Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Este protocolo disecciona las propiedades mecánicas individuales del núcleo celular que lo convierten en un indicador mecánico para la polarización, diferenciación y migración celular. La principal ventaja de esta técnica es que puede medir propiedades mecánicas y aplicar fuerzas a compartimentos subcelulares sin perturbación externa de la membrana o citoesqueleto cortical. El protocolo se puede adaptar fácilmente para manipular cuentas dentro de otras células de otros organismos con el fin de estudiar la mecánica nuclear en diferentes líneas celulares o modelos animales.

La alineación del sensor de fuerza directa es fundamental para capturar toda la luz creando y saliendo de las trampas ópticas. Esto asegurará mediciones precisas del momento de la luz en el medio viscoelástico de una célula. Comience la preparación de una sola célula colocando los embriones de etapa de esfera cuatro horas después de la fertilización en un plato de vidrio que contenga medios E3 utilizando una pipeta Pasteur de plástico.

A continuación, seleccione los embriones que son positivos a las perlas y exprese la proteína fluorescente en caso de inyección de ARNm. Use fórceps para decurionar manualmente los embriones y transfiera aproximadamente de 10 a 15 embriones decurionados a un recipiente de reacción de 1,5 mililitros con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio. Retire el medio E3 del tubo y agregue 500 microlitros de medio de cultivo de tejido independiente del dióxido de carbono precalentado.

Agite suavemente el tubo evitando la formación de burbujas y asegúrese de que el contenido del tubo se vuelva turbio a medida que las células se disocian sin grandes trozos visibles por el ojo. Luego centrifugue el tubo a 200 veces G durante tres minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y recoja el pellet para proceder con la tinción celular.

Para etiquetar el núcleo, resusped las células agregando 500 microlitros de la solución de tinción de tinte DNA Hoechst recién preparada al tubo. Incubar las células teñidas durante siete minutos en la oscuridad. A continuación, centrifugue las células como se describió anteriormente y resuspenda el pellet en 50 microlitros de DMEM para muestras en suspensión o 20 microlitros de DMEM para celdas en confinamiento.

Para la preparación de los atrapamientos ópticos o cámara OT para los experimentos con las células en suspensión, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara con un orificio cuadrado de aproximadamente 10 milímetros por 10 milímetros en el centro. Despegue una de las capas protectoras de la cinta y coloque el lado descubierto de la cinta en el centro de un plato con fondo de vidrio número 1.5 H. Presione la cinta suavemente para que toda la superficie de la cinta se adhiera al vidrio mientras evita las burbujas de aire y despega la capa protectora restante de la cinta.

Incubar la superficie con 100 microlitros de Concanavalin A a 0,5 miligramos por mililitro durante 30 minutos. Luego retire la gota de Concanavalin A y enjuague la superficie con DMEM. Agregue 30 microlitros de la solución que contiene las células sobre la superficie de la cavidad.

Luego cierre la cámara muy suavemente con un vidrio de cubierta de 22 por 22 milímetros. Use un bisturí o fórceps si es necesario. A continuación, proceda al inicio de las pinzas ópticas encendiendo el láser a una potencia considerablemente alta durante al menos 30 minutos antes del experimento para optimizar la estabilidad de la potencia de salida.

Cuando haya terminado, encienda el módulo electrónico de las unidades ópticas de micromanipulación y medición de fuerza. Antes de alinear el sensor de fuerza óptica, coloque una gota de agua en el objetivo de inmersión en agua 60X 1.2 y coloque la cámara que contiene las células en el escenario. Concéntrese en la superficie inferior de la cámara donde se colocarán las muestras de células.

Después de agregar una gota de aceite de inmersión en la parte superior de la diapositiva de vidrio de la cubierta que cubre la muestra, baje la lente colectora de la unidad del sensor de fuerza hasta que entre en contacto con la gota de aceite. Siguiendo el procedimiento estándar para la alineación del sensor de fuerza óptica, mire la imagen del plano de muestra en la cámara auxiliar que se utilizará para posicionar los OT, luego baje el sensor de fuerza óptica hasta que su parada de campo aparezca conjugada en el plano de muestra. Para comprobar si hay burbujas de aire con el objetivo Bertrand, observe la trayectoria de la imagen a través de la cámara auxiliar.

Si hay suciedad o burbujas de aire visibles, limpie la lente y la cámara con tejido de lente libre de polvo antes de repetir el procedimiento como se describe, agregando más aceite de inmersión. Usando los tornillos laterales colocados en el soporte del sensor de fuerza óptica, centre el tope de campo en el campo de visión. Para mayor precisión, abra el tope de campo casi para ocupar el campo de visión visible en la cámara auxiliar.

Después de colocar la muestra en el microscopio y alinear el sensor de fuerza óptica, use la placa giratoria de media onda para establecer la potencia de la trampa inicial en 200 milivatios si no se conoce la rigidez del núcleo o la estructura intercelular investigada. Una vez hecho esto, use el controlador de software de etapa de microscopio para buscar una célula con una o dos perlas a través de microscopía Brightfield transmitida. En la hoja numérica, escriba el desplazamiento y el tiempo de cada paso de trayectoria posterior.

Alternativamente, cargue la tabla S1 del material suplementario. Para un experimento de estrés/relajación, programe las cargas trapezoidales a aplicar. En el software OT, active las trampas ópticas.

Para atrapar una microesfera, coloque los planos de imagen ligeramente por encima de la cuenta con un controlador de software de etapa de microscopio. Haga clic en la microperla de poliestireno en la ventana de imágenes de la cámara auxiliar calibrada. El confinamiento exitoso de la cuenta por la trampa óptica reducirá fuertemente el movimiento de la cuenta.

Haga clic y arrastre la cuenta a través del citoplasma y colóquela a una distancia de aproximadamente dos micras de la envoltura nuclear. Asegúrese de que la trayectoria esté establecida de modo que la hendidura de la perla sea perpendicular a la membrana nuclear. Cuando la configuración esté lista, vaya al software de imágenes y haga clic en el botón de adquisición para iniciar la adquisición de imágenes.

Abra la ventana de lectura de fuerza en tiempo real, haga clic en los datos y guarde en la ventana de lectura forzada en tiempo real para guardar. Inicie los datos de medición de posición y fuerza de la trampa. Inicie la trayectoria cargada previamente haciendo clic con el botón derecho en la cuenta y seleccionando la trayectoria de inicio.

Espere hasta que finalice la trayectoria y el sistema se estabilice antes de finalizar el registro de los datos de medición de la fuerza de trampa. Detenga la adquisición de imágenes y trace los resultados en el software de posprocesamiento. En el análisis representativo, se muestra una célula madre progenitora de pez cebra aislada con una sola microesfera cerca del núcleo.

Se monitorizó la distribución de la microesfera de poliestireno cinco horas después de la inyección dentro de un embrión. La imagen de campo brillante y fluorescencia muestra que las cuentas están dispersas por el tejido embrionario. La proyección máxima de la pila Z fluorescente confocal y una proyección máxima de una subpila en la misma región confirma que una gran fracción de células profundas contenía una o dos perlas.

A las 24 horas después de la fertilización, las cuentas se distribuyeron por todo el cuerpo del embrión. Se obtuvieron las micrografías de Brightfield de las células de suspensión en las celdas confinadas con una o dos perlas inyectadas. Además, múltiples etiquetas fluorescentes facilitaron la investigación de diferentes aspectos de las células, como la membrana internuclear, la membrana plasmática, el ADN y la línea transgénica.

Las instantáneas representativas describieron núcleos marcados con Hoechst cinco segundos antes / durante y cinco segundos después de la sangría con una microesfera atrapada ópticamente. Se estudiaron los perfiles de intensidad a lo largo del segmento de indentación para tres marcos y trayectorias diferentes de los límites distales y proximales del núcleo durante un experimento de indentación de células suspendidas y confinadas. Se midió la trayectoria atrapada y la fuerza experimentada por la microesfera atrapada ópticamente durante un experimento repetido de indentación nuclear.

La mecánica del núcleo en las células en suspensión y bajo confinamiento confirmó que el confinamiento resultó en una expansión del área proyectada y un cambio insignificante en la rigidez nuclear. Si las perlas se inyectan en el embrión de una etapa celular, lo más probable es que se distribuyan uniformemente en las etapas posteriores. Recuerde que la cuenta debe estar atrapada de manera estable.

Si la cuenta escapa de la trampa óptica, redefina la trayectoria o aumente la potencia del láser. Estos experimentos se pueden realizar fácilmente en múltiples microperlas dentro de una célula y extenderse a mediciones de microrreología activa.