Name: Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprende a medir propiedades mecánicas del núcleo celular en células embrionarias de Danio rerio utilizando pinzas ópticas. Este método permite aplicar fuerzas directas sin perturbar la membrana celular ni el citoesqueleto cortical.

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MK agradece el apoyo financiero del Ministerio de Economía y Competitividad a través del Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), programa Severo Ochoa para Centros de Excelencia en I+D (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), de la Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig, y de la Generalitat de Catalunya a través del programa CERCA e Research (2017 SGR 1012), además de la financiación a través de ERC (MechanoSystems) y HFSP (CDA00023/2018). V.R. agradece el apoyo del Ministerio de Ciencia e Innovación a la asociación EMBL, el Centro de Excelencia Severo Ochoa, el Plan Nacional del MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) y la Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. reconoce el apoyo del Programa de Doctorado ICFOstepstone financiado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie 665884. Agradecemos a Arnau Farré por la lectura crítica del manuscrito; Maria Marsal por la ayuda con la imagen y el montaje del embrión de 24 hpf y; Senda Jiménez-Delgado para apoyo con micronyecciones de pez cebra.

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, describimos un método único para interrogar las propiedades mecánicas del núcleo celular dentro de las células vivas. A diferencia de otras técnicas de espectroscopia de fuerza, el atrapamiento óptico no invasivo nos permitió desacoplar la contribución de la membrana celular y el citoesqueleto de la rigidez nuclear celular. Es importante destacar que la micromanipulación óptica es compatible con la microscopía multimodal, lo que permitirá al experimentador estudiar diferentes procesos involucrados en la mecanobiología nuclear celular. Como resultado representativo, utilizamos la tinción de DNA-Hoechst para medir la deformación del núcleo tras la sangría realizada por fuerzas del orden de varios cientos de picoNewton.
Aplicaciones potenciales de nuestro método más allá de los ejemplos descritos en este protocolo La posibilidad de extraer información mecánica cuantitativa de las mediciones dentro de las células vivas sin perturbaciones externas permite una gran cantidad de oportunidades sin precedentes que apenas están comenzando a explorarse. Así, el protocolo presentado de nuestra plataforma de micromanipulación óptica se puede extender a experimentos más complejos con gran versatilidad. Los deflectores acústico-ópticos (AOD) pueden generar múltiples trampas ópticas para mediciones de fuerza síncrona en diferentes ubicaciones celulares, así como también pueden usarse para microrreología activa en un amplio rango de frecuencias51,61. Como se ha mencionado, la respuesta de la fuerza a la sangría puede superar la fuerza de captura máxima, lo que lleva a un escape de la cuenta de la trampa óptica. En este caso, se puede configurar una retroalimentación de fuerza con el AOD para sujetar la fuerza óptica. Con todo, múltiples enfoques microrreológicos, como la relajación del estrés descrita en este protocolo, pero también la microrreología activa o el cumplimiento de la fluencia, se pueden obtener experimentalmente con esta plataforma y analizarse a fondo mediante nuevos paquetes de software61,62,63,64,65 . Además, la aplicación de fuerzas no se limita al núcleo, sino que en principio podría llevarse a cabo para medir diversas estructuras intracelulares y en tejidos complejos como se ha demostrado para atrapar glóbulos rojos que fluyen dentro de vasos sanguíneos intactos66,67 o atrapar y deformar cloroplastos y mitocondrias68 . La calibración del momento de la luz es independiente de la forma y el tamaño del objeto atrapado, lo que permite mediciones directas de la fuerza en cualquier sonda de fuerza con forma arbitraria38,39. El uso de microesferas inyectadas nos permitió aplicar altas fuerzas sobre el núcleo con una potencia láser relativamente baja en comparación con la manipulación directa de estructuras celulares69,70,71. Sin embargo, dada una diferencia de índice de refracción lo suficientemente alta, no es necesaria una sonda de fuerza aplicada externamente y los orgánulos intracelulares pueden manipularse directamente sin perlas inyectadas (observaciones no publicadas y referencia70).
Posibles modificaciones de nuestro método para ampliar las aplicaciones Se pueden inyectar diferentes tamaños de microperlas dependiendo del experimento, pero se deben realizar los controles relativos. Por ejemplo, para estudiar las células en etapas posteriores se pueden inyectar perlas más pequeñas. Esto reducirá la fuerza máxima que puede ejercer la trampa óptica (como se muestra en la referencia55). Se pueden inyectar perlas más grandes para ejercer fuerzas más altas, pero estas pueden afectar el desarrollo embrionario dependiendo de su tamaño o etapa de interés. En experimentos en los que la inyección de microperlas no es una opción, varios orgánulos que muestran diferencias en los índices de refracción en comparación con el del citoplasma aún pueden manipularse ópticamente, dando lugar a fuerzas ópticas medibles a partir de los cambios de momento de la luz42. Como se mencionó anteriormente, estos métodos han sido empleados por Bambardekar et al. para deformar las uniones célula-célula en el embrión de Drosophila70. Asimismo, el núcleo de la célula tiene un índice de refracción inferior al medio circundante44, lo que permite una hendidura libre de perlas (observaciones inéditas y referencia72) aunque con una menor resistencia de atrapamiento. Por lo tanto, el núcleo no puede ser atrapado fácilmente y escapa de la trampa.
El espaciador PDMS con recubrimiento de espín se fabrica a través de un método conveniente y rápido, pero puede estar fuera del alcance de los laboratorios sin acceso a una instalación de micro / nanofabricación o laboratorios de ingeniería. Por lo tanto, el espaciador se puede ensamblar fácilmente a partir de cinta de laboratorio o parafilm (paso 4). El protocolo también se puede adaptar mediante la fabricación de canales microfluídicos que automatizan la entrega de células individuales en pozos de medición predefinidos o en una cámara con una altura definida para estimar el efecto de confinamiento dentro de la misma muestra. Sin embargo, dichos dispositivos microfluídicos deberán diseñarse de manera que se ajusten al espacio entre el objetivo del microscopio y la lente colectora del sensor de fuerza óptica, de alrededor de 2 mm (véase el paso 3). Tenga en cuenta que el sensor de fuerza óptica debe colocarse a la altura adecuada para que ninguna aberración óptica por desenfoque afecte la medición del momento del fotón.
Otras modificaciones podrían incluir el cambio de reporteros biológicos. Encontramos que la fluorescencia de Hoechst sangra espectralmente en el canal GFP y, por lo tanto, favorecemos la combinación con histona marcada con mCherry como marcador nuclear para la medición simultánea en dos canales fluorescentes. Alternativamente, la deformación nuclear se puede rastrear fácilmente con una etiqueta dirigida a la membrana nuclear interna, como Lap2b-GFP (Figura 2).
La indentación en el núcleo celular fue del orden de 2-3 micras, que pudimos medir con precisión mediante el análisis de imágenes de microscopía confocal de disco giratorio limitado por difracción. Para el caso de núcleos más rígidos o fuerzas más pequeñas, la hendidura será apenas medible utilizando este enfoque. Sin embargo, las pinzas ópticas calibradas por fuerza absoluta también se pueden calibrar para mediciones de posición de la cuenta atrapada in situ utilizando interferometría BFP con precisión nanométrica51. Utilizando este enfoque, la señal de voltaje y el sensor de fuerza óptica se pueden traducir en la posición de la sonda atrapada a través del parámetro β [nm/V], mientras que el parámetro invariante α [pN/V] produce valores de fuerza a través de la calibración de momento de luz antes mencionada41 (ver más abajo para más detalles).
Solución de problemas Encontramos que los siguientes desafíos podrían ocurrir durante el experimento:
No se forma ninguna trampa estable y la microesfera se escapa fácilmente Cualquier suciedad en el objetivo del microscopio o un collar de corrección desalineado podría conducir a una falla de una trampa estable. Si no se encuentra una solución inmediata, mida la función de dispersión de puntos de la lente del objetivo. Si la muestra de interés está profundamente dentro de un tejido ópticamente denso, el foco láser puede experimentar aberraciones ópticas graves que conducen a una captura inestable (este efecto suele ser insignificante en células aisladas, pero se hace más evidente en tejidos más gruesos). Para una alta rigidez, la fuerza de restauración del núcleo podría exceder la fuerza de escape de la trampa, de modo que la microesfera se pierda y la rutina de hendidura falle. Inicialmente, el borde de la membrana nuclear proximal a la trampa óptica apenas se sangra (Figura S2A). Cuando esto ocurre, el láser de captura ya no se ve afectado por la fuerza y el movimiento browniano, lo que conduce a una caída de fuerza a cero y una disminución del ruido de la señal (Figura S2B). En caso de que esto suceda, la potencia del láser se puede aumentar para tener una trampa más fuerte, la amplitud de la trayectoria trapezoidal que empuja la cuenta hacia el núcleo se puede reducir, o la posición inicial de la microperla atrapada se puede establecer más lejos del núcleo.
La célula se mueve durante la estimulación Si las células no están suficientemente unidas, la trampa de gradiente óptico moverá las células mientras realiza la rutina de indentación intracelular, de modo que las fuerzas y la mecánica subyacente del núcleo sean artefactuales. Para evitar el desplazamiento de toda la célula, recomendamos aumentar la concentración de moléculas de adhesión celular en la superficie, por ejemplo, ConA.
Compensación de impulso inicial Si no se dispone de una rutina inicial de compensación de momento en la plataforma de OT (paso 6.5), es necesario corregir una señal de referencia artificial e independiente de la fuerza. Esto es visible como una pendiente en la curva de fuerza incluso sin cuentas atrapadas (Figura S1E). Para hacer la corrección, la misma trayectoria debe realizarse sin una cuenta, fuera de la celda exactamente en la misma posición. Para ello, aleje la celda de la trampa utilizando el control de escenario. Como referencia, el desplazamiento de fuerza cambia 5 pN a través del FOV a 200 mW en nuestro sistema; por lo tanto, se vuelve insignificante para trayectorias cortas. Alternativamente, se puede utilizar una etapa de piezoescaneo para mover las células de la muestra, dejando constante la posición del láser.
Pasos críticos del protocolo presentado Las microesferas deben inyectarse en la etapa correcta de 1 célula para garantizar la distribución máxima sobre el embrión. Las perlas no deben ser fluorescentes para que no se filtre luz en los canales fluorescentes utilizados para la obtención de imágenes. Por ejemplo, incluso las cuentas rojas fluorescentes típicas son claramente visibles en el canal azul utilizado para obtener imágenes del núcleo celular después de la tinción de Hoechst debido a su brillo (excitación: 405 nm; emisión: 445 nm). La fijación estable de la célula al sustrato es fundamental para evitar el desplazamiento lateral durante la rutina de hendidura. Si la célula se mueve durante la rutina, las fuerzas se subestiman. Si esto sucede con frecuencia, optimice el protocolo de conexión. Para las células de cultivo de tejidos, otras proteínas de adhesión celular, como la fibronectina, el colágeno o la poli-L-lisina conducen a una unión satisfactoria (observaciones no publicadas). Durante el confinamiento, las celdas son sometidas a un estrés mecánico repentino y severo. Esto puede causar daño a las células y, con frecuencia, el experimentador se encontrará con células rotas si el procedimiento no se lleva a cabo con cuidado. Además, si la altura de confinamiento es demasiado pequeña, todas las células sufrirán roturas de envoltura nuclear o daños irreversibles. Para mitigar estos, baje el cubrebocas superior más lentamente y / o aumente el espacio entre el deslizamiento de cubierta.
Limitaciones de la técnica y sugerencias para superarlas Una clara limitación de la técnica es la penetración de la luz láser en secciones profundas del tejido, lo que conduce a aberraciones y atrapamientos inestables. Por lo tanto, un límite inferior de profundidad de penetración depende de la claridad de la muestra, la corrección de aberración que se puede emplear73 y la potencia láser aplicada. Debe tenerse en cuenta que una mayor potencia láser conduce a la excitación térmica de la muestra en las cercanías de la microesfera. Sin embargo, el calentamiento de la muestra originado por el punto láser de longitud de onda de 1064 nm se minimiza para evitar un estrés plausible relacionado con el calor en nuestras muestras biológicas74.
Otra limitación es la fuerza máxima que se puede medir. A pesar de que la detección directa de momento de luz permite mediciones de fuerza mucho más allá del régimen de respuesta lineal de la trampa óptica40,41, la fuerza máxima aplicada es del orden de unos pocos cientos de picoNewtons. Esto está limitado por la potencia del láser y el umbral de daño consecuente del material biológico blando y las diferencias del índice de refracción, que normalmente no son mayores de 0.1 o 0.344. Se han propuesto varios métodos para aumentar el límite de detección de fuerza, por ejemplo, utilizando luz estructurada75, microesferas recubiertas antirreflectantes76, partículas de alto índice de refracción77 o puntos cuánticos altamente dopados78.
Los OT se pueden utilizar para mediciones de posición a escala nanométrica a través de interferometría BFP, de modo que la posición de la cuenta dentro de la trampa es Δx = β Sx, donde Sx es la señal de voltaje del sensor, y β [μm / V] se puede calibrar sobre la marcha siguiendo diferentes protocolos35,54. Para un sensor de fuerza óptica, se puede demostrar que el factor de conversión invariante de voltaje a fuerza α [pN / V] se relaciona directamente con β y la rigidez de la trampa, k [pN / μm], a través de α = kβ 37) En experimentos con desplazamientos de cuentas que son demasiado pequeños para ser detectados a partir de imágenes ópticas, esta estrategia se puede utilizar para complementar las mediciones de fuerza con la detección de posición pequeña. Un ejemplo es la aplicación de las rutinas experimentales presentadas aquí sobre núcleos muy rígidos, para los cuales las fuerzas a potencias láser razonables (200-500 mW) no son suficientes para inducir valores de indentación lo suficientemente grandes. En ese caso, la perla debe ponerse en contacto con el núcleo y la rigidez de atrapamiento debe calibrarse antes de la medición (paso 8.6). La sangría d del núcleo en función de la fuerza puede determinarse indirectamente como:
d = xtrap - F/k
donde xtrap es la posición de la trampa. A diferencia del factor de momento de luz invariante α [pN/V], el factor β [μm/V] debe calibrarse antes de cada experimento, ya que depende de muchas variables locales que determinan la dinámica de atrapamiento, como el tamaño de partícula, el tamaño del punto de trampa óptica y los índices de refracción relativos.

La morfogénesis tisular es un proceso complejo en el que las señales bioquímicas y las fuerzas físicas se coordinan espaciotemporalmente. En el embrión en desarrollo, los gradientes de factores de señalización bioquímica dictan la especificación del destino y aseguran el correcto patrón tisular1,2. Al mismo tiempo, las fuerzas intrínsecas y extrínsecas juegan un papel en la construcción de la arquitectura del embrión3,4. La influencia de la mecánica de la corteza celular en este contexto ha sido ampliamente estudiada5,6. La estrecha interconexión entre los procesos mecanoquímicos durante la morfogénesis se basa en las propiedades de las células individuales para detectar y responder a las fuerzas mecánicas en su microambiente tisular. Las células, por lo tanto, decodifican señales mecánicas a través de la presencia de elementos subcelulares y moleculares sensibles a la fuerza que transducen información mecánica en vías de señalización específicas que controlan el comportamiento celular, el destino celular y la mecánica celular.
Un sello distintivo de los procesos de desarrollo es que las células se organizan como grupos para construir estructuras multicelulares. Como tal, las células individuales rara vez se reorganizan y se mueven solas, sino que se asocian en un sociotopo apretado en el que muestran un comportamiento colectivo como la migración supracelular7, las transiciones (des)atasco8,9 o la compactación de blastocistos10. Las fuerzas mecánicas generadas dentro y entre las células sirven como señales importantes para instruir la dinámica celular colectiva7,11. Pero incluso cuando las células se mueven solas, como las células progenitoras que se abren paso entre las láminas de tejido o los nichos de tejido estrechos, experimentan extensas fuerzas mecánicas anisotrópicas cuando navegan por un entorno tridimensional. Estas tensiones mecánicas sobre las células tienen profundas consecuencias en el comportamiento celular12,13. Se han investigado varios mecanismos que convergen en el núcleo como elemento principal de mecanotransducción14,15, como elemento mecánico pasivo o activo durante la migración dentro de un entorno tisular 3D denso15,16.
Recientemente propusimos un mecanismo que equipa a las células para medir las deformaciones de forma utilizando el núcleo como un mecano-gauge intracelular elástico12. El núcleo, al ser el orgánulo más grande de una célula, sufre grandes deformaciones cuando las células se polarizan, migran o cambian su forma bajo estiramiento mecánico, confinamiento o estrés osmótico16,17,18,19. Encontramos que el estiramiento de la envoltura nuclear junto con el posicionamiento intracelular del núcleo proporciona a las células información sobre la magnitud y el tipo de deformación celular (como la compresión celular frente a la hinchazón celular). El estiramiento del núcleo se asocia con un despliegue de la membrana nuclear interna (INM), que promueve la actividad de la lipasa cPLA2 (fosfolipasa citosólica A2) dependiente del calcio en el INM, seguida de la liberación de ácido araquidónico (AA) y la activación rápida de la miosina II en la corteza celular. Esto conduce a un aumento de la contractilidad celular y a la migración de células ameboides por encima de un umbral de contractilidad cortical6. La respuesta mecanosensible a la deformación celular ocurre en menos de un minuto y es reversible tras la liberación por confinamiento, lo que sugiere que el núcleo actúa como un galga extensométrica para la propiocepción celular que regula el comportamiento celular adaptativo en condiciones de estrés mecánico. Esta vía mecanosensible ha demostrado ser activa en células madre progenitoras derivadas de embriones de pez cebra, tanto en células pluripotentes como comprometidas con el linaje12 y se conserva en diferentes especies y líneas celulares20.
Además de las propiedades nucleares como mecanosensor celular, la arquitectura y la mecánica nucleares están intrínsecamente reguladas durante el desarrollo y en respuesta a la especificación del destino celular21, por lo tanto, afinando la mecanosensibilidad celular22,23. La consecuencia podría ser un cambio en el cumplimiento nuclear que permita cambios morfológicos y transiciones de un estado premigratorio a un estado migratorio y viceversa8.
Se han aplicado diversas técnicas para medir la mecánica del núcleo celular, como la microscopía de fuerza atómica24,25, la aspiración de micropipetas26,27, la tecnología microfluídica28 y las microagujas29. Sin embargo, muchas de estas técnicas son invasivas en el sentido de que toda la célula debe deformarse, lo que limita la medición de las características mecánicas y las respuestas dependientes de la fuerza del propio núcleo. Para eludir la deformación simultánea de la superficie celular y su corteza celular mecanosensible30, se estudiaron núcleos aislados en diversos contextos31,32. Sin embargo, no se puede descartar que el aislamiento nuclear esté asociado a un cambio en las propiedades mecánicas del núcleo y su regulación (referencia24 y observaciones propias inéditas).
Las pinzas ópticas (OT) son una tecnología versátil que ha permitido una gran cantidad de experimentos en mecanobiología celular y han sido fundamentales en nuestra comprensión de cómo las máquinas moleculares convierten la energía química en energía mecánica33,34. Las pinzas ópticas utilizan un rayo láser estrechamente enfocado para ejercer fuerzas ópticas sobre partículas dieléctricas que tienen un índice de refracción más alto que el medio circundante33. Tales fuerzas pueden ser del orden de cientos de pico-Newtons y dar como resultado un confinamiento efectivo de la partícula dentro del foco de la trampa láser, lo que permite la manipulación de la partícula atrapada en tres dimensiones. El uso de la luz tiene una ventaja importante en que la medición se puede realizar de forma no invasiva dentro de las células vivas. Las manipulaciones ópticas se limitan aún más al foco de trampa del rayo láser. Por lo tanto, la manipulación se puede realizar sin estimular las membranas celulares circundantes y no perturba la corteza de actina o los procesos mecanosensibles en la membrana plasmática, como la activación dependiente de la fuerza de los canales iónicos.
La dificultad del enfoque de pinza óptica es determinar con precisión las fuerzas aplicadas a la microesfera utilizando enfoques clásicos que se basan en la calibración de fuerza indirecta basada en el teorema de equipartición o el uso de fuerzas de arrastre de Stokes definidas para medir una fuerza de escape dependiente de la potencia del láser35. Si bien estos métodos son fáciles de implementar en un experimento in vitro, generalmente no se pueden traducir a un entorno celular. Se han introducido varias estrategias en el campo que se basan en una calibración de fuerza directa, derivada de los primeros principios de conservación del momento36,37. A diferencia de otros enfoques de espectroscopia de fuerza, las mediciones de fuerza se deducen de un intercambio local de momento de luz con la partícula atrapada de forma arbitraria38,39. En nuestra configuración experimental, los cambios en el momento de la luz derivados de las fuerzas ópticas se miden directamente sin necesidad de calibración de trampa in situ40,41,42,43. Por lo tanto, las mediciones se vuelven posibles en un entorno viscoso como el interior de la célula o incluso dentro de un tejido, y las fuerzas se pueden cuantificar fácilmente hasta el nivel de pN.
En este protocolo, describimos un ensayo para manipular mecánicamente orgánulos o estructuras intracelulares y evaluar cuantitativamente sus propiedades mecánicas mediante una configuración de pinza óptica. Esta configuración está integrada en un microscopio fluorescente de disco giratorio que permite obtener imágenes paralelas del comportamiento celular o la dinámica intracelular. El ensayo permite la caracterización de las propiedades mecánicas de compartimentos celulares específicos, como el núcleo, al tiempo que estudia la posible mecanorespuesta y la activación de las vías de señalización molecular como resultado de la propia deformación. Además, el atrapamiento óptico de las microperlas inyectadas dentro de las células permite un aumento de la fuerza de indentación gracias a un índice de refracción considerablemente mayor de la cuenta de poliestireno (n = 1,59) en comparación con el contraste refractivo intrínseco44 del núcleo (n ~ 1,35) frente al citoplasma (n ~ 1,38). La estrategia presentada se puede adaptar fácilmente al estudio de otras estructuras intracelulares y orgánulos, así como a otros enfoques que involucran microrreología activa, el uso de múltiples trampas ópticas para sondear las mismas / diferentes estructuras subcelulares simultáneamente, y mediciones dirigidas a la mecanobiología celular en el embrión vivo.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Cubreobjetos de 22 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Cubreobjetos de 22x60 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H platos con fondo de cristal</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10-mmm cuentas</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidrio de 1 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1-mmm poliestireno microperlas</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-mmm perlas fluorescentes rojas</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de calidad sCMOS</td><td></td><td>Andor Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Cámara auxiliar (Figura 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva doble</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0,17 mM KCl. 0,33 mM CaCl2. 0,33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Tipo B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>Gafas de</td> <td>protección IRThorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro cargador</td><td>pipeta Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corredera de micromitre</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisiones</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Etapa motorizada</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de pinzas ópticas</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs software (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Agente de curado</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Software de posprocesamiento (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico de paso corto (Figura 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Specialty Coating Systems Spincoat</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de disco giratorio</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinyección triangular</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Horno universal</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en agua</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Durante el desarrollo de un organismo multicelular, una sola célula fertilizada se divide y da lugar a múltiples tejidos con diversas funciones. La morfogénesis tisular va de la mano con cambios moleculares y estructurales a nivel de una sola célula que resultan en variaciones de las propiedades mecánicas subcelulares. Como consecuencia, incluso dentro de la misma célula, diferentes orgánulos y compartimentos resisten de manera diferente a las tensiones mecánicas; y las vías de mecanotransducción pueden regular activamente sus propiedades mecánicas. La capacidad de una célula para adaptarse al microambiente del nicho de tejido se debe en parte a la capacidad de detectar y responder a las tensiones mecánicas. Recientemente propusimos un nuevo paradigma de mecanosensición en el que la deformación y el posicionamiento nuclear permiten a una célula medir el entorno físico 3D y dotan a la célula de un sentido de propiocepción para decodificar los cambios en la forma de la célula. En este artículo, describimos un nuevo método para medir las fuerzas y propiedades del material que dan forma al núcleo celular dentro de las células vivas, ejemplificado en células adherentes y células confinadas mecánicamente. Las mediciones se pueden realizar de forma no invasiva con trampas ópticas dentro de las células, y las fuerzas son directamente accesibles a través de la detección sin calibración del momento de la luz. Esto permite medir la mecánica del núcleo independientemente de las deformaciones de la superficie celular y permitir la disección de las vías de mecanotransducción exteroceptivas e interoceptivas. Es importante destacar que el experimento de captura se puede combinar con la microscopía óptica para investigar la respuesta celular y la dinámica subcelular utilizando imágenes de fluorescencia del citoesqueleto, iones de calcio o morfología nuclear. El método presentado es fácil de aplicar, compatible con soluciones comerciales para mediciones de fuerza, y se puede ampliar fácilmente para investigar la mecánica de otros compartimentos subcelulares, por ejemplo, mitocondrias, fibras de estrés y endosomas.

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Este protocolo disecciona las propiedades mecánicas individuales del núcleo celular que lo convierten en un indicador mecánico para la polarización, diferenciación y migración celular. La principal ventaja de esta técnica es que puede medir propiedades mecánicas y aplicar fuerzas a compartimentos subcelulares sin perturbación externa de la membrana o citoesqueleto cortical. El protocolo se puede adaptar fácilmente para manipular cuentas dentro de otras células de otros organismos con el fin de estudiar la mecánica nuclear en diferentes líneas celulares o modelos animales.La alineación del sensor de fuerza directa es fundamental para capturar toda la luz creando y saliendo de las trampas ópticas. Esto asegurará mediciones precisas del momento de la luz en el medio viscoelástico de una célula. Comience la preparación de una sola célula colocando los embriones de etapa de esfera cuatro horas después de la fertilización en un plato de vidrio que contenga medios E3 utilizando una pipeta Pasteur de plástico.A continuación, seleccione los embriones que son positivos a las perlas y exprese la proteína fluorescente en caso de inyección de ARNm. Use fórceps para decurionar manualmente los embriones y transfiera aproximadamente de 10 a 15 embriones decurionados a un recipiente de reacción de 1,5 mililitros con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio. Retire el medio E3 del tubo y agregue 500 microlitros de medio de cultivo de tejido independiente del dióxido de carbono precalentado.Agite suavemente el tubo evitando la formación de burbujas y asegúrese de que el contenido del tubo se vuelva turbio a medida que las células se disocian sin grandes trozos visibles por el ojo. Luego centrifugue el tubo a 200 veces G durante tres minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y recoja el pellet para proceder con la tinción celular.Para etiquetar el núcleo, resusped las células agregando 500 microlitros de la solución de tinción de tinte DNA Hoechst recién preparada al tubo. Incubar las células teñidas durante siete minutos en la oscuridad. A continuación, centrifugue las células como se describió anteriormente y resuspenda el pellet en 50 microlitros de DMEM para muestras en suspensión o 20 microlitros de DMEM para celdas en confinamiento.Para la preparación de los atrapamientos ópticos o cámara OT para los experimentos con las células en suspensión, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara con un orificio cuadrado de aproximadamente 10 milímetros por 10 milímetros en el centro. Despegue una de las capas protectoras de la cinta y coloque el lado descubierto de la cinta en el centro de un plato con fondo de vidrio número 1.5 H. Presione la cinta suavemente para que toda la superficie de la cinta se adhiera al vidrio mientras evita las burbujas de aire y despega la capa protectora restante de la cinta.Incubar la superficie con 100 microlitros de Concanavalin A a 0,5 miligramos por mililitro durante 30 minutos. Luego retire la gota de Concanavalin A y enjuague la superficie con DMEM. Agregue 30 microlitros de la solución que contiene las células sobre la superficie de la cavidad.Luego cierre la cámara muy suavemente con un vidrio de cubierta de 22 por 22 milímetros. Use un bisturí o fórceps si es necesario. A continuación, proceda al inicio de las pinzas ópticas encendiendo el láser a una potencia considerablemente alta durante al menos 30 minutos antes del experimento para optimizar la estabilidad de la potencia de salida.Cuando haya terminado, encienda el módulo electrónico de las unidades ópticas de micromanipulación y medición de fuerza. Antes de alinear el sensor de fuerza óptica, coloque una gota de agua en el objetivo de inmersión en agua 60X 1.2 y coloque la cámara que contiene las células en el escenario. Concéntrese en la superficie inferior de la cámara donde se colocarán las muestras de células.Después de agregar una gota de aceite de inmersión en la parte superior de la diapositiva de vidrio de la cubierta que cubre la muestra, baje la lente colectora de la unidad del sensor de fuerza hasta que entre en contacto con la gota de aceite. Siguiendo el procedimiento estándar para la alineación del sensor de fuerza óptica, mire la imagen del plano de muestra en la cámara auxiliar que se utilizará para posicionar los OT, luego baje el sensor de fuerza óptica hasta que su parada de campo aparezca conjugada en el plano de muestra. Para comprobar si hay burbujas de aire con el objetivo Bertrand, observe la trayectoria de la imagen a través de la cámara auxiliar.Si hay suciedad o burbujas de aire visibles, limpie la lente y la cámara con tejido de lente libre de polvo antes de repetir el procedimiento como se describe, agregando más aceite de inmersión. Usando los tornillos laterales colocados en el soporte del sensor de fuerza óptica, centre el tope de campo en el campo de visión. Para mayor precisión, abra el tope de campo casi para ocupar el campo de visión visible en la cámara auxiliar.Después de colocar la muestra en el microscopio y alinear el sensor de fuerza óptica, use la placa giratoria de media onda para establecer la potencia de la trampa inicial en 200 milivatios si no se conoce la rigidez del núcleo o la estructura intercelular investigada. Una vez hecho esto, use el controlador de software de etapa de microscopio para buscar una célula con una o dos perlas a través de microscopía Brightfield transmitida. En la hoja numérica, escriba el desplazamiento y el tiempo de cada paso de trayectoria posterior.Alternativamente, cargue la tabla S1 del material suplementario. Para un experimento de estrés/relajación, programe las cargas trapezoidales a aplicar. En el software OT, active las trampas ópticas.Para atrapar una microesfera, coloque los planos de imagen ligeramente por encima de la cuenta con un controlador de software de etapa de microscopio. Haga clic en la microperla de poliestireno en la ventana de imágenes de la cámara auxiliar calibrada. El confinamiento exitoso de la cuenta por la trampa óptica reducirá fuertemente el movimiento de la cuenta.Haga clic y arrastre la cuenta a través del citoplasma y colóquela a una distancia de aproximadamente dos micras de la envoltura nuclear. Asegúrese de que la trayectoria esté establecida de modo que la hendidura de la perla sea perpendicular a la membrana nuclear. Cuando la configuración esté lista, vaya al software de imágenes y haga clic en el botón de adquisición para iniciar la adquisición de imágenes.Abra la ventana de lectura de fuerza en tiempo real, haga clic en los datos y guarde en la ventana de lectura forzada en tiempo real para guardar. Inicie los datos de medición de posición y fuerza de la trampa. Inicie la trayectoria cargada previamente haciendo clic con el botón derecho en la cuenta y seleccionando la trayectoria de inicio.Espere hasta que finalice la trayectoria y el sistema se estabilice antes de finalizar el registro de los datos de medición de la fuerza de trampa. Detenga la adquisición de imágenes y trace los resultados en el software de posprocesamiento. En el análisis representativo, se muestra una célula madre progenitora de pez cebra aislada con una sola microesfera cerca del núcleo.Se monitorizó la distribución de la microesfera de poliestireno cinco horas después de la inyección dentro de un embrión. La imagen de campo brillante y fluorescencia muestra que las cuentas están dispersas por el tejido embrionario. La proyección máxima de la pila Z fluorescente confocal y una proyección máxima de una subpila en la misma región confirma que una gran fracción de células profundas contenía una o dos perlas.A las 24 horas después de la fertilización, las cuentas se distribuyeron por todo el cuerpo del embrión. Se obtuvieron las micrografías de Brightfield de las células de suspensión en las celdas confinadas con una o dos perlas inyectadas. Además, múltiples etiquetas fluorescentes facilitaron la investigación de diferentes aspectos de las células, como la membrana internuclear, la membrana plasmática, el ADN y la línea transgénica.Las instantáneas representativas describieron núcleos marcados con Hoechst cinco segundos antes / durante y cinco segundos después de la sangría con una microesfera atrapada ópticamente. Se estudiaron los perfiles de intensidad a lo largo del segmento de indentación para tres marcos y trayectorias diferentes de los límites distales y proximales del núcleo durante un experimento de indentación de células suspendidas y confinadas. Se midió la trayectoria atrapada y la fuerza experimentada por la microesfera atrapada ópticamente durante un experimento repetido de indentación nuclear.La mecánica del núcleo en las células en suspensión y bajo confinamiento confirmó que el confinamiento resultó en una expansión del área proyectada y un cambio insignificante en la rigidez nuclear. Si las perlas se inyectan en el embrión de una etapa celular, lo más probable es que se distribuyan uniformemente en las etapas posteriores. Recuerde que la cuenta debe estar atrapada de manera estable.Si la cuenta escapa de la trampa óptica, redefina la trayectoria o aumente la potencia del láser. Estos experimentos se pueden realizar fácilmente en múltiples microperlas dentro de una célula y extenderse a mediciones de microrreología activa.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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