Software de adquisición de datos fácil de usar, de alto rendimiento y totalmente automatizado para microscopía crioelectrónica de partícula única

El software automatizado de adquisición de datos es extremadamente necesario para recopilar una gran cantidad de datos criogénicos para la caracterización estructural de macromoléculas biológicas. El paquete de software de adquisición automatizada de datos se utilizó aquí para caracterizar la estructura de varias macromoléculas biológicas, que están directamente asociadas con la biología de patógenos. Por ejemplo, mycobacterium, VIH y SASCO 2.

Para empezar, inicie el software de adquisición automatizada de datos Latitude-S haciendo clic en DigitalMicrograph en el menú de inicio. A continuación, seleccione el Administrador de técnicas y, a continuación, el icono Latitude-S para la recopilación automatizada de datos de partícula única. Para crear una sesión basada en la configuración de la sesión anterior, marque la casilla de verificación basada en la sesión anterior en la paleta y, a continuación, seleccione el botón nuevo o, para continuar una sesión existente, presione el botón Continuar.

Para comenzar una sesión completamente nueva, haga clic en la nueva pestaña de la paleta. Elija la carpeta que contiene la sesión que se va a continuar y seleccione la carpeta para guardar los datos. A continuación, haga clic en el icono de configuración y en el cuadro de exploración de estado administrado que aparece, agregue estado, establezca la condición TEM, la condición de la cámara y la opción de imagen o stock.

Y luego, asigne un nombre al estado o abra el resumen de configuración del estado para abrir la configuración de guardado. A continuación, configure el estado Atlas haciendo clic en la paleta de estados Atlas y establezca los parámetros de aumento, condiciones de iluminación y tiempo de exposición de la cámara, y haga clic en siguiente para pasar al siguiente estado. Luego configure el estado de la cuadrícula haciendo clic en la paleta de estados de la cuadrícula, establezca los parámetros para la óptica de imágenes del microscopio, las condiciones de iluminación y el tiempo de exposición de la cámara, y haga clic en siguiente.

Configure el estado del taladro haciendo clic en la paleta de taladros y establezca la óptica de imagen, las condiciones de iluminación, el binning y los parámetros de tiempo de exposición de la cámara. Después de hacer clic en siguiente, configure el siguiente estado de enfoque haciendo clic en la paleta de enfoque y establezca la configuración del microscopio para la óptica de imágenes, las condiciones de iluminación, el binning y el tiempo de exposición de la cámara. Luego concéntrese en el área de carbono amorfo cerca del agujero y haga clic en siguiente para pasar al siguiente estado.

Configure el estado de los datos haciendo clic en la paleta de datos y establezca los parámetros para la configuración del microscopio, luego haga clic en siguiente. Haga clic en la paleta de configuración de enfoque especificando el rango de valores de desenfoque y el tamaño del paso en la pestaña dada y presione el botón siguiente para pasar al siguiente paso. Concéntrese en las características requeridas en la cuadrícula y haga clic en el botón de captura.

A continuación, coloque la marca de la cruz roja en la misma función en cada imagen de diferentes estados. Comience con los estados Enfoque, Datos y Agujero, porque el campo de visión es más grande que los estados Atlas y Cuadrícula. A continuación, amplíe los estados Atlas y Grid para colocar la marca de la cruz roja en la misma función.

Para calcular las posiciones y el desplazamiento entre cada uno de los cinco estados diferentes y reflejar las posiciones y los desplazamientos en la ventana de salida, haga clic en el botón Calcular. Haga clic en la paleta de captura y elija el tamaño del Atlas para cubrir toda la cuadrícula o parte de la cuadrícula según el requisito. Para capturar el Atlas, navegue en el Atlas y seleccione el cuadrado de cuadrícula en función del grosor del hielo.

Una vez que se seleccionan los cuadrados de cuadrícula deseados, haga clic en el botón de programación y observe cómo se llenan los mosaicos en el cuadrado de cuadrícula a medida que se captura cada cuadrado de cuadrícula. Una vez que se haga clic en el botón de programación, seleccione un orificio representativo en el cuadrado de la cuadrícula agregando la posición del agujero. Una vez adquirida la imagen del agujero, defina los datos y las posiciones de enfoque y guarde el diseño como una plantilla.

Haga clic en búsqueda automática, ingrese el tamaño del orificio y haga clic en el botón buscar en el programa para encontrar automáticamente los orificios según el diámetro. Configure la intensidad para eliminar los orificios del cuadrado de la rejilla y la contaminación por hielo. Y después de agregar las herramientas seleccionadas y de marca amarilla a través de la búsqueda automática, haga clic en el botón de programación en las tareas de latitud.

Según la selección manual inicial de micrografías corregidas por movimiento utilizando el software cisTEM, se encontró que la mayoría de los datos estaban dentro del rango de señal deseado. Además, las imágenes recopiladas en los rangos de desenfoque también fueron verificadas manualmente por cisTEM. Las partículas de espiga se seleccionaron manualmente para calcular los promedios de clase 2D para la visualización estructural, lo que sugirió fuertemente, pero la caracterización estructural de alta resolución fue posible utilizando el conjunto de datos respectivo.

La clasificación 3D indicó que Spike Protein tiene 1RBD en la confirmación abierta hacia arriba y todos los demás RBD en la confirmación de cierre hacia abajo. Las confirmaciones abiertas de 1RBD de la proteína Spike se reconstruyeron utilizando la simetría C1. El mapa de Spike Protein se representa en las vistas laterales superior e inferior.

Y el mapa EM está equipado con estructura atómica para una mejor visualización de las cadenas laterales. Las confirmaciones de cierre de RBD se refinaron con simetría C3 y el modelo refinado 3D de pico y el mapa EM, equipados con estructura atómica como se muestra. Y la confirmación intermedia de la proteína espiga identificada como el subdominio S2 indicó las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos individuales.

Los resultados sugirieron que Latitude-S puede recopilar datos crioEMER de alta resolución de macromoléculas biológicas. Este software automatizado de recopilación de datos podría utilizarse para cualquier otro sistema de microscopía electrónica para recopilar datos automáticamente.