Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (_5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

El estudio de las proteínas integrales de membrana en su entorno nativo ha sido un desafío debido a la complejidad de la membrana plasmática. Las vesículas lipídicas unilamelares gigantes, o GUV, son una de las plataformas más prominentes para estudiar las propiedades de la biomembrana y pueden diseñarse para imitar diversas condiciones fisiológicas. Este protocolo describe un método para fabricar GUVs incorporados en proteínas basado en la incorporación espontánea, posterior a la hinchazón del hidrogel. Los métodos tradicionales para fabricar GUV no son generalizables para la incorporación integral de proteínas de membrana. Estos métodos son a menudo de bajo rendimiento, metodológicamente complejos y ad hoc, no aplicables a amplias clases de proteínas. Por otro lado, este protocolo representa un método flexible, robusto y simple para incorporar proteínas de membrana integral funcionales en GUVs.Logramos esto preparando un andamio de hidrogel, que contiene la proteína, y depositando una fina capa de lípidos sobre ella. En el ejemplo presentado aquí, incorporamos el receptor acoplado a la proteína G, o GPCR, en los GUVs.Tras la rehidratación de todo el sistema, los GUV brotan de la superficie del hidrogel con la membrana que contiene GPCRs correctamente orientados.Permita que todos los reactivos lleguen a temperatura ambiente. Durante este tiempo, limpie los resbalones de la cubierta colocándolos en metanol y sonicándolos durante 30 minutos a 40