Name: De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende el método de autoinducción sin células para sintetizar proteínas funcionales de Escherichia coli en menos de 24 horas. Esta técnica simplificada reduce la supervisión del investigador y mejora la accesibilidad en biotecnología.

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Jennifer VanderKelen y Andrea Laubscher por su apoyo técnico. Los autores también desean agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington y Jillian Kasman por sus útiles discusiones. Los autores también reconocen el apoyo financiero del Fondo Bill y Linda Frost, la Subvención de Dotación de Investigación Aplicada de Chevron Biotechnology del Centro de Aplicaciones en Biotecnología, Cal Poly Research, Scholarly y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-1708919).

1. Crecimiento de los medios
<ol><li>Prepare 960 ml de medios CFAI como se describe en la Tabla 1 y ajuste el pH a 7.2 usando KOH.</li>
	<li>Transfiera los medios de cultivo a un matraz y autoclave desconcertados de 2,5 L durante 30 min a 121 °C.</li>
	<li>Prepare una solución de azúcar de 40 ml como se describe en la Tabla 1. Esterilizar con filtro la solución en un recipiente de vidrio en autoclave separado. NOTA: La solución de azúcar se puede almacenar en una incubadora de 30 °C hasta su uso posterior.</li>
	<li>Deje que el medio se enfríe completamente por debajo de 40 ° C después del autoclave.</li>
	<li>Antes de la inoculación de los medios CFAI, agregue la solución de azúcar directamente al medio CFAI.</li>
	<li>Para inocular el medio, deslice un bucle de colonias de una placa de E. coli BL21 Star (DE3) previamente rayada e insértelo directamente en el medio. Gire el bucle en el medio, pero evite tocar los lados del recipiente. Asegúrese de que la placa de rayas esté fresca, con células viables.</li>
	<li>Coloque el matraz con el medio inoculado en una incubadora de 30 °C mientras agita a 200 rpm. Permita que la cultura crezca de la noche a la mañana. Si las células se inoculan por la noche, el cultivo alcanzará una densidad óptica aproximada, medida a 600 nm (OD600), de 10 la mañana siguiente. Los tiempos de inoculación y cosecha se pueden ajustar según sea necesario.</li>
</ol>2. Cosecha de células
<ol><li>Prepare el búfer S30 con anticipación y manténgalo frío. Prepare el tampón S30 de acuerdo con la Tabla 2, a un pH final de 8.2. NOTA: El búfer S30 se puede preparar días antes de la cosecha de células. Si se hace esto, preparar sin ditiotreitol y conservar a 4 °C. Agregue dithiothreitol justo antes de usar.</li>
	<li>A partir de este momento, mantenga todas las soluciones y materiales en hielo. Transfiera 1 L de soporte a una botella de centrífuga de 1 L y centrífuga a 5.000 x g entre 4-10 °C durante 10 min. Decantar y desechar el sobrenadante. Usando una espátula estéril, transfiera el pellet a un tubo cónico de 50 ml preenfriado y previamente pesado.</li>
	<li>Lavar una vez con 30-40 mL de tampón S30 frío resuspensando el pellet a través de vórtice en ráfagas de 30 s con períodos de descanso en hielo. NOTA: Debido a un mayor volumen de pellets, dividir el pellet celular en dos tubos cónicos de 50 ml puede ser útil para el paso de lavado. El almacenamiento de células en alícuotas más pequeñas también proporciona flexibilidad para el procesamiento posterior.</li>
	<li>Centrifugar la resuspensión celular a 5000 x g entre 4-10 °C durante 10 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y limpie cualquier exceso de las paredes interiores del tubo cónico de 50 ml con un pañuelo limpio, evite tocar el pellet en sí. Pesa y congela el pellet en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C hasta su uso posterior. NOTA: Es posible que los pellets no requieran congelación instantánea si el usuario planea continuar con el protocolo de preparación del extracto.</li>
</ol>3. Preparación del extracto
<ol><li>Combine el pellet congelado con 1 ml de tampón S30 por cada 1 g del pellet celular y deje descongelar en hielo durante aproximadamente 30-60 min. Resuspend pellet descongelado a través de vórtices en ráfagas de 30 s con períodos de descanso sobre hielo. Vórtice hasta que no queden grupos visibles de células. NOTA: Los grupos más pequeños se pueden resuspendiendo mezclando con una pipeta.</li>
	<li>Transferir alícuotas de 1,4 ml de resuspensión celular a tubos de microfugio de 1,5 ml para la lisis celular. Sonicar cada tubo con una frecuencia de 20 kHz y 50% de amplitud durante tres ráfagas de 45 s con 59 s de reposo por ciclo rodeado de un baño de hielo. Invierta el tubo entre ciclos y agregue inmediatamente 4,5 μL de 1 M de ditiotreritotol después del último ciclo de sonicación. NOTA: Debido al calor liberado por la sonicación, es extremadamente importante asegurarse de que todas las alícuotas se mantengan en hielo cuando no se sonicen. El baño de hielo debe reponerse constantemente o ser lo suficientemente grande como para mantenerse fresco durante todo el proceso de sonicación.</li>
	<li>Centrifugar cada tubo a 18.000 x g y 4 °C durante 10 min. Recupere el sobrenadante y la alícuota en tubos de microfugio de 1,5 ml en alícuotas de 600 μL. Congelar alícuotas flash y conservar a -80 °C hasta su uso posterior. Se debe tener cuidado de pipetear solo el sobrenadante.</li>
</ol>4. Síntesis de proteínas libres de células
<ol><li>Descongele una alícuota de extracto del paso anterior para realizar 15 μL de reacciones de síntesis de proteínas libres de células en tubos de microfugio de 1,5 ml en cuadruplicato.</li>
	<li>Prepare cada reacción combinando 240 ng de ADN (concentración final de 16 μg/mL), 2,20 μL de Solución A, 2,10 μL de Solución B, 5,0 μL de extracto y un volumen variable de agua de grado molecular para llenar la reacción a 15 μL. Esta reacción se puede escalar a volúmenes más altos. Véanse los coeficientes en el cuadro 3 .<ol>
<li>Preparar la Solución A y B de acuerdo con la Tabla 4. Cada solución puede prepararse en lotes de 100 μL a 1 ml, alicitarse y almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior. NOTA: La cantidad de ADN puede variar dependiendo de la proteína de interés. En este caso, el plásmido utilizado, pJL1-sfGFP, se ha optimizado para funcionar a 16 μg/mL, o 597 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deje que las reacciones duren al menos 4 h a 37 °C.</li>
</ol>5. Cuantificación de la proteína reportera, súper carpeta proteína fluorescente verde (sfGFP)
<ol><li>Usando una placa de poliestireno negro de 96 pocillos de área media, combine 2 μL de cada producto de reacción de síntesis de proteínas libres de células con 48 μL de tampón HEPES de 0,05 M a pH 7.2. Se recomiendan de tres a cuatro réplicas de cada tubo de reacción.</li>
	<li>Cuantificar la intensidad de fluorescencia del sfGFP con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm.</li>
	<li>Para la conversión de unidades de fluorescencia relativas al rendimiento volumétrico (μg/mL) de sfGFP, establezca una curva estándar utilizando pJL1-sfGFP purificado.</li>
</ol>

<ol><li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
<li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+supplement+mixtures%3A+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li>
<li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li>
<li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22System+for+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li>
<li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li>
<li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li>
<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li>
<li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+the+preparation+of+%22endotoxin-free%22+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li>
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<li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li>
<li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system%3A+Practical+laboratory+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li>
<li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li>
<li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+A+highly+productive%2C+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li>
<li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li>
<li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses financieros en competencia.

La supervisión del investigador es tradicionalmente necesaria para dos acciones clave durante el crecimiento celular: la inducción de RNAP T7 y la recolección de células en un OD600 específico. CFAI evita ambos requisitos para disminuir el tiempo del investigador y la capacitación técnica requerida para preparar extractos celulares de alta calidad. La autoinducción de T7 RNAP se logra reemplazando la glucosa con lactosa como azúcar primaria en el medio, obviando la necesidad previa de monitorear activamente el...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

El uso de la síntesis de proteínas libres de células (PPCS) para aplicaciones biotecnológicas ha crecido sustancialmente en los últimos años 1,2,3. Este desarrollo puede atribuirse en parte al aumento de los esfuerzos para comprender los procesos que ocurren en CFPS y el papel de cada componente 4,5. Además, la reducción de los costos atribuidos a las configuraciones optimizadas y las fuentes de energía alternativas han hecho que la tecnología sin celdas sea más fácil de implementar para los nuevos usuarios 6,7,8,9. Con el fin de implementar los factores de transcripción y traducción necesarios para la síntesis de proteínas, el extracto celular se utiliza a menudo para impulsar reacciones libres de células10. Las guías de usuario publicadas recientemente han proporcionado protocolos simples para producir extracto funcional, lo que facilita la implementación para usuarios nuevos y experimentados por igual 1,11,12,13,14. El extracto celular se suele obtener a través de la lisis de un cultivo celular, que se puede cultivar utilizando diferentes organismos dependiendo del uso específico deseado 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) se ha convertido rápidamente en uno de los organismos huésped más utilizados para producir extractos funcionales17. Se prefiere la cepa BL21 Star (DE3) porque elimina las proteasas de la membrana externa (proteasa OmpT) y el citoplasma (Proteasa lon), proporcionando un ambiente óptimo para la expresión de proteínas recombinantes. Además, el DE3 contiene el λDE3 que lleva el gen de la ARN polimerasa T7 (T7 RNAP) bajo el control del promotor lacUV5; el componente estrella contiene un gen RNasaE mutado que evita la escisión del ARNm 4,14,18,19. Bajo el promotor lacUV5, la inducción isopropil-tiogalactopiraside (IPTG) permite la expresión de T7 RNAP 20,21. Estas cepas se utilizan para cultivar y cosechar células, que dan materia prima para la preparación del extracto. La lisis celular se puede realizar utilizando una variedad de métodos, incluyendo el batido de perlas, la prensa francesa, la homogeneización, la sonicación y la cavitación de nitrógeno 1,11,12,22.
El proceso de cultivo y recolección de bacterias es consistente en la mayoría de las plataformas cuando se usa E. coli, pero requiere varios días y una intensa supervisión del investigador 1,11,13. Este proceso generalmente comienza con un cultivo de semillas durante la noche en caldo LB, que al crecer durante la noche se inocula en un cultivo más grande de 2xYTPG (levadura, triptona, tampón de fosfato, glucosa) al día siguiente. El crecimiento de este cultivo más grande se monitorea hasta que alcanza la fase logarítmica temprana a media, a una densidad óptica (OD) de 2.514,20. Se requiere una medición constante ya que se ha demostrado previamente que los componentes de la transcripción y la traducción son altamente activos en la fase logarítmica temprana a media23,24. Si bien este proceso puede crear extracto reproducible, nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un nuevo método utilizando medios de autoinducción libre de células (CFAI), que reduce la supervisión del investigador, aumenta el rendimiento general del extracto para un litro determinado de cultivo celular y mejora el acceso a la preparación de extractos basados en E. coli tanto para usuarios experimentados como nuevos (Figura 1 ). Aquí proporcionamos la guía paso a paso para implementar el flujo de trabajo de CFAI, para pasar de una placa rayada de células a una reacción CFPS completa dentro de las 24 horas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microfuga de 1,5 mL</td><td>Phenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1 L</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-E</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Citación Lector multimodo de imágenes de 5 células</td><td>Biotek BTCYT5F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Lactosa</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glycine Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Histadina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptófano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-Valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>Agua de Grado Molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa</td><td>Aesar A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42/42R Incubadora</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Oxálico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potasio Dibásico</td><td>Acros, Orgánicos</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potasio Monobásico Acros</td><td>, Orgánicos</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Kit de Preparación de Plásmidos</td><td>ThermoFisher K210007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone Fisher</td><td>Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L Frasco de batido con deflector</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>Procesador</td> <td>ultrasónicoQSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

de las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) ha crecido como una plataforma biotecnológica que captura maquinaria de transcripción y traducción in vitro. Numerosos desarrollos han hecho que la plataforma CFPS sea más accesible para los nuevos usuarios y han ampliado la gama de aplicaciones. Para los sistemas CFPS basados en lisado, se pueden generar extractos celulares a partir de una variedad de organismos, aprovechando la bioquímica única de ese huésped para aumentar la síntesis de proteínas. En los últimos 20 años, Escherichia coli (E. coli) se ha convertido en uno de los organismos más utilizados para apoyar CFPS debido a su asequibilidad y versatilidad. A pesar de los numerosos avances clave, el flujo de trabajo para la preparación de extractos de células de E. coli ha seguido siendo un cuello de botella clave para que los nuevos usuarios implementen CFPS para sus aplicaciones. El flujo de trabajo de preparación de extractos requiere mucho tiempo y requiere experiencia técnica para lograr resultados reproducibles. Para superar estas barreras, anteriormente informamos sobre el desarrollo de un flujo de trabajo de autoinducción sin celdas (CFAI) las 24 horas que reduce la entrada del usuario y la experiencia técnica requerida. El flujo de trabajo de CFAI minimiza la mano de obra y la habilidad técnica requerida para generar extractos de células, al tiempo que aumenta las cantidades totales de extractos de células obtenidas. Aquí describimos ese flujo de trabajo paso a paso para mejorar el acceso y apoyar la amplia implementación de CFPS basado en E. coli .

Al preparar los medios CFAI, la glucosa se intercambió por un aumento de lactosa y glicerol como principal sustrato energético en los medios. Además, también se aumentó la capacidad de almacenamiento en búfer de los medios CFAI. Estos componentes específicos se dan en la Tabla 1.
Las células se cultivaron a un OD600 de 10 y al estándar 2.5 en medios CFAI para mostrar consistencia con la calidad del extracto a pesar de las diferentes cantidades de extracto. El medio ...

Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

El método de autoinducción libre de células reduce la supervisión del investigador y el tiempo necesario para producir extractos celulares funcionales. Esto simplifica los protocolos previos de síntesis de proteínas in vitro que consumían más tiempo e intensidad. Esta técnica es menos complicada y también de alto rendimiento, lo que permitirá a una audiencia más grande implementar la expresión libre de células.Este método destaca la importancia del metabolismo energético durante el crecimiento celular y dentro de las reacciones libres de células. Comience por preparar 960 mililitros de medios de autoinducción libres de células. Luego, esterilice el medio en un matraz desconcertado de 2.5 litros en autoclave durante 30 minutos a 121 grados centígrados.A continuación, después de preparar 40 mililitros de la solución de azúcar, filtre y esterilice en un recipiente de vidrio en autoclave separado. Después del autoclave, cuando el medio de cultivo se haya enfriado por debajo de 40 grados centígrados, agregue la solución de azúcar esterilizada por filtro directamente al medio. A continuación, inocule los medios deslizando un bucle lleno de colonias de una placa estrella E.coli BL21 fresca previamente rayada e insertando el bucle directamente en el medio.Gire el bucle en el medio sin tocar los lados del contenedor. Luego, coloque el medio inoculado durante la noche en una incubadora de 30 grados Celsius con agitación a 200 RPM. Al día siguiente, cosecha las células transfiriendo un litro del medio a una botella de centrífuga de un litro y centrifugando a 5.000 veces G entre cuatro y 10 grados centígrados durante 10 minutos.Después de desechar el sobrenadante, use una espátula estéril para transferir el pellet a un tubo cónico de 50 mililitros preenfriado y previamente pesado. A continuación, lave el pellet una vez con 30 a 40 mililitros de tampón S30 frío resuspiendo el pellet a través del vórtice en ráfagas de 30 segundos con períodos de descanso en hielo. Después de que el pellet esté completamente resuspendido, centrifugue la resuspensión celular, deseche el sobrenadante y, con un pañuelo limpio, limpie cualquier exceso de sobrenadante de las paredes internas del tubo de 50 mililitros sin tocar el pellet.Luego, pese el pellet antes de congelarlo en nitrógeno líquido y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para preparar el extracto celular, agregue un mililitro de tampón S30 por gramo del pellet de célula congelado y permita que el pellet se descongele en hielo durante 30 a 60 minutos. Luego, vuelva a suspender el pellet descongelado a través de vórtices en ráfagas de 30 segundos con períodos de descanso en hielo hasta que no queden grupos de células visibles.Para la lisis celular, transfiera 1,4 alícuotas de mililitros de la suspensión celular a tubos de microfugios de 1,5 mililitros. Luego, sonice la suspensión celular en cada tubo con una frecuencia de 20 kilohercios y 50% de amplitud durante tres ráfagas de 45 segundos con 59 segundos de reposo por ciclo en un baño de hielo Invierta el tubo entre ciclos, y después del último ciclo de sonicación, agregue inmediatamente 4.5 microlitros de ditiotreitol monolar. Después de sonicar la suspensión celular en todos los tubos, centrífuga los tubos y recoger el sobrenadante en alícuotas de 600 microlitros en tubos de microfugio frescos de 1,5 mililitros.Congela y almacena las alícuotas a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para realizar 15 microlitros de reacción de síntesis de proteínas libres de células en tubos de microfugios de 1,5 mililitros en cuadruplicato, descongele una alícuota del extracto celular. Después de preparar cada mezcla de reacción de 15 microlitros, deje que la reacción se ejecute durante al menos cuatro horas a 37 grados centígrados.Para cuantificar la proteína reportera, combine 48 microlitros de tampón HEPES de 50 milimolares a pH 7.2 con dos microlitros de cada producto de reacción de síntesis de proteínas libres de células en una placa de poliestireno negro de 96 pocillos. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de la proteína fluorescente verde supercarpeta, o sfGFP, utilizando una longitud de onda de excitación de 485 y una longitud de onda de emisión de 528 nanómetros. Luego, convierta las unidades de fluorescencia relativas al rendimiento volumétrico de sfGFP creando una curva estándar utilizando el plásmido pJL1 sfGFP purificado.Aquí se muestran gránulos de medios de autoinducción libres de células después de la cosecha celular a diferentes densidades ópticas medidas a 600 nanómetros. El medio cultivado a una densidad óptica de 10 produjo una mayor cantidad de pellet celular en el extracto general que el medio cultivado a una densidad óptica de 2.5. Un análisis adicional de la concentración total de proteínas no demostró diferencias significativas en la proteína general entre ambos extractos.A pesar de que el medio se cultivó a diferentes niveles de densidad óptica, ambos extractos demostraron resultados similares en reacciones libres de células que expresan sfGFP. Mantener condiciones estériles mientras se preparan los medios y la solución de azúcar es importante. Este método de extracto celular CFAI se puede utilizar para la mayoría de las aplicaciones de expresión libre de células.Estos van desde la educación en biotecnología hasta la ingeniería de proteínas, así como el diagnóstico en el punto de atención. Este método reduce la cantidad de tiempo y la habilidad técnica requerida, mejora la reproducibilidad y produce mayores cantidades de extracto.

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Aprende el método de autoinducción sin células para sintetizar proteínas funcionales de Escherichia coli en menos de 24 horas. Esta técnica simplificada reduce la supervisión del investigador y mejora la accesibilidad en biotecnología.

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De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

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