Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus

La alimentación artificial y la recolección de saliva proporcionan un método directo para detectar efectores en la saliva de los insectos. Sin embargo, esto no se ha descrito en detalle antes. Este protocolo es eficaz para la recolección de saliva de insectos saprófitos.

Además, es una técnica simple, ya que utilizamos un medio que contiene solo sacarosa como dieta artificial. La saliva de los insectos saprófitos puede afectar contra el sistema inmunológico del huésped para beneficiar el comportamiento de alimentación y transmitir patógenos. Este medicamento que se puede usar para el comportamiento de los insectos y la investigación de la trayectoria ósea de los insectos.

Este es un método simple de realizar. Sin embargo, esto sugiere el montaje de un entorno experimental limpio a medida que se recolecta saliva para futuras investigaciones. Comience preparando una solución de sacarosa al 5% para la dieta artificial y filtre la solución a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar la contaminación bacteriana y las impurezas.

Muera de hambre aproximadamente 200 pequeñas larvas de tolva de plantas marrones durante tres a cinco horas antes de introducirlas en una cámara de alimentación. A continuación, para preparar los cilindros de vidrio como cámaras de alimentación, cubra un extremo abierto de la cámara con una membrana de parafina antes de introducir los insectos experimentales, luego transfiera los insectos al cilindro de vidrio y cubra el otro extremo de la cámara con una membrana de parafina estirada. Agregue 200 microlitros de dieta artificial en la membrana, luego cubra el líquido con otra capa de membrana de parafina estirada.

Finalmente, cubra la cámara con papel de aluminio, dejando el extremo con el dispositivo de dieta artificial expuesto a la luz. Después de 24 horas, recoja la saliva SBPH enfriando el cilindro a cuatro grados centígrados para inmovilizar a los insectos, luego descubra la película externa y recoja la dieta artificial en tubos estériles de 1,5 mililitros utilizando una pipeta estéril. Mantenga la saliva recolectada a menos 80 grados centígrados hasta el análisis.

A continuación, enjuague la membrana interna con 50 microlitros de dieta artificial fresca tres veces mediante pipeteo suave y recoja la dieta de lavado artificial en tubos estériles de 1,5 mililitros. Después de los tres enjuagues, agregue una dieta artificial fresca en la membrana interna y coloque una membrana de parafina recién estirada en la parte superior. Finalmente, filtre las muestras recolectadas a través de una unidad de filtro de 0.22 micras para eliminar microbios y otros contaminantes.

Transfiera las muestras colectivas de saliva en un filtro centrífugo de 500 microlitros y 10 kilodalton Centrifugar la muestra. Recoge el sobrenadante y eleva el volumen final a 100 microlitros.

Para medir la concentración de la saliva recolectada, encienda el espectrofotómetro UV visible y lave los pedestales tres veces con agua de doble destilación. Seleccione las opciones en la pantalla en el siguiente orden, proteínas, proteína A280. Seleccione el tipo y una unidad de absorbancia igual a un miligramo por mililitro.

Luego marque la casilla para la corrección de línea de base, 340 nanómetros. A continuación, cargue dos microlitros de solución acuosa de sacarosa al 5% en blanco, luego toque Blanco en la parte inferior de la pantalla. Finalmente, después de establecer los estándares, cargue dos microlitros de la saliva recolectada y registre la concentración de proteínas.

Al alimentarse con 5% de sacarosa, más del 80% de SBPH sobrevivió durante los primeros cuatro días. Sin embargo, a partir del quinto día, la mortalidad aumentó rápidamente al 40% y en el séptimo día, menos de la mitad de la SBPH sobrevivió. Un análisis de la página SDS mostró que las muestras de saliva concentrada de la saliva SBPH infectada por rsv contenían muchas más proteínas que el control negativo de sacarosa al 5%.

En un análisis de Western blot para la detección de la proteína de la cápside del VSR, un insecto no infectado y virulífero. La proteína de la cápside del VSR se detectó con éxito en la muestra virulífera, un anticuerpo diseñado contra el producto del gen LssgMP detectó una proteína de 78 kilodalton en muestras no infectadas y virulíferas, demostrando que LssgMP es una proteína de saliva. Un análisis QRT PCR de los niveles de transcripción de LssgMP en diferentes tejidos mostró que los niveles de transcripción de Lssg en la glándula salival eran 20 veces más altos que en todo el cuerpo y el intestino, confirmando la expresión específica de LssgMP en la glándula salival.

Matar de hambre a los insectos experimentales antes de introducirlos en la cámara es necesario para garantizar la eficiencia de nuestra recolección de saliva. Además, se debe recolectar e intercambiar un medio artificial cada 24 horas para reducir la contaminación microbiana en la muestra recolectada. Esta técnica proporciona un método directo para estudiar la función de la saliva en la transmisión de patógenos.

Además, puede ayudar a estudiar la interacción del huésped patógeno de insectos.