de imágenes y la cuantificación del índice macropinocítico utilizando un lector de placas multimodo de imágenes celulares. Esta automatización reduce el tiempo, el costo y el esfuerzo en comparación con nuestros protocolos descritos anteriormente19,20. Además, evita la adquisición y el análisis de imágenes involuntariamente sesgados y, por lo tanto, mejora la reproducibilidad y la confiabilidad. Este método se puede adaptar fácilmente a diferentes tipos de células o lectores de placas o utilizarse para determinar características alternativas del macropinosoma, como el tamaño, el número y la ubicación. El método aquí descrito es especialmente adecuado para el cribado de condiciones de cultivo celular que inducen macropinocitosis, la identificación de nuevos moduladores o la optimización de las concentraciones de fármacos de inhibidores conocidos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del ensayo automatizado para determinar el 'índice macropinocítico' en células adherentes. Creado usando BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Corning</td><td>25053CI</td><td>0,1% EDTA en HBSS sin bicarbonato de calcio, magnesio y sodio</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placa</td><td>de cultivo de tejidos Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>Fisherbrand</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 2 L</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-33</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos Placa de cultivo</td><td>de tejidos Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>25 mL Depósito de reactivos</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>28-121</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Vaso de precipitados</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-30</td><td></td></tr> 6 <tr><td>cm Placa de cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>Adaptador de aspiración de 8 canales</td><td>Integra Biosciences</td><td>155503</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de aspiración de 8 canales para puntas estándar</td><td>Integra Biosciences</td><td>159024</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>4355226</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de cristales sin amoníaco</td><td>Sparkle</td><td>FUN20500CT</td><td></td></tr><tr><td>Black Microplaca de cribado de alto contenido de 96 pocillos</td><td>PerkinElmer</td><td>6055300</td><td>CellCarrier-96 Ultra</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td>12 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>Biotek</td><td>CYT5FW</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore Sigma</td><td>5.08741</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70 kDa - FITC</td><td>Life Technologies</td><td>D1822</td><td>Lisina fijable</td></tr><tr><td>Dextrano 70 kDa - TMR</td><td>Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1435</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21031CV</td> Sin Pinzas de <td>Calcio y Magnesio</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Formaldehído, 37%</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-250A</td><td>ACS Glicerol de grado reactivo</td></tr><tr><td></td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje de fluorescencia de endurecimiento</td><td>Agilent Tech</td><td>S302380-2</td><td>DAKO</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Millipore Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-212</td><td>Certified ACS Plus, 36.5%&ndash; 38.0%</td></tr><tr><td>Toallitas sin pelusa</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Portaobjetos de miscroscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-1 Pipeta multicanal</td> de <td>vidrio liso de primera calidad</td></tr><tr><td></td><td>Gilson</td><td></td><td>FA10013 8 canales, 0.5&ndash; 10 y micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Gilson</td><td>FA10012&nbsp;</td><td>12 canales, 20&ndash; 200 y micro; L Pipeta</td></tr><tr><td>multicanal</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td>8 canales, 20&ndash; 200 y micro; L</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Pechiney</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Envoltura de plástico</td><td>Kirkland Signature</td><td>208733</td><td>Stretch-Tite</td></tr><tr><td>Aisladores de silicona</td><td>Grace Bio Labs Inc</td><td>664107</td><td>13 mm Diámetro X 0,8 mm Profundidad ID, 25 mm X 25 mm</td></tr><tr><td>Adaptador de corredera</td><td>Biotek</td><td>1220548</td><td></td></tr><tr><td>Botella de lavado</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0340922C</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes y análisis automatizados para la cuantificación de macropinosomas marcados fluorescentemente

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

La macropinocitosis es una vía de captación de fase fluida no específica que permite a las células internalizar una gran carga extracelular, como proteínas, patógenos y desechos celulares, a través de la endocitosis a granel. Esta vía juega un papel esencial en una variedad de procesos celulares, incluida la regulación de las respuestas inmunes y el metabolismo de las células cancerosas. Dada esta importancia en la función biológica, el examen de las condiciones del cultivo celular puede proporcionar información valiosa mediante la identificación de reguladores de esta vía y la optimización de las condiciones que se emplearán en el descubrimiento de nuevos enfoques terapéuticos. El estudio describe una técnica automatizada de imágenes y análisis utilizando equipos de laboratorio estándar y un lector de placas multimodo de imágenes celulares para la cuantificación rápida del índice macropinocítico en células adherentes. El método automatizado se basa en la absorción de dextrano fluorescente de alto peso molecular y se puede aplicar a microplacas de 96 pocillos para facilitar las evaluaciones de múltiples condiciones en un experimento o muestras fijas montadas en cubiertas de vidrio. Este enfoque tiene como objetivo maximizar la reproducibilidad y reducir la variación experimental, al tiempo que ahorra tiempo y es rentable.

Cuando se siguen en consecuencia los pasos y el ajuste del protocolo descrito anteriormente, los resultados experimentales finales deben proporcionar información sobre si las condiciones de cultivo celular estudiadas o los inhibidores inducen o reducen la macropinocitosis en la línea celular de interés. Para fortalecer la validez de estos hallazgos, la inclusión de condiciones de control permitirá el escrutinio de los resultados para determinar si el experimento se ha completado con éxito. Los controles de inducción de m...

Los ensayos automatizados que utilizan microplacas de múltiples pocillos son enfoques ventajosos para identificar reguladores de vías al permitir la evaluación de una multitud de condiciones en un solo experimento. Aquí, hemos adaptado el protocolo de cuantificación e imágenes de macropinosomas bien establecido a un formato de microplaca de 96 pocillos y proporcionamos un esquema completo para la automatización utilizando un lector de placas multimodo.

Imágenes y análisis automatizados para la cuantificación de macropinosomas marcados fluorescentemente

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

La macropinocitosis es una vía endocítica que es importante para una variedad de procesos celulares, incluido el metabolismo del cáncer. Este protocolo le permite cuantificar el alcance de la macropinocitosis en células in vitro. La automatización tiene como objetivo maximizar la reproducibilidad, la productividad y reducir la variación experimental.Además, la microscopía fluorescente le permite inspeccionar visualmente la muestra para determinar la calidad experimental y evaluar las características adicionales del macropinosoma. Demostrando el procedimiento conmigo estará Cheska Marie Galapate, una asistente de investigación de mi laboratorio. Para la placa de 24 pocillos con formato de funda, use fórceps para agarrar una sola funda del baño de etanol.Golpee el cubrecolchas en la pared interior de la placa para eliminar el exceso de etanol y coloque el cobertor plano en el fondo del pozo. Después de que el etanol se evapore, lave el coverslip dos veces con DPBS, luego sembra las células en la parte superior del coverslip agregando 500 microlitros de la suspensión celular a cada pozo. Coloque las células en una incubadora de células de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que la confluencia celular alcance el 60 a 80% el día antes del etiquetado de macropinosomas.El día antes del etiquetado de macropinosomas, reemplace los medios en los pocillos con 500 microlitros de medios sin suero precalentados y coloque las células en la incubadora durante 16 a 24 horas. Para el formato de microplaca de 96 pocillos, comience transfiriendo la suspensión celular a un depósito de reactivo de 25 mililitros. Luego, utilizando una pipeta multicanal, sembra 100 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una microplaca negra de alto contenido de 96 pocillos con un fondo de olefina o vidrio cíclico ópticamente transparente.Incubar las células hasta que la confluencia celular alcance el 60 a 80% el día antes del etiquetado de macropinosomas. El día antes del etiquetado de macropinosomas, retire y deseche los medios de cada pozo utilizando un adaptador de aspiración multicanal para puntas estándar conectadas a una bomba de vacío. Alternativamente, se puede utilizar una pipeta multicanal.Usando un depósito de reactivo y una pipeta multicanal, agregue suavemente 100 microlitros de medios sin suero precalentados a cada pozo, luego coloque las células en la incubadora de células durante 16 a 24 horas. Para la placa de 24 pocillos con formato de recubierta, reemplace los medios en los pocillos con 200 microlitros de medios sin suero con dextrano de alto peso molecular marcado con fluoróforo y coloque las células en la incubadora de células durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire los medios y lave suave pero rápidamente las células cinco veces con PBS helado usando una botella de lavado preenfriada.Agite firmemente la placa a mano durante los lavados para ayudar a desalojar los agregados de dextrano que se adhieren a las cubiertas. A continuación, fije las células agregando 350 microlitros de formaldehído al 3.7% e incubando durante 20 minutos, luego aspire la solución de fijación y lave las células con PBS dos veces. Tinción de los núcleos con 350 microlitros de DAPI en PBS.Después de 20 minutos, aspire la solución dapi y lave las células con PBS tres veces. Adhiera aisladores de silicona uno al lado del otro en un portaobjetos de microscopio para obtener un espaciado uniforme y una localización reproducible de las cubiertas necesarias para la automatización de imágenes. Luego, para cada funda, agregue una gota de soporte de montaje de fluorescencia endurecida en el portaobjetos del microscopio dentro del espacio abierto del aislador.Tome una funda con fórceps y elimine el exceso de PBS golpeando suavemente el lado de las fundas en una toallita sin pelusa. A continuación, coloque la cubierta boca abajo en la gota del soporte de montaje y toque suavemente la cubierta con pinzas cerradas para eliminar las burbujas de los medios de montaje. Guarde las diapositivas en un ambiente oscuro y permita que los medios de montaje se sequen a temperatura ambiente, lo que generalmente toma de 16 a 24 horas.Antes de tomar imágenes, retire los aisladores del portaobjetos del microscopio. Después de que los portaobjetos se hayan equilibrado a temperatura ambiente, limpie las fundas con un aplicador con punta de algodón humedecido con un limpiador de vidrio sin amoníaco. Posteriormente, use un aplicador limpio con punta de algodón humedecido con etanol al 70% para limpiar el cubrebocas y dejarlo seco.Para el formato de microplaca de 96 pocillos, después de aspirar los pocillos como se demostró anteriormente, agregue 40 microlitros de medios sin suero con dextrano de alto peso molecular marcado con fluoróforo a los pocillos, luego incube las células en la incubadora de células durante 30 minutos. Después de la incubación, deseche los medios en la microplaca moviendo manualmente la placa boca abajo en un vaso de precipitados de cinco litros vacío, luego enjuague las células y la microplaca dos veces sumergiendo lentamente la placa verticalmente en un ligero ángulo en un vaso de precipitados de dos litros lleno de PBS helado y posteriormente deseche el PBS en la microplaca moviendo la placa boca abajo en el vaso de precipitados de cinco litros. Después del último enjuague con PBS, fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído al 3.7% en PBS a cada pozo utilizando un depósito de reactivo de 25 mililitros y una pipeta multicanal.Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, retire la solución de fijación y lave las células con PBS utilizando la técnica de inmersión y desplazamiento. Después del segundo lavado de PBS, tiñe los núcleos con 100 microlitros de DAPI en PBS por pozo. Después de 20 minutos, enjuague las células tres veces con PBS helado como se demostró anteriormente.Retire cualquier PBS residual tocando la microplaca boca abajo en una toallita sin pelusa. Luego agregue 100 microlitros de PBS fresco a cada pozo utilizando un depósito de reactivo de 25 mililitros y una pipeta multicanal. Antes de obtener imágenes, deje que la placa se equilibre a temperatura ambiente, luego seque la placa de cultivo celular con una toallita sin pelusa.Alternativamente, guarde la placa cubierta lejos de la luz a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para imágenes automatizadas de macropinosomas, cree un protocolo de automatización para adquirir las imágenes con un objetivo de aire 40X en el canal de longitud de onda del fluoróforo de dextrano y DAPI. A continuación, optimice la configuración de exposición utilizando una muestra que se predice que tiene el nivel más alto de macropinocitosis para evitar la sobreexposición, lo que puede provocar la saturación de la señal y la pérdida de datos de intensidad.Utilice ajustes de enfoque que localicen la muestra de forma fácil y coherente para producir imágenes de alta calidad. Adquiera múltiples imágenes en cada pozo o cubierta para tener en cuenta la variabilidad de la muestra y obtener una representación precisa de la muestra. Para determinar el índice macropinocítico, reste el fondo de la DAPI y la imagen de dextrano correspondiente aplicando la función apropiada, frecuentemente llamada función de bola rodante.Ajuste la configuración para que el ruido de fondo se minimice con un efecto de resta mínimo o nulo en la señal DAPI y dextran. A continuación, utilizando un campo con señal de alto dextrano, determine la configuración de la señal de intensidad, frecuentemente llamada función umbral, para seleccionar los núcleos, luego determine la configuración de señal de intensidad mínima requerida para seleccionar solo los macropinosomas. Para la imagen de dextrano, calcule la fluorescencia total dentro de la selección de macropinosomas creada o use la selección para determinar el área total positiva para dextrano.Para la imagen DAPI, utilice la selección para determinar el número de núcleos en la imagen para reflejar el número de células presentes. A continuación, determine el índice macropinocítico dividiendo la fluorescencia o área total de dextrano por el número de células determinadas por DAPI. En las células PDAK AsPC-1, agregar EGF a 100 nanogramos por mililitro durante cinco minutos antes de agregar el dextrano activa la macropinocitosis.Además, la activación autocrina del EGF de la macropinocitosis puede ser inducida por la privación de glutamina durante 16 a 24 horas. Las células MIA PaCa-2 muestran macropinocitosis constitutiva que se inhibe mediante un tratamiento de 30 minutos con 75 EIPA micromolares o un tratamiento de dos horas con 10 micromolares EHop-016. En un experimento de dosis-respuesta, el índice macropinocítico disminuyó gradualmente a concentraciones más altas de EHop-016 y EIPA, confirmando así la existencia de macropinocitosis constitutiva dependiente de Rac1.Puede adaptar este procedimiento para evaluar la macropinocitosis de otra carga marcada fluorescentemente, como la albúmina. Además, se recomienda evaluar si la absorción macropinocítica de albúmina contribuye a la aptitud celular mediante la realización de ensayos de viabilidad celular. Esta técnica ha sido fundamental para la identificación del suministro de nutrientes macropinocíticos en el cáncer y las células del estroma y la automatización ha aumentado en gran medida nuestra capacidad de prueba de condición.

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