Name: Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a cuantificar el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos mediante un ensayo colorimétrico automatizado. Este método simplificado permite el cribado rápido de fármacos aprobados para terapias dirigidas al huésped contra la tuberculosis.

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Este trabajo fue financiado por Science Foundation Ireland (SFI 08 / RFP / BMT1689), la Junta de Investigación de Salud en Irlanda [HRA-POR / 2012 / 4 y HRA-POR-2015-1145] y Royal City of Dublin Hospital Trust.

Los experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo utilizando la cepa atenuada H37Ra de Mtb, que se puede manejar en un laboratorio de Contención de Nivel 2. Todas las manipulaciones de micobacterias vivas se llevaron a cabo en un gabinete de seguridad biológica (BSC) de Clase II. Se diseñaron procedimientos experimentales para minimizar la generación de aerosoles. El cultivo de células eucariotas (células THP-1) también se llevó a cabo en un BSC de Clase II. El laboratorio llevó a cabo una evaluación de riesgos y se aseguró de que todos los procedimientos se llevaran a cabo de conformidad con las normas institucionales y nacionales de seguridad biológica. Se utilizó la línea celular monocítica humana THP-1 para realizar el método descrito (paso 1). Las células se diferencian en macrófagos después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) antes de la infección con micobacterias.
1. Cultivo celular
<ol><li>Propague el stock de semillas de H37Ra a la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 (MB) suplementado con enriquecimiento de albúmina-dextrosa-catalasa (ADC) (10%) y polisorbato al 0,05% 80. Almacene las existencias de H37Ra en alícuotas de 1 ml en un congelador a -80 °C durante un máximo de 1 año.</li>
	<li>Descongele un vial de 1 ml de Mtb-H37Ra y transfiéralo a un matraz T25 con una tapa filtrante que contenga 9 ml de caldo suplementado con MB aproximadamente 1 semana antes del experimento planificado. Incubar a 37 °C durante 5-7 días en una incubadora estática.</li>
	<li>Cultivar células THP-1 en RPMI-1640 suplementadas con suero fetal de ternera al 10% sin muerte por calor (RPMI (c)completo) en un matraz T75 en una incubadora humidificada con CO2 al 5% y subcultivo dos veces por semana para mantener una densidad de menos de 1 x 106 células/ml.</li>
	<li>Diferenciar las células THP-1 en macrófagos 3 días antes de la infección pipeteando suavemente las células varias veces con una pipeta serológica en matraces T75 para dispersar cualquier grupo y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente, decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 2 ml de RPMI. Realizar el recuento de células para estimar células/ml.</li>
	<li>Seembrar 2 mL de macrófagos THP-1 en placas de cultivo tisular de 12 pocillos a una densidad de 100.000 células/mL en cRPMI con 100 ng/mL PMA durante 72 h. Retire el medio que contiene PMA de las células y reponga con cRPMI fresco antes de la infección por Mtb.</li>
	<li>Configure placas individuales para cada punto de tiempo requerido.</li>
	<li>Células semilla con la misma densidad (100.000 células/ml) en portaobjetos de cámara de vidrio de 2 pocillos para determinar la multiplicidad de la infección (MOI).</li>
	<li>Colocar en una incubadora humidificada deCO2 al 5% durante 3 días a 37 °C.</li>
</ol>2. Cuantificación de la captación de Mtb
<ol><li>Determinación de la captación de Mtb por macrófagos (MOI)
	<ol><li>Instale el gabinete de seguridad biológica (BSC) de clase II el día de la infección y trabaje en dos capas de papel de seda para detectar cualquier derrame. Configure contenedores de desecho de residuos de acuerdo con las regulaciones locales.</li>
		<li>Extraer 6-8 ml de cultivo micobacteriano del matraz T25 y transferirlo a un tubo de polipropileno de 15 ml. NOTA: Los tubos de menor volumen se pueden utilizar para experimentos más pequeños.</li>
		<li>Centrifugar el tubo en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.</li>
		<li>Retire con cuidado el tubo de la centrífuga y transfiéralo al gabinete de seguridad biológica. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.<ol><li>Vierta el sobrenadante en el recipiente de desecho del desinfectante, vuelva a tapar el tubo y resuspenda las bacterias en el medio restante golpeando el costado del tubo. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.</li>
		</ol></li>
		<li>Agregue 2 ml de cRPMI precalentado, mezcle suavemente y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>Resuspender las micobacterias con mucho cuidado con una aguja de 25 G y una jeringa de 5 ml. Para resuspender, extraiga la suspensión de micobacterias en la jeringa y expulse muy suavemente por la pared lateral del tubo para minimizar la producción de aerosol. Repita 6-8 veces. NOTA: Tenga la máxima precaución ya que se trata de un cultivo de micobacterias de alta densidad. Para evitar el riesgo de lesiones por pinchazo de aguja, use agujas romas siempre que sea posible y jeringas Luer lock.</li>
		<li>Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente para objetos punzantes en el BSC.</li>
		<li>Transfiera la suspensión a un tubo de microfuga de 2 ml (con tapón roscado) y centrifugar a temperatura ambiente durante 3 minutos a 100 x g para granular cualquier grumo restante. Devuelva el tubo al gabinete de seguridad y espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.</li>
		<li>Transfiera la parte superior de 1-1.5 ml del sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el tubo original en el cubo de basura que contiene desinfectante. Mezclar bien y añadir varias cantidades de la suspensión micobacteriana (por ejemplo, 5, 25, 50, 150 μL) a los portaobjetos de la cámara de vidrio de 2 pocillos e incubar durante 3 h en una incubadora deCO2 a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción para bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) NOTA: Después de 3 h de incubación, los macrófagos se lavan y se fijan con paraformaldehído para inactivar las micobacterias. Luego, los portaobjetos se tiñen con un kit de auramina O modificada (consulte la Tabla de materiales) para estimar las micobacterias fagocitadas por célula. Debido a su pared celular cerosa, las micobacterias retienen el colorante Auramine después de un lavado ácido-alcohol. Los núcleos de macrófagos se contra-tiñen con Hoechst. Este método permite contar el número de bacterias fagocitadas por célula y se utiliza para determinar la multiplicidad de la infección (MOI) de los macrófagos.<ol><li>Retire el medio del portaobjetos de la cámara de vidrio después de pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para desalojar las bacterias que no han sido fagocitadas.</li>
		<li>Lavar una vez con 2 ml de PBS a temperatura ambiente.</li>
		<li>Almacenar existencias de paraformaldehído al 4%, disueltas en PBS en alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongelar una alícuota de paraformaldehído al 4% inmediatamente antes de su uso. Diluir a 2% de paraformaldehído con PBS y añadir 2 ml por pocillo.</li>
		<li>Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. El portaobjetos de la cámara de vidrio se puede quitar del gabinete de seguridad en esta etapa para teñirlo.</li>
		<li>Lave el tobogán bajo un suave chorro de agua del grifo.</li>
		<li>Dispense suficiente auramina en el portaobjetos para cubrir las células con una pipeta de transferencia de plástico e incube durante 1 minuto a temperatura ambiente en la oscuridad (cubra con papel de aluminio).</li>
		<li>Lave el exceso de tinte del portaobjetos con agua del grifo y agregue el decolorante/enfriador durante 1 minuto en la oscuridad.</li>
		<li>Lave el exceso con agua del grifo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente con Hoechst 33342 (10 μg/ml en PBS) en la oscuridad.</li>
		<li>Lave la mancha de Hoechst con agua del grifo, retire las cámaras, drene el exceso de agua del portaobjetos, agregue una gota de antidecoloración y cubreobjetos, y seque al aire.</li>
		<li>Examine el portaobjetos bajo el microscopio fluorescente utilizando el objetivo de aceite 100x. Las micobacterias emitirán fluorescencia verde bajo el filtro FIFC. Los núcleos fluorescen de color azul bajo el filtro DAPI (Figura 1C).</li>
		<li>Determinar el MOI contando el número de micobacterias fagocitadas por célula y el porcentaje de células infectadas.</li>
		<li>Calcular el volumen de suspensión micobacteriana necesaria para lograr el MOI requerido basado en el área de superficie de un pozo en la placa; Por ejemplo, el área de superficie de las diapositivas de la cámara de vidrio utilizadas en este experimento es de 4 cm2. El MOI bajo (aproximadamente 1-2 bacilos / célula) es deseable para experimentos realizados durante varios días (por ejemplo, 5 días).</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de macrófagos
	<ol><li>Mezcle bien la suspensión de micobacterias y agregue la cantidad necesaria a las células en placas de 12 pocillos una vez que se haya determinado el volumen requerido para lograr el MOI deseado.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que las micobacterias sean fagocitadas.</li>
		<li>Elimine las bacterias extracelulares lavando los pocillos con RPMI caliente o HBSS varias veces.</li>
		<li>Lisar los macrófagos en un pocillo (muestra de 3 h) para determinar el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) del inóculo inicial (muestra de 3 h) como se describe en el paso 3 a continuación.</li>
		<li>Añadir cRPMI fresco y las dosis de fármaco requeridas o control del vehículo a los pocillos restantes, incubar las placas en la incubadora deCO2 a 37 °C durante el tiempo necesario (dependiendo del diseño experimental, pero generalmente a varios intervalos entre 1 y 8 días).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Recolección de muestras para el sistema de detección de cultivo líquido
NOTA: El día de la infección, las micobacterias extracelulares se eliminan mediante lavado, y las micobacterias intracelulares se cosechan mediante lisis de un pocillo de macrófagos (muestra de 3 h) para determinar la cantidad inicial fagocitada como control basal de la infección. En momentos posteriores, tanto el medio, el lisado celular y los lavados se combinan para medir el crecimiento micobacteriano total. El crecimiento extracelular e intracelular también se puede evaluar por separado si se desea.
<ol><li>Recolección de muestra de 3 h para determinar TTP
	<ol><li>Lavar las micobacterias extracelulares de todos los pocillos después de las 3 h iniciales de la infección, tal como se describe en el paso 2.3.3. Agregue 1 ml de medios frescos al pozo de control de 3 h para igualar el volumen de lisado con los de los puntos de tiempo posteriores. NOTA: Ver paso 3.2.7 si las micobacterias extracelulares deben excluirse del análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Recogida de muestras
	<ol><li>Caldo de MB caliente y botellas de cultivo de instrumentos para llevarlas a temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfiera el medio de la placa de 12 pocillos a los tubos cónicos etiquetados correspondientes.</li>
		<li>Agregue 500 μL de tampón de lisis estéril (0.1% Triton x-100 en PBS filtrado a través de un filtro estéril de 0.2 μm) a cada pocillo durante 10 min.</li>
		<li>Raspa suavemente las células del pozo con un raspador estéril y combínalas con el medio en el tubo cónico apropiado.</li>
		<li>Lave el pozo con 0,5 ml de PBS estéril y transfiéralo al tubo apropiado.</li>
		<li>Pase suavemente cada muestra a través de una aguja y una jeringa (25 G) 6-8 veces para romper los grumos. Diluir las muestras 1:10 en caldo MB; 100 μL de muestra + 900 μL MB de medio.</li>
		<li>En los momentos/días requeridos (generalmente entre 1 y 8 días), cosechar las muestras restantes siguiendo los pasos 3.2.1-3.2.6 anteriores. NOTA: Los investigadores pueden preferir excluir las micobacterias extracelulares de su análisis, en cuyo caso, en el paso 3.2.2 anterior, se descarta el medio de cada pocillo y los macrófagos se lavan varias veces antes de agregar tampón de lisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Inocular y cargar botellas de cultivo de instrumentos NOTA: Los detalles del instrumento de cultivo líquido y los consumibles relacionados se proporcionan en la Tabla de materiales.<ol><li>Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire. NOTA: Este paso debe llevarse a cabo en el BSC.</li>
		<li>Prepare los frascos transfiriendo suficientes suplementos nutricionales para todas las muestras en un tubo cónico (0,5 ml / botella). Use una aguja y una jeringa para inyectar 0,5 ml de suplemento nutricional en el frasco de cultivo del instrumento.</li>
		<li>Pipetear 500 μL de la muestra diluida (1:10) en un tubo con fondo en V de 1 ml.</li>
		<li>Utilice una aguja y una jeringa para inyectar los 500 μL de muestra en el frasco de cultivo del instrumento asignado.</li>
		<li>Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire. Limpie las botellas con papel de seda empapado en alcohol al 70% antes de retirarlas del BSC.</li>
		<li>Transporte cuidadosamente las botellas desde el gabinete de bioseguridad hasta el instrumento para cargar.</li>
		<li>Pulse el botón de carga del sistema automatizado de detección microbiana.</li>
		<li>Escanee los códigos de barras de las botellas de cultivo de instrumentos y coloque las botellas en la incubadora del sistema de detección a 37 °C durante un máximo de 42 días. Lea y registre el tiempo necesario para alcanzar la positividad desde la pantalla del instrumento. NOTA: El código de barras permite que el instrumento identifique la botella y vincule las lecturas de reflectancia con una botella en particular.</li>
		<li>Calcular el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) comparando el TTP del inóculo intracelular inicial (Día 0) con el de los macrófagos cultivados durante los tiempos indicados. Un cambio positivo en el porcentaje de TTP significa crecimiento micobacteriano13. Por ejemplo, para el día 3: Cambio porcentual en el tiempo hasta la positividad = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tuberculosis+Report%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global Tuberculosis Report.</a> World Health Organization. , Geneva. (2020).</li>
<li>Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+the+intimate+discourse+of+a+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection.</a> Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).</li>
<li>Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+host-directed+strategies+to+improve+outcome+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis.</a> Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).</li>
<li>Angeby, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BacT%2FALERT+3D+system+for+recovery+and+drug+susceptibility+testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).</li>
<li>Asmar, S., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+culture-based+diagnosis+of+pulmonary+tuberculosis+in+developed+and+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1184(2015).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+liquid+culture+positivity+can+substitute+for+colony+counting+on+agar+plates+in+early+bactericidal+activity+studies+of+antituberculosis+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+positivity+in+liquid+culture+predicts+colony+forming+unit+counts+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+sputum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens.</a> Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).</li>
<li>O'Sullivan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+liquid+culture+for+quantitation+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models.</a> Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Strains+H37ra+and+H37rv+have+equivalent+minimum+inhibitory+concentrations+to+most+antituberculosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs.</a> International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).</li>
<li>O'Leary, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+impairs+human+pulmonary+immunity+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).</li>
<li>Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+infection+induces+non-apoptotic+cell+death+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells.</a> BMC Microbiology. 11, 237(2011).</li>
<li>Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+mycobacterium+tuberculosis+strains+evade+apoptosis+of+infected+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages.</a> The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).</li>
<li>Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+therapy+with+interferon-gamma+for+the+treatment+of+pulmonary+tuberculosis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review.</a> International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).</li>
<li>Thorpe, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BacT%2FAlert%3A+an+automated+colorimetric+microbial+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).</li>
<li>Gleeson, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Mycobacterium+tuberculosis+induces+aerobic+glycolysis+in+human+alveolar+macrophages+that+is+required+for+control+of+intracellular+bacillary+replication%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication.</a> The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microparticles+encapsulating+all-trans-Retinoic+acid+%28ATRA%29+as+a+host-directed%2C+adjunctive+treatment+for+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharpening+nature%27s+tools+for+efficient+tuberculosis+control%3A+A+review+of+the+potential+role+and+development+of+host-directed+therapies+and+strategies+for+targeted+respiratory+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Ortalo-Magne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+outermost+capsular+material+of+the+tubercle+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus.</a> Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).</li>
<li>Stokes, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycan-rich+outer+layer+of+the+cell+wall+of+Mycobacterium+tuberculosis+acts+as+an+antiphagocytic+capsule+limiting+the+association+of+the+bacterium+with+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages.</a> Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).</li>
<li>O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-independent+pathway+mediates+macrophage+cell+death+in+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).</li>
<li>Cheon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).</li>
<li>Nathan, C., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TB+drug+development%3A+immunology+at+the+table%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">TB drug development: immunology at the table.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).</li>
<li>Bowness, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Mycobacterium+tuberculosis+MGIT+time+to+positivity+and+cfu+in+sputum+samples+demonstrates+changing+bacterial+phenotypes+potentially+reflecting+the+impact+of+chemotherapy+on+critical+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).</li>
<li>Basu Roy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auto-luminescent+fluorescent+BCG+whole+blood+assay+to+enable+evaluation+of+paediatric+mycobacterial+responses+using+minimal+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores han utilizado el método de cultivo líquido descrito en este protocolo para monitorizar el crecimiento de Mtb en macrófagos derivados de monocitos y macrófagos alveolares y células THP-1 diferenciadas con PMA11,16,17. Esta técnica también puede ser modificada para su uso con células no adherentes12. Más recientemente, el instrumento también se utilizó en estudios preclínicos para evaluar el áci...

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis, fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial en 20191. Para evadir las defensas del huésped, Mtb subvierte la actividad micobactericida de las células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas (DC), lo que le permite persistir intracelularmente y replicarse2. La falta de una vacuna eficaz para prevenir la tuberculosis pulmonar en adultos y la creciente aparición de cepas resistentes a los medicamentos ponen de relieve la necesidad urgente de nuevas terapias.
Las terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) podrían acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia3. La evaluación preclínica de los candidatos a HDT in vitro para determinar la actividad micobactericida dentro de los macrófagos a menudo se basa en la cuantificación del crecimiento de Mtb por unidades formadoras de colonias (UFC) en placas sólidas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. Los sistemas automatizados de detección microbiana basados en caldos disponibles comercialmente se utilizan más comúnmente en los laboratorios de microbiología clínica para la detección y las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de Mtb y otras especies micobacterianas en muestras clínicas4. Estos instrumentos miden el crecimiento indirectamente en función de la actividad metabólica bacteriana que conduce a cambios físicos en los medios de cultivo (cambio en los niveles o presión de CO2 uO2) monitoreados a lo largo del tiempo5. La lectura es el tiempo de positividad (TPP), que previamente se ha demostrado que se correlaciona con Mtb CFU en muestras de esputo de pacientes con TB en respuesta al tratamiento 6,7 y en lisados de pulmón y bazo murinos infectados8. Además, se han utilizado sistemas de detección de cultivos líquidos para medir el efecto de las terapias convencionales dirigidas a patógenos sobre el crecimiento de micobacterias en cultivo axénico y macrófagos cultivados 9,10. El instrumento también se ha utilizado para investigar la capacidad innata de las células dendríticas y de los macrófagos alveolares para controlar el crecimiento intracelular de Mtb11,12. Este protocolo experimental demuestra que se puede adaptar un sistema de diagnóstico de cultivo líquido para realizar el cribado preclínico de HDT para TB en macrófagos cultivados. En comparación con la enumeración de UFC, la principal ventaja de esta técnica es que reduce considerablemente el trabajo experimental y el tiempo requerido para cuantificar el crecimiento/supervivencia micobacteriana intracelular. Esta técnica se basa en el acceso a un instrumento de cultivo automatizado que se puede utilizar para evaluar la supervivencia micobacteriana intracelular en células inmunes tratadas con una amplia gama de reactivos farmacológicos dirigidos a las funciones celulares para aumentar la inmunidad del huésped.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente IX51</td><td>Olympus, Japón</td><td>N/A</td><td>Detección e imagen de la AFB</td></tr><tr><td>Microtubo de 2 mL, fondo plano, tapón de rosca, estéril</td><td>Sarstedt, Carolina del Norte, EE. UU</td>. <td>72.694.006</td><td>Mtb infección por macrópahges</td></tr><tr><td>jeringa de 5 mL, Luer lock</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>SZR-150-031K</td><td>Infección por macrópegos/UFC Tubo de</td></tr><tr><td>50 mL, estéril</td><td>Sarstedt, Norte Carolina, EE.UU.</td><td>62.547.254</td><td>Infección por Mtb de macrópahges</td></tr><tr><td>ácido todo-trans-retinoico (ATRA) &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.</td><td>R2625</td><td>Candidato a terapia dirigida por el huésped</td></tr><tr><td>Sistema de detección microbiana 3D BacT/ALERT</td><td>Biomerieux (Hampshire, Reino Unido)</td><td>247001</td><td>Sistema de detección colormétrica basado en caldo</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp; Suplemento de nutrientes BACT/ALERT MP</td><td>Biomerieux ( Hampshire, Reino Unido)</td><td>414997</td><td>Ensayo de detección colormétrica basado en caldo</td></tr><tr><td>Botellas de cultivo BACT/ALERT MP</td><td>Biomerieux (Hampshire, Reino Unido)</td><td>419744</td><td>Ensayo de detección colormétrica basado en caldo</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Enrichmentment, 20 mL</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>M0553</td><td>Cultivo líquido de micobacterias</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook OADC Enriquecimiento, 20mL</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>M0678</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Raspador de células, 25 cm</td><td>Sarstedt, Carolina del Norte, EE. UU</td>. <td>83.1830</td><td>Cosecha de lisados de lmacrófagos</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Corning, 0.2 y micro; m</td><td>Corning Incorporated, Alemania</td><td>431219</td><td>Esterilización de tampón de lisis</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (borosilicato), 24 x 50 mm, espesor #1,5</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida, de microbiano</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.</td><td>C7698</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Medio de montaje fluorescente Dako</td><td>Agilent Technologies Ireland Limited</td><td>S3023</td><td>Antidecoloración medio de montaje</td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.</td><td>D8537</td><td>Infección por macropahges Mtb</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EE. UU.</td><td>10270106</td><td>Cultivo de células de macrófagos</td></tr><tr><td>Glicerol, Difco</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>228220</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (bisBenzimida H 33342 triclorhidrato)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.</td><td>B2261</td><td>Tinción nuclear</td></tr><tr><td>IFN&gamma;, R& recombinante humano</td><td> D Systems Inc, Minnesota, EE. UU.</td><td>285-IF Candidato a</td><td>terapia dirigida al huésped</td></tr><tr><td>Labtek Portaobjetos de 2 pocillos, estéril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EE. UU.</td><td>TKT-210-150R</td><td>Infección por macropaves</td></tr><tr><td>L-asparagina anhidra</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU</td>. <td>A4159</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU</td>. <td>PZ0014</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica Microlance 25 g</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.</td><td>300400</td><td>Infección por mtb de macrópatos/UFC</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Base de agar</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>M0303</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Base de caldo</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td>. <td>M0178</td><td>Cultivo líquido de micobacterias</td></tr><tr><td>Tinte y decolorante</td> <td>de auramina O modificadoLaboratorio de Dispositivos Científicos, Illinois, EE. UU.</td><td>345-250</td><td>Tinción</td>de</tr><tr><td>AFB Paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.</td><td>158127</td><td>Infección de Mtb de macrófagos</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 92 x 16 mm (20/bolsa)</td><td>Sarstedt, Carolina del Norte, EE. UU.</td><td>82.1473.001</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU</td>. <td>P8139</td><td>Cultivo de células de macrófagos</td></tr><tr><td>Polisorbato 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San José, CA, EE. UU</td><td>. 231181</td><td>Cultivo líquido de micobacterias</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EE. UU.</td><td>52400025</td><td>Cultivo de células macrófagos</td></tr><tr><td>Esparcidor de células estériles, en forma de</td><td>L Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, EE. UU</td>. <td>RB-44103</td><td>Unidades formadoras de colonias</td></tr><tr><td>Matraz T25 TC, cuello angulado, tapón filtrante, estéril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, EE. UU.</td><td>156367</td><td>Cultivo líquido de micobacterias</td></tr><tr><td>THP-1 línea celular</td><td>ATCC, Virginia, EE. UU.</td><td>ATCC TIB-202</td><td>Cultivo de células de macrófagos</td></tr></tbody></table>

un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial hasta la llegada de COVID-19. Mtb ha evolucionado para persistir en su entorno intracelular, evadir las defensas del huésped y ha desarrollado resistencia a muchos medicamentos antituberculosos. Un enfoque para resolver la resistencia es identificar los medicamentos aprobados existentes que aumentarán la respuesta inmune del huésped a Mtb. Estos medicamentos podrían reutilizarse como terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) para acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia a los antibióticos.
La cuantificación del crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos es un aspecto crucial de la evaluación del HDT potencial. El estándar de oro para medir el crecimiento de Mtb es contar unidades formadoras de colonias (UFC) en placas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. En este protocolo, se ha adaptado un sistema de cultivo automatizado basado en caldo, que se usa más comúnmente para detectar Mtb en muestras clínicas, para la detección preclínica de terapias dirigidas al huésped. Se evaluó la capacidad del sistema de ensayo de cultivo líquido para investigar el crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos tratados con HDT. Los HDT probados por su capacidad para inhibir el crecimiento de Mtb fueron ácido retinoico todo-trans (AtRA), tanto en solución como encapsulado en micropartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y la combinación de interferón-gamma y linezolid. Las ventajas de esta técnica automatizada basada en el cultivo líquido sobre el método CFU incluyen simplicidad de configuración, preparación menos laboriosa y un tiempo de obtención de resultados más rápido (5-12 días en comparación con 21 días o más para las placas de agar).

El instrumento automatizado de cultivo líquido utilizado en este estudio monitorea los niveles deCO2 cada 10 min. Un cambio de color en el sensor en la parte inferior de la botella del instrumento se mide colorimétricamente y se expresa como unidades de reflectancia. Luego, el software del instrumento aplica algoritmos de detección para calcular el tiempo de positividad (TTP), es decir, el número de días desde la inoculación hasta que los cultivos se marcan como positivos (Figura 1A</stron...

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

La principal ventaja de este protocolo es que requiere menos mano de obra y mucho tiempo que el método tradicional de contar unidades formadoras de colonias para estimar el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis. Esta técnica hace que sea más fácil para los investigadores examinar rápidamente los medicamentos aprobados por la FDA con el objetivo de reutilizarlos como terapias dirigidas al huésped para tratar la tuberculosis. El método es muy simple y directo.El conocimiento básico de las técnicas de cultivo de células T portadoras de micobacterias y EO sería suficiente para seguir el protocolo paso a paso. Para comenzar, transfiera de seis a ocho mililitros de cultivo micobacteriano atenuado H37Ra del matraz T25 a un tubo de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugar el tubo en una centrífuga de sobremesa.Después de retirar cuidadosamente el tubo, transfiera el tubo al gabinete de seguridad biológica y espere un minuto para que las bacterias se asienten. Vierta el sobrenadante en el recipiente de desecho del desinfectante. Luego, vuelva a tapar el tubo y suspenda las bacterias en el medio restante golpeando suavemente el costado del tubo y permitiendo que las bacterias se asienten durante un minuto.Agregue y mezcle dos mililitros de RPMI completo precalentado y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. Para resuspender las micobacterias, extraiga la suspensión en una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25. Luego, expulse muy suavemente por la pared lateral del tubo para minimizar la producción de aerosol y repita el proceso de seis a ocho veces.Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente para objetos punzantes en el gabinete de bioseguridad. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y centrífuga para granular cualquier grumo restante. Devuelva el tubo al gabinete de seguridad y deje que las bacterias se asienten durante un minuto.Transfiera los 1 a 1,5 mililitros superiores del sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el tubo original en el cubo de basura que contiene el desinfectante. Mezcle bien y agregue varias cantidades de la suspensión micobacteriana a los dos portaobjetos de la cámara de vidrio del pozo, e incube los portaobjetos durante tres horas a 37 grados centígrados.Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para desalojar las bacterias no fagocitadas, retire el medio del portaobjetos de la cámara de vidrio. Lavar una vez con dos mililitros de PBS. Descongele las alícuotas de PFA al 4% en PBS almacenadas a menos 20 grados centígrados.Diluir la alícuota al 2% PFA y añadir dos mililitros a cada pocillo. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire el portaobjetos del gabinete de seguridad para teñirlo. Deseche el PFA en el contenedor de desechos químicos de PFA y lave el tobogán bajo un chorro suave de agua del grifo.Usando una pipeta de transferencia de plástico, dispense suficiente auramina para cubrir las células en el portaobjetos e incube el portaobjetos durante un minuto a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave el exceso de tinte del portaobjetos con agua del grifo y agregue el enfriador durante un minuto en la oscuridad. Después de lavar el exceso de enfriador, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente con la tinción de Hoechst en la oscuridad.Luego lave la mancha de Hoechst. Y después de drenar el exceso de agua, agregue una gota de antifade y un cubreobjetos. Examine el portaobjetos secado al aire bajo el microscopio fluorescente utilizando el objetivo de aceite 100x.Las micobacterias emitirán fluorescencia verde bajo el filtro Fitz y los núcleos fluorescerán en azul bajo el filtro DAPI. Contar el número de micobacterias fagocitadas por célula y el porcentaje de células infectadas para determinar MOI. Calcule el volumen de suspensión micobacteriana necesaria para lograr el MOI requerido en función del área de superficie de un pozo en la placa.Después de mezclar la suspensión de micobacterias, agregue el volumen calculado a las celdas en 12 placas de pocillos para lograr el MOI deseado. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante tres horas para permitir que las micobacterias sean fagocitadas. Luego elimine las bacterias extracelulares lavando los pocillos con RPMI caliente varias veces.Agregue 500 microlitros de tampón de lisis durante 10 minutos para lisar los macrófagos en un pocillo de la muestra de tres horas, y recoja el lisado para determinar la tasa de infección inicial. Luego agregue RPMI completo fresco y las dosis de medicamentos requeridas, o control del vehículo, a los pozos restantes. Incubar las placas en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante uno a ocho días, dependiendo del diseño del experimento.Determinar el porcentaje de tiempo hasta la positividad, o TTP, del inóculo inicial de la muestra de tres horas, caldo Middlebrook caliente y botellas de cultivo de instrumentos a temperatura ambiente. Transfiera el medio de la placa de 12 pocillos a los tubos cónicos etiquetados correspondientes y agregue 500 microlitros de tampón de lisis estéril a cada pocillo. Después de 10 minutos, raspe suavemente las células del pozo con un raspador estéril y combínelas con el medio en el tubo cónico apropiado.Una vez que el pozo se lava con 0,5 mililitros de PBS estéril y se combina con el medio y el lisado, rompa los grumos pasando suavemente cada muestra a través de una jeringa de aguja de calibre 25 de seis a ocho veces. Diluir la muestra en caldo MB agregando 900 microlitros de caldo MB a 100 microlitros de muestra, y repetir el proceso de cosecha en los puntos de tiempo requeridos durante la incubación. Prepare las botellas del grupo de instrumentos esterilizando la tapa de goma con 70% de alcohol.Transfiera suficientes suplementos nutricionales para todas las muestras en un tubo cónico y use una aguja y una jeringa para inyectar 0,5 mililitros de suplemento nutricional en el frasco de cultivo del instrumento. Luego, pipetear 500 microlitros de la muestra diluida de uno en 10 en un tubo inferior en V de un mililitro. Use una aguja y una jeringa para inyectar los 500 microlitros de muestra en las botellas de cultivo de instrumentos asignadas.Después de transportar cuidadosamente las botellas desde el gabinete de bioseguridad hasta el instrumento para cargar, presione el botón de carga en el sistema automatizado de detección microbiana. Escanee los códigos de barras en las botellas de cultivo de instrumentos y coloque las botellas en la incubadora del sistema de detección a 37 grados centígrados durante un máximo de 42 días. Lea y registre el tiempo necesario para alcanzar la positividad desde la pantalla del instrumento y calcule el porcentaje TTP.Un TTP positivo indica crecimiento micobacteriano. El instrumento automatizado de cultivo líquido monitoreó los niveles de dióxido de carbono cada 10 minutos y calculó TTP, que es el número de días desde la inoculación hasta que los cultivos se marcan como positivos. Se ilustró una relación inversa entre TTP y los valores log(10) de UFC en el inóculo inicial.Cuando se comparó el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis dentro de macrófagos determinado mediante la enumeración de UFC con el método de cultivo automatizado descrito, se obtuvo una correlación significativa entre los resultados. El crecimiento de Mycobacterium tuberculosis se presentó gráficamente comparando los valores de TTB hasta ocho días después de la infección de macrófagos con el valor inicial de TTP. Una tendencia similar entre UFC y cultivo líquido demostró una inhibición significativa del crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos en presencia de ácido todo-transretinoico, o AtRA, en solución, o la dosis equivalente de AtRA encapsulada en micropartículas de PLGA.Se llevó a cabo un experimento de dosis-respuesta en células THP-1 infectadas para determinar la eficacia del antibiótico linezolid solo, o la combinación de linezolid e interferón gamma. No se observó interacción significativa entre los fármacos. La tinción de AFP nos permite utilizar un MOI bajo para minimizar la muerte celular al infectar macrófagos, y para asegurar que se utiliza el mismo MOI independientemente del tratamiento utilizado.Siguiendo este protocolo, los principales medicamentos antituberculosos pueden identificarse y estudiarse más a fondo para investigar su eficacia in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis es difícil, pero fundamental para el cuidado del paciente. Este formato de placa de microtitulación ofrece la prueba de 12 medicamentos antimicobacterianos y proporciona la concentración inhibitoria mínima (CIM) los valores, que ayudará en el tratamiento adecuado.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aquí, demostramos la preparación del filtrado de cultivo de Mtb (CF), que es el medio de crecimiento bacteriano que consiste en proteínas secretadas por las bacterias. Mtb segrega proteínas para modular la señalización del huésped y la respuesta inmunitaria, que son cruciales para la patogénesis. Los CFs preparados se analizan por espectrometría de masas para identificar todos los factores secretores.

Preparación de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis para comprender la patogénesis de la tuberculosis

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a cuantificar el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos mediante un ensayo colorimétrico automatizado. Este método simplificado permite el cribado rápido de fármacos aprobados para terapias dirigidas al huésped contra la tuberculosis.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

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