Cuantificación absoluta de pirofosfatos de inositol por electroforesis capilar Espectrometría de masas de ionización por electrospray

Esto proporciona resultados de alta calidad para el metabolismo del fosfato de inositol en todos los organismos que probamos hasta ahora. También proporcionará información sobre la nueva vía biosintética celular de la que actualmente somos conscientes. El análisis del metabolismo del fosfato de inositol por CE-ESI-MS es más rápido, altamente sensible y capaz de proporcionar información de estructura para conjuntos de fosfato de inositol.

Para comenzar, configure un sistema de espectrometría de masas de ionización por electroforesis capilar o CE-ESI-MS que consiste en un sistema CE comercial y un espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo, equipado con una fuente ESI Agilent Jet Stream. A continuación, conecte el divisor de flujo de vaina 1:100 y la salida de la bomba de cromatografía líquida isocrática, y asegúrese de que el vial de entrada del sistema CE esté a la misma altura que la punta del pulverizador del analizador de masas. Luego, utilice la versión MassHunter Workstation o un software MS similar, para controlar todo el sistema y la adquisición y análisis de datos.

Después de preparar el tampón de funcionamiento CE y el líquido de la vaina, instale el líquido de la vaina purgando a cinco mililitros por minuto durante cinco minutos. Luego ajuste el caudal a un mililitro por minuto y la presión de la bomba a 180 bar. Asegúrese de que el tubo reciclado se conecte de nuevo a la botella de líquido de la funda para reutilizar el disolvente.

A continuación, utilizando un cortador de columna capilar con una cuchilla de diamante giratoria, corte correctamente ambos extremos de un capilar CE-MS con una ventana de detección UV. Luego retire de dos a tres centímetros de recubrimiento de poliimida en ambos extremos con un encendedor y limpie la superficie capilar con isopropanol. Para instalar el capilar, haga coincidir el capilar en el cassette CE-MS.

Luego haga clic en el botón Cambiar casete e instale el casete en el dispositivo CE. Para activar el capilar, primero enjuague el capilar con un hidróxido de sodio molar, seguido de agua durante 10 minutos y luego tampón de funcionamiento CE durante 15 minutos. A continuación, inserte el capilar en el pulverizador CE-MS.

Usando una lupa y el tornillo de ajuste en el pulverizador, ajuste con precisión la salida capilar, asegurándose de que el extremo capilar sobresalga aproximadamente 0,1 milímetros de la punta del pulverizador. Compruebe la estabilidad del pulverizador ESI en el modo Full Scan. La fluctuación de los electroferogramas iónicos totales debe estar dentro del 5%Luego, realice una prueba con los estándares de fosfato de inositol.

Después de preparar la mezcla de patrones internos, mezcle 10 microlitros de la muestra con 0.5 microlitros de la mezcla de patrones internos y un vial de muestra CE. Cuando utilice el sistema de reposición, haga clic en el botón Cambiar botella. Coloque los 250 mililitros preparados de tampón de funcionamiento CE en la botella de electrolito.

Luego haga clic en Tubos limpios manteniendo la aguja de reposición en un vial de agua. Establezca los parámetros ESI y MS. Luego optimice los parámetros de fuente utilizando un optimizador de fuente con una mezcla de estándares de polifosfato de inositol y múltiples configuraciones de monitoreo de reacción utilizando MassHunter Optimizer con todos los estándares.

A continuación, realizar una carrera para los extractos de fosfato de inositol y comprobar los resultados. Establezca una secuencia cuando haya más muestras. Después de la medición, deje que el MS esté en modo de espera y no apague la bomba de cromatografía líquida.

Reemplace el pulverizador CE-ESI-MS con un pulverizador LC-ESI-MS cuando no haya suministro de líquido de vaina. Para el análisis de datos, abra el software de análisis cuantitativo y cree un lote para todas las muestras. A continuación, cree un nuevo método a partir de los datos de monitoreo de reacciones múltiples adquiridos y establezca los fosfatos de inositol de carbono-13 como estándares internos.

Luego, verifique el compuesto de monitoreo de reacciones múltiples, el tiempo de retención, los estándares internos, la configuración de concentración y calificador. Pase Validación y Salida para aplicar el método al lote actual. Guarde el método.

A continuación, compruebe si cada pico del lote está integrado correctamente. De lo contrario, integre manualmente el pico. Exporte los resultados a una hoja de cálculo y cuantifique los pirofosfatos de inositol, comparando la respuesta máxima del anolito con la respuesta máxima respectiva de los estándares internos marcados con isótopos estables con concentraciones conocidas.

Finalmente, con la concentración medida en el fosfato de inositol, la solución de extracto y su volumen, calcule las cantidades absolutas y normalice aún más la cantidad por recuento de células o contenido de proteínas. Calcule la concentración celular en función del recuento de células y el volumen celular promedio de las células HCT116. Los electroferogramas iónicos extraídos de los estándares de pirofosfato de inositol a una concentración de dos micromoles se muestran aquí.

Se inserta el metabolismo de los pirofosfatos de inositol en mamíferos con sus estructuras simplificadas. Aquí se muestra una ejecución CE-ESI-MS de células HCT116 del University College London o UCL. CE-MS se utilizó para cuantificar la variación en los niveles de IP8 entre las células HCT116 de UCL y las de NIH.

Las células HCT116 de UCL contienen niveles siete veces más altos de IP8 que las de los NIH. La acumulación significativa de 1, 5-IP8 en las células HCT116 UCL es paralela a un aumento considerable en 1-IP7. El análisis CE-ESI-MS de células HCT116 tratadas con fluoruro de sodio de NIH demostró una elevación de 5-IP7, junto con una reducción en IP6 y una apariencia de 5-PPIP4.

Aunque los niveles de 1-IP7 disminuyeron hasta cierto punto, no está completamente ausente en las células tratadas con fluoruro de sodio, pero principalmente bajo el límite de detección. Es importante formar un grado CE-ESI-MS estable. Recomendamos comprobar la repetibilidad y sensibilidad del sistema antes de las mediciones.

Esta técnica permite proporcionar metabolismo de fosfato de inositol, implantes y tejidos, y también proporciona una oportunidad para estudiar de cerca el pirofosfato de inositol biológicamente relevante.