Una prueba conductual para las convulsiones inducidas por el calor en modelos de epilepsia en ratones
12 de julio de 2021
El objetivo del método es detectar hipertermia o convulsiones inducidas por el calor en modelos de ratón. El protocolo describe el uso de una cámara personalizada con monitoreo continuo de la temperatura corporal para determinar si la temperatura corporal elevada conduce a convulsiones.
Las mutaciones GEFS+ causan convulsiones febriles en los pacientes. La capacidad de estudiar las convulsiones inducidas por hipotermia en ratones GEFS+ nos permite examinar la relación entre mutaciones específicas y el perfil convulsivo. El controlador de temperatura digital ayuda a establecer el gradiente de temperatura en la caja de calefacción de una manera reproducible.
Por lo tanto, la temperatura corporal del ratón se puede aumentar a un ritmo lento y constante. Este protocolo se puede utilizar para identificar posibles terapias, como medicamentos o restricciones dietéticas, que se pueden utilizar para reducir o eliminar las convulsiones febriles. Para insertar la sonda de temperatura rectal en el ratón sin lesiones, recomendamos anestesiar brevemente el ratón y lubricar la punta de la sonda rectal.
Comience encendiendo la cámara de calor del mouse con el botón de encendido y luego presione el botón de encendido de calor. Usando el teclado en el controlador de temperatura digital, ajuste la temperatura de la cámara de calor a 50 grados centígrados. Forrar el piso de la cámara de calor con ropa de cama de mazorca.
Monte una cámara de grabación de video frente a la cámara de calor. Forra una placa de Petri de 140 milímetros de diámetro con capas gruesas de papel de seda y colócala sobre hielo para que sirva como almohadilla de enfriamiento. Para el ensayo de detección, asegúrese de que el peso corporal del ratón sea de 15 gramos o más.
Antes de comenzar el procedimiento, confirme que el ratón está completamente anestesiado con un pellizco en el dedo del pie. Cubra la punta metálica de la sonda de temperatura rectal con un lubricante e insértela suavemente en el mouse. Asegure la sonda rectal a la cola del ratón con cinta adhesiva.
Coloque el ratón en una nueva jaula de recuperación forrada con ropa de cama de mazorca. Inicie un temporizador y observe al ratón durante cinco minutos mientras monitorea la temperatura corporal central, hasta que el ratón se recupere completamente de la anestesia y la temperatura se estabilice en 35 a 36 grados centígrados. Al final de cinco minutos, observe la temperatura corporal del ratón como la temperatura corporal inicial a cero minutos.
Transfiera el ratón rápidamente al suelo de la cámara de calor del ratón precalentada para comenzar el ensayo del experimento. Después de colocar el mouse en la cámara del mouse precalentada, encienda la cámara y el cronómetro, aumente la temperatura de la cámara de calor a intervalos regulares, de modo que la temperatura corporal del mouse aumente a una velocidad de 25, 2.5 grados Celsius por minuto. Comience a registrar la temperatura corporal del ratón a intervalos de un minuto durante la duración del experimento.
A los 9,5 minutos, ajuste la temperatura de la cámara de calor a 55 grados centígrados para estabilizar la temperatura de la cámara de calor a 55 grados centígrados en el minuto 10. Del mismo modo, logre una temperatura estable de la cámara de calor a 60 grados centígrados en el minuto 20. Cada ensayo de detección de convulsiones dura 30 minutos.
Si el ratón experimenta una convulsión, registre la temperatura corporal del ratón durante la convulsión, como temperatura umbral de la convulsión. Tome nota de las características de comportamiento de las convulsiones mostradas por el mouse, luego recoja rápidamente el mouse de la cámara y colóquelo en la almohadilla de enfriamiento. Si un ratón no experimenta convulsiones inducidas por el calor dentro del período de observación de 30 minutos, o la temperatura corporal del ratón alcanza los 44 grados centígrados, coloque el ratón en la almohadilla de enfriamiento.
Cuando la temperatura corporal del ratón baje a 36 a 37 grados centígrados, transfiera el ratón a una jaula de recuperación. Para quitar la sonda rectal del ratón, corte cuidadosamente la cinta entre la cola del ratón y el cable de la sonda rectal. Limpie y limpie la punta metálica de la sonda rectal con etanol al 70%.
Observe al ratón hasta que se recupere antes de devolverlo a la jaula de la casa. Siga supervisando el estado del ratón. Marque el final de la prueba del experimento.
Restablezca la temperatura de la cámara de calor del ratón a 50 grados centígrados y permita que se equilibre antes del siguiente ensayo. En el ensayo de convulsión de calor, la temperatura corporal media de los ratones se registró cada minuto utilizando el protocolo de calentamiento, y se evaluó la tasa de cambio de temperatura corporal a lo largo del tiempo. No hubo diferencias en la tasa de cambio de la temperatura corporal entre los ratones heterocigotos mutantes y de tipo salvaje, en los respectivos antecedentes genéticos.
Los grupos experimentales y de control de ratones mostraron un comportamiento diferente cuando se expusieron a un aumento periódico de la temperatura corporal. Todos los ratones mutantes heterocigotos de 129X1 o B6NJ exhibieron convulsiones inducidas por calor. Ninguno de los ratones de tipo salvaje en el fondo enriquecido con 129X1 experimentó convulsiones, mientras que solo un tercio de los ratones del fondo B6NJ sensible a las convulsiones mostró convulsiones.
Una temperatura umbral convulsiva media de ratones mutantes de 129X1 no fue significativamente diferente de la temperatura umbral convulsiva media observada en ratones B6NJ. Un tercio de los ratones de tipo salvaje B6NJ que mostraron convulsiones inducidas por calor, tenían una temperatura umbral de convulsiones que era significativamente más alta que los ratones mutantes heterocigotos B6NJ. La gravedad de las convulsiones se midió utilizando la escala de Racine modificada.
La puntuación máxima de Racine de ratones mutantes heterocigotos en un fondo enriquecido con 129X1 no fue significativamente diferente de la de los ratones mutantes heterocigotos en el fondo genético B6NJ. Al establecer el protocolo de calentamiento, asegúrese de que la temperatura corporal del ratón no aumente a un ritmo superior a 25 grados centígrados por minuto, o puede ser perjudicial para la salud del animal. Sería muy genial combinar el protocolo de calentamiento con grabaciones simultáneas de EEG, que nos permitirían correlacionar diferentes patrones de actividad cerebral con diferentes tipos de comportamiento convulsivo.
Descripción general
Este estudio investiga los efectos de la hipertermia en la inducción de convulsiones en modelos murinos, centrándose específicamente en las mutaciones GEFS+. Se utiliza una cámara de calor construida a medida para monitorear continuamente la temperatura corporal y evaluar si las temperaturas elevadas desencadenan convulsiones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurobiología del comportamiento
- Investigación sobre convulsiones
Antecedentes
- Las mutaciones en GEFS+ están asociadas con convulsiones febriles en pacientes.
- Los modelos de ratón de GEFS+ permiten examinar los efectos específicos de las mutaciones en los perfiles convulsivos.
- Comprender las convulsiones inducidas por el calor puede orientar terapias potenciales para las convulsiones febriles.
Objetivo del estudio
- Para detectar convulsiones inducidas por hipertemia en modelos de ratón.
- Para determinar la relación entre mutaciones genéticas y la susceptibilidad a convulsiones bajo temperaturas elevadas.
- Para identificar terapias potenciales que mitiguen las convulsiones febriles.
Métodos Utilizados
- Una cámara de calor construida a medida para monitorear la temperatura corporal del ratón durante los ensayos del experimento.
- Uso de modelos de ratón GEFS+ prestando atención al peso corporal y a la anestesia para obtener mediciones precisas.
- Los gradientes de temperatura se ajustan para aumentar gradualmente la temperatura corporal y evaluar los umbrales de convulsión.
- Se incluyen observaciones visuales y evaluaciones del comportamiento durante un período de ensayo de 30 minutos.
Resultados Principales
- Las convulsiones inducidas por calor variaron significativamente entre los ratones mutantes heterocigotos y los de tipo silvestre.
- Las temperaturas medias umbral para las convulsiones mostraron patrones distintos entre los diferentes fondos genéticos.
- Se registraron las características del comportamiento convulsivo, lo que proporcionó información sobre las variaciones en la respuesta a temperaturas elevadas.
Conclusiones
- El estudio establece una metodología para evaluar la susceptibilidad a convulsiones relacionada con la temperatura en modelos murinos.
- Los resultados destacan las influencias genéticas sobre los umbrales y comportamientos convulsivos en condiciones hipertérmicas.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos subyacentes a las convulsiones febriles y podrían orientar enfoques terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la inducción reproducible y controlada por temperatura de convulsiones inducidas por calor en modelos de ratón, apoyando la validación de dianas en la investigación de la epilepsia. Proporciona una evaluación conductual cuantitativa para analizar modificadores genéticos de la susceptibilidad a convulsiones, ayudando en la reducción de riesgos preclínicos de candidatos terapéuticos. El ensayo facilita la evaluación temprana de compuestos que podrían modular los umbrales de convulsiones febriles, orientando las decisiones de avance o interrupción en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Estudia las relaciones genotipo-fenotipo en epilepsias relacionadas con SCN1A mediante la vinculación de mutaciones específicas con fenotipos de convulsiones inducidas por calor.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas genéticas mediante mediciones estandarizadas y cuantificables del umbral de convulsiones.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al identificar contextos genéticos que confieren distinta susceptibilidad a convulsiones bajo estrés hipertérmico.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera datos similares a una curva dosis-respuesta al correlacionar el aumento de la temperatura corporal con el inicio de convulsiones, permitiendo la determinación del umbral.
- Valor operativo: Proporciona lecturas conductuales reproducibles y compatibles con alto rendimiento para campañas de cribado de compuestos.
- Preparación del ensayo: Produce métricas estandarizadas de severidad convulsiva mediante una escala Racine modificada, facilitando la comparabilidad entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Modela la progresión de las convulsiones febriles en ratones con GEFS+, lo que permite la evaluación preclínica de intervenciones modificadoras de la enfermedad.
- Utilidad preclínica: Permite una transición ajustada al riesgo mediante la identificación de compuestos que aumentan el umbral de convulsión o reducen la gravedad de las convulsiones en modelos mutantes.
- Correlación con biomarcadores: Facilita la correlación entre los umbrales térmicos de convulsiones y los modificadores genéticos, aportando información para estrategias de estratificación de pacientes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento de la epilepsia, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y la evaluación preclínica de la eficacia, especialmente para moduladores del SNC de la excitabilidad neuronal.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre los efectos específicos de los genes en el umbral de convulsión en paradigmas controlados de desafío térmico.
- Tamizaje: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles del inicio de convulsiones para evaluar bibliotecas de compuestos en busca de actividad anticonvulsiva.
- Análisis: Genera como lecturas clave la temperatura umbral de convulsión y la gravedad puntuada según la escala de Racine, para el análisis de respuesta a la dosis y la interacción con el blanco.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos genéticos en modelos murinos con fenotipos humanos de convulsiones febriles, apoyando la validación preclínica vinculada a biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de desafío térmico aplicable a múltiples modelos de epilepsia y campañas de tamizaje.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de epilepsia al aislar el estrés térmico como un desencadenante definido de convulsiones.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad del ensayo mediante un control preciso de la temperatura y una monitorización estandarizada del comportamiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar compuestos con efectos mediados por el blanco sobre la susceptibilidad a convulsiones en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos para el sistema nervioso central basada en sus efectos en modelos genéticamente definidos de convulsiones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ratones, anestesia e inserción de sonda de temperatura rectal para garantizar el bienestar animal y la integridad de los datos.
- Depende de cámaras de calentamiento calibradas con controladores digitales de temperatura y sistemas de aire forzado para un control preciso de la rampa térmica.
- Necesita condiciones ambientales estandarizadas (por ejemplo, cama de viruta de madera, temperatura ambiente) para minimizar la variabilidad en la respuesta térmica.
- Implica coordinación interdisciplinaria entre los equipos de comportamiento, farmacología y genética para una evaluación consistente de las convulsiones y la interpretación de los datos.
- Se limita a modelos en los que el calor es un desencadenante relevante de convulsiones; no es aplicable a mecanismos de epilepsia no térmicos sin modificaciones.
