Name: Inmunotinción flotante de cerebros de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende la técnica de inmunotinción flotante en cerebros de ratón C57BL/6J para neurociencia. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad y calidad de los resultados histológicos en estudios neuroanatómicos.

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Los investigadores fueron apoyados por subvenciones de los NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 y R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) y American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.

En el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos (8-16 semanas de edad). El cuidado de todos los animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine.
1. Perfusión
NOTA: Los pasos 1.1 a 1.6 se realizan en una campana extractora de humos.
<ol><li>Anestesia<ol>
<li>Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales) sobre una toalla de papel colocada en la parte inferior de un desecador. Introduzca el ratón en la barrera agujereada dentro del desecador y espere hasta que los signos de respiración hayan desaparecido. NOTA: Sin respiración, el ratón todavía tiene latidos cardíacos durante un corto período de tiempo, y se perfundirá antes de la desaparición de los latidos del corazón.</li>
		<li>Antes de continuar, confirme que no hay reflejo de un pellizco en el dedo del pie.</li>
		<li>Fije el ratón a una tabla de espuma pasando un alfiler a través de cada pie. Asegúrese de que la tabla de espuma se coloque en una bandeja para recoger el derrame de líquido.</li>
	</ol></li>
	<li>Exponiendo el corazón<ol>
<li>Haga una incisión superficial longitudinal a lo largo de la línea media sobre el tórax y el abdomen, luego mueva la piel a un lado para exponer la pared muscular del tórax y el abdomen. A continuación, haga una incisión en la capa muscular para exponer el hígado y el intestino. Finalmente, corte la caja torácica con tijeras para abrir el tórax y exponer el corazón y los pulmones. Use pinzas hemostáticas para tirar de la caja torácica a un lado para ensanchar el área de trabajo.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de sangre terminal (opcional)<ol>
<li>Inserte una jeringa de 1 ml (consulte la Tabla de materiales) cuidadosamente en la aurícula derecha del corazón hasta que la punta esté completamente incrustada. Mantenga la jeringa firme y extraiga sangre lentamente hasta que se alcance el volumen deseado. NOTA: Tenga cuidado de no penetrar más allá de la aurícula derecha; La recolección de 300-400 μL de sangre es alcanzable por ratón adulto. Se pueden usar aditivos como un acelerador de coágulos o anticoagulante, dependiendo del propósito de la recolección de sangre.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocación de la cánula de perfusión<ol>
<li>Para los principiantes, corte un pequeño orificio (<1 mm) en el ventrículo izquierdo del corazón con tijeras e inserte una cánula roma (aguja de 18 G para ratones jóvenes y aguja de 21 G para ratones envejecidos) a través del ventrículo izquierdo en la aorta ascendente. Alternativamente, para los experimentadores experimentados, penetre el ventrículo cardíaco izquierdo con una cánula roma directamente e insértela en la aorta ascendente con cuidado.</li>
		<li>Coloque pasadores alrededor de la conjunción de la cánula y el tubo acoplado en la tabla de espuma para evitar el movimiento durante la perfusión. Alternativamente, use pinzas hemostáticas para fijar la cánula en su lugar. Proceda a cortar la aurícula derecha para permitir la salida de sangre de la circulación. NOTA: La cánula de perfusión y el tubo acoplado están conectados a la bomba de perfusión.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusión con solución salina<ol>
<li>Encienda el interruptor de presión salina y perfunda al ratón transcárdicamente con 40-60 ml de solución salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado. NOTA: Se utiliza una bomba de perfusión automatizada (consulte la Tabla de materiales) para enjuagar la sangre en 1-2 minutos. Como el rango de presión de la bomba es de 1-300 mmHg, la velocidad se puede ajustar en consecuencia. Si la solución salina tiene fugas de la nariz y / o el pulmón está inflado, disminuya la presión y ajuste la cánula. Una vez que el flujo de salida ya no contiene sangre, el cerebro está lo suficientemente enrojecido con solución salina. Mientras tanto, el hígado está desprovisto de sangre y se vuelve de color gris parduzco.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusión con formalina<ol>
<li>Apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el ratón con 40 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF: 25 ° C, pH 6.8-7.2, consulte la Tabla de materiales). Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores. NOTA: El movimiento de la cola también se puede observar después de la infusión de 10% NBF. PRECAUCIÓN: Como nbF es peligroso, se sugiere que los investigadores usen equipo de protección personal (por ejemplo, respirador apropiado, protector facial) durante todo el procedimiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento cerebral9<ol>
<li>Use tijeras para quitar la cabeza. Haga una incisión en la línea media a lo largo del tegumento para exponer el cráneo. Recorte la piel y la unión muscular con tijeras.</li>
		<li>Haga un corte en la cresta orbital y luego coloque el extremo afilado de las tijeras del iris en el foramen magnum. Avance las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo, manteniendo la presión hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Retire los huesos parietales/frontales y las meninges con cuidado. Finalmente, retire el cerebro del cráneo abierto suavemente.</li>
	</ol></li>
	<li>Post-fijación<ol>
<li>Coloque el cerebro en un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15% para la fijación durante la noche a 4 ° C. NOTA: Para preparar 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15%, combine 5 ml de NBF al 10% y 5 ml de sacarosa al 30% (p/v, disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS), consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que el volumen del búfer fijador sea al menos 10 veces mayor que la propia muestra. Inicialmente, el cerebro flotará en el amortiguador y se hundirá hasta el fondo después de la fijación nocturna.</li>
	</ol></li>
	<li>Deshidratación<ol>
<li>Transfiera la muestra de cerebro a un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de sacarosa al 30% para la deshidratación a 4 ° C hasta que se hunda.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Crioseccionación (secciones coronales)
<ol><li>Preparación<ol>
<li>Coloque hielo seco encima de la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible. Extienda cuidadosamente 5 ml de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa de una base sólida después de que la solución de sacarosa esté completamente congelada. Coloque todas las muestras de cerebro (hasta 5 muestras de cerebro en un lote) horizontalmente en una línea en la parte superior de la sacarosa, y luego agregue 0.5 ml de sacarosa al 30% a la parte inferior de cada cerebro. NOTA: El cerebro se adherirá inmediatamente a la base de sacarosa congelada y se congelará gradualmente de abajo hacia arriba. Coloque sacarosa adicional alrededor de la porción montada del cerebro para formar una base más resistente para cortar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seccionamiento<ol>
<li>Después de 5-10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa / región deseada. NOTA: Ajuste la cantidad de hielo seco en la placa para controlar la temperatura. La temperatura es demasiado baja cuando aparecen cristales de hielo en la superficie del cerebro. La temperatura es demasiado alta cuando el cerebro se vuelve blando y ya no es blanco.</li>
		<li>Cambie del modo Trim al modo Feed y sección de tejido cerebral a 25 μm de espesor. Prepare una placa de 48 pocillos llena de 1x PBS y marque cinco pocillos para un cerebro de ratón. Use un pincel para recoger cada sección de un mouse y colóquela en un pozo. Recoge la sección posterior del mismo ratón y colócala en el 2º pozo.</li>
		<li>Repita 2.2.2 hasta que se alcance el 5º pozo, colocando las secciones 6-10 en el 1º-5º pozo y así sucesivamente. Repita el mismo procedimiento para el resto de los cerebros simultáneamente. Repita hasta que todas las secciones de un ratón se recojan en los 5 pocillos en orden anatómico. NOTA: Después de este procedimiento, las secciones cerebrales de cada ratón se alicitan en 5 series, que se pueden utilizar para hasta 5 estudios histológicos diferentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almacenamiento<ol>
<li>Use un pincel para transferir las secciones de cada pozo a un microtubo de 1,5 ml lleno de tampón crioprotector (20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS), y almacene las muestras a -20 °C. NOTA: Estas secciones almacenadas en tubos pequeños (1,5 ml) pueden ahorrar espacio físico en el congelador, y la integridad de las secciones se puede conservar durante varios meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tinción WFA flotante e inmunotinción anti-AVP
<ol><li>Coloque un colador celular en un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos llena de PBS, y use un pincel para transferir una serie de secciones cerebrales al colador celular. Enjuague las secciones en PBS transfiriendo el colador celular a otro pozo lleno de PBS. Enjuague durante 6 x 10 min en un agitador para secciones almacenadas en tampón crioprotector y 3 x 10 min para secciones recién cortadas. NOTA: Todos los procedimientos de lavado se realizan en una placa de cultivo celular de 6 pocillos con un colador celular dentro de cada pozo (ver la Tabla de Materiales). Cada colador contiene las secciones cerebrales de interés de cada ratón. Para ahorrar reactivos, todos los procedimientos de incubación descritos a continuación se realizan en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Entre los procedimientos de lavado e incubación, use un pincel para transferir las secciones cerebrales entre cada colador celular y cada tubo. Para el lavado con PBS, 12 ml es adecuado para cada pozo.</li>
	<li>Preparar 1 ml de solución WFA (1:1.000) marcada con biotina en tampón PBT (2,5 ml de Tritón X-100 disuelto en 1.000 ml de PBS) en tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales del colador celular al tubo e incube a temperatura ambiente en una plataforma basculante ~ 50 rpm durante la noche.</li>
	<li>Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 minutos como se describe en 3.1.</li>
	<li>Preparar 1 ml de solución de estreptavidina-Dylight 488 (1:500) en PBT en un tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales al tubo e incube a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~ 50 rpm. NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz de este paso adelante.</li>
	<li>Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en tampón de bloqueo (3% de suero normal de burro diluido en PBT) durante 2 h a temperatura ambiente. NOTA: La elección del suero bloqueador está determinada por la especie a partir de la cual se genera el anticuerpo secundario. por ejemplo, si el anticuerpo secundario es de cabra, se debe usar suero de cabra normal.</li>
	<li>Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos primarios (conejo anti-AVP, 1:500) a temperatura ambiente en una plataforma basculante a ~50 rpm durante la noche. NOTA: Prepare anticuerpos primarios y secundarios en el tampón de bloqueo. La concentración, la duración de la incubación y la temperatura de incubación deben optimizarse en estudios piloto.</li>
	<li>Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos secundarios (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~50 rpm. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min.</li>
</ol>4. Montaje
<ol><li>Llene dos placas de Petri (un diámetro de 150 mm) con 100 ml de 1x PBS cada una. Transfiera todas las secciones cerebrales de un colador al primer plato y alinee las secciones cerebrales en orden neuroanatómico de caudal a rostral. NOTA: Para evitar mezclar secciones de diferentes animales, monte una serie de secciones cerebrales de un animal a la vez.</li>
	<li>Después de que todas las secciones del cerebro estén alineadas en el primer plato, sumerja una diapositiva en el segundo plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte (ver Figura 1 y Figura 2). Use un pincel fino para colocar suavemente una sección cerebral justo debajo de la interfaz de búfer de aire en la diapositiva inclinada. Repita el mismo procedimiento con otra sección del cerebro y móntelo al lado de la primera sección.</li>
	<li>Use una pipeta de transferencia para quitar lenta y suavemente el búfer para bajar su nivel hasta que ambas secciones del cerebro estén completamente por encima de la interfaz del búfer de aire. NOTA: Tenga cuidado de minimizar la perturbación de la superficie del amortiguador, o las secciones del cerebro pueden flotar. Cuando esté seca, esta fila de secciones cerebrales se adherirá firmemente a la diapositiva. Si es necesario, ajuste suavemente las secciones de la diapositiva para asegurarse de que no haya arrugas o pliegues en el tejido cuando las secciones aún estén húmedas.</li>
	<li>Repita este proceso hasta que se alcance la parte inferior de la diapositiva. Continúe repitiendo hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s).</li>
</ol>5. Coverslipping
<ol><li>Después de que todas las secciones se hayan secado (1-24 h a temperatura ambiente), coloque 80-100 μL de medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI (consulte la Tabla de materiales) en la diapositiva y aplique suavemente una cubierta de vidrio para cubrir las muestras. NOTA: Aplique la cubierta de vidrio con cuidado y lentamente para evitar burbujas.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos de microscopio (consulte la Tabla de materiales) y guárdelos a 4 °C. NOTA: Tome imágenes de todas las secciones dentro de 1-3 días para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia y el desarrollo de la autofluorescencia.</li>
</ol>6. Imágenes
<ol><li>Encienda el escáner y el ordenador (consulte la Tabla de materiales). Coloque las diapositivas en el soporte de la diapositiva con el dispositivo de carga e inserte el soporte en el escáner. NOTA: El escáner permite escanear múltiples canales (por ejemplo, canales 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), verde y rojo) simultáneamente. El escáner escanea diapositivas solo con un aumento de 20x, y se puede usar un microscopio fluorescente tradicional (consulte la Tabla de materiales) cuando se necesita un aumento más alto (por ejemplo, 40x).</li>
	<li>Abra el software del escáner (consulte la Tabla de materiales). Elija la ubicación de almacenamiento y el perfil de escaneo adecuados.</li>
	<li>Inicie el análisis de vista previa haciendo clic en el botón Iniciar análisis de vista previa . Después de la exploración preliminar, abra el asistente de detección de tejidos y rodee las regiones de interés para la obtención de imágenes.</li>
	<li>Haga clic en el botón Iniciar escaneo después de elegir las regiones para la obtención de imágenes. Espere a que la máquina termine de escanear. Compruebe el archivo de resultados y exporte las imágenes. NOTA: Si el perfil no es adecuado para la diapositiva, ajuste reenfocando y cambiando el tiempo de exposición o la intensidad de la luz para adaptar el perfil a los tejidos. Consulte las instrucciones del escáner para obtener más detalles técnicos (Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
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<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR%28Cre%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li>
<li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+embedding%2C+and+sectioning+of+tissues%2C+embryos%2C+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+potassium+current+in+AgRP%2FNPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.
La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el cerebro, ...

La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga socioeconómica1,2. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de las técnicas de histología cerebral varían considerablemente entre los laboratorios e incluso los investigadores dentro del mismo laboratorio por diversas razones (por ejemplo, anticuerpos, tejidos, tratamientos, especies, objetivos de investigación). Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo general para los estudios histológicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Mientras tanto, los principiantes pueden aprender, dominar y ajustar rápidamente este protocolo para satisfacer sus necesidades individuales.
La tinción inmunohistoquímica es un método establecido que se ha utilizado ampliamente para visualizar tipos específicos de células, ARNm y proteínas en una variedad de tejidos (por ejemplo, tejido cerebral y periférico)5,6. Más específicamente, un antígeno de interés puede ser marcado por un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario correspondiente vinculado a una enzima (por ejemplo, inmunohistoquímica cromogénica) o un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína)6. Como ejemplo de la utilidad de estas técnicas, β-endorfina [un péptido codificado por pro-opiomelanocortina (POMC)] y c-fos (un marcador de actividad neuronal) se tiñeron en el núcleo arqueado. Se demostró que la deleción de triptófano hidroxilasa 2 (una enzima integral a la síntesis de serotonina) en el núcleo dorsal del rafe disminuye la expresión de c-fos en las neuronas POMC en el núcleo arqueado7. Además, se mapeó la distribución del ARNm del receptor de vitamina D en el cerebro del ratón mediante hibridación in situ (RNAscope)8. Este artículo presenta un método confiable y eficiente con un flujo de trabajo paso a paso para la inmunotinción flotante, con el objetivo de mejorar la calidad y la reproducibilidad de los estudios histológicos del cerebro del ratón.

<table><tbody><tr><td>Alexa Flour 594 burro anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30% de sacarosa</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 g de sacarosa disputada en 100 mL de PBS</td></tr><tr><td>&nbsp; Formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>10%, 25 & deg; C, pH 6,8-7,2</td></tr><tr><td>Jeringa Sub-Q de 1 mL</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48 pocillos placa de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr> 6 <tr><td>pocillos placa de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje antidecoloración con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de plástico esterilizable en autoclave</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo AVP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Tampón</td><td></td> crioprotector 431752 <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Preferencia del usuario</td><td>No aplicable</td><td>20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DFC310FX Leica</td><td>Leica</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de portaobjetos para microscopio (50 plazas)</td><td>VWR</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>Preferencia del usuario</td><td>No aplicable</td><td>2,5 mL de Triton X-100 disuelto en 1000 mL de PBS</td></tr><tr><td>Perfusión dos sistemas de perfusión automatizados</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 &deg; C, pH 7,3-7,5, 1x composición:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampón de fosfato</td></tr><tr><td>Microtomo deslizante Microm HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>RICCA Chemical</td><td>7220-32</td><td>0,9%, 25 & deg; C, pH 7.4</td></tr><tr><td>Proteína Estreptavidina, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td><td>#21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo WFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td><td>Zeiss</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> Zen 3.1 <td>software de escáner</td></tr></tbody></table>

inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.
También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.

El diagrama de flujo de este protocolo se ilustra brevemente en la Figura 1. El procedimiento de crioseccionamiento de este laboratorio se demuestra en la Figura 2A, en la que se seccionaron 5 muestras de cerebro simultáneamente. El montaje de las secciones cerebrales se muestra en la Figura 2B, y una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales se ilustra en la Figura 2C. En <strong class...

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica comúnmente utilizada en la investigación de la neurociencia. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de la histología cerebral pueden variar entre diferentes investigadores y laboratorios. Presentamos una metodología establecida para estudios histológicos de cerebros de ratón que ha demostrado ser reproducible, confiable y eficiente.Chunmei Wang, profesor asistente de mi laboratorio Después de confirmar la anestesia exitosa en un ratón C57 negro / 6J de ocho a 16 semanas de edad, fije el mouse en una tabla de espuma y haga una incisión superficial longitudinal a lo largo de la línea media sobre el tórax y el abdomen, luego mueva la piel a un lado para exponer la pared muscular del tórax y el abdomen. A continuación, haga una incisión en la capa muscular para exponer el hígado y el intestino. Luego, usando tijeras, corte la caja torácica para abrir el tórax y exponer el corazón y los pulmones.Usando pinzas hemostáticas, tire de la caja torácica a un lado para ensanchar el área de trabajo. Próximo. para colocar una cánula de perfusión, penetre directamente en el ventrículo cardíaco izquierdo con una cánula roma e insértela con cuidado en la aorta ascendente. Coloque alfileres alrededor de la conjunción de la cánula y el tubo acoplado en la tabla de espuma para fijar la cánula en su lugar durante la perfusión, y proceda a cortar la aurícula derecha para permitir la salida de sangre de la circulación.Para la perfusión con solución salina, encienda el interruptor de presión salina y perfunda el ratón transcárdicamente con 40 a 60 mililitros de solución salina. Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado. A continuación, para perfundir con formalina, apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el mouse con 40 mililitros de formalina con tampón neutro al 10%.Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores. Para el aislamiento cerebral, use tijeras para quitar la cabeza y haga una incisión en la línea media a lo largo del tegumento para exponer el cráneo, luego recorte la piel y la unión muscular. A continuación, haga un corte en la cresta orbital y coloque el extremo afilado de las tijeras del iris en el foramen magnum.Avance las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo, manteniendo la presión hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Luego, retire cuidadosamente los huesos parietales y frontales y las meninges antes de extraer el cerebro del cráneo abierto. Coloque hielo seco sobre la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible, luego extienda cuidadosamente cinco mililitros de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa base sólida después de que la sacarosa se haya congelado.A continuación, coloque todas las muestras de cerebro horizontalmente en una línea en la parte superior de la base de sacarosa con 500 microlitros de 30% de sacarosa. Después de cinco a 10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa o región deseada, luego, cambie del modo de recorte al modo de alimentación y seccione el tejido cerebral para generar secciones de 25 micrómetros de espesor. A continuación, prepare una placa de 48 pocillos llena de PBS y marque cinco pocillos para un cerebro de ratón.Usando un pincel, recoja una sección y colóquela en un pozo, luego recoja la sección posterior del mismo mouse y colóquela en el segundo pozo. Repita el procedimiento hasta que se alcance el quinto pozo colocando las secciones seis a 10 en el primer al quinto pozo, y así sucesivamente. Coloque un colador celular en un pozo de una placa de cultivo celular de seis pocillos llena de PBS y, usando un pincel, transfiera una serie de secciones cerebrales al colador celular.Enjuague estas secciones en PBS transfiriendo el colador celular a otro pozo lleno de PBS en el agitador. Luego, transfiera las secciones cerebrales del colador celular a un tubo de 1.5 mililitros que contenga un mililitro de WFA marcado con biotina e incube en una plataforma de balanceo a 50 RPM durante la noche. Al día siguiente, enjuague las secciones cerebrales con PBS como se demostró anteriormente, luego transfiera las secciones a un tubo que contenga un mililitro de solución de estreptavidina diurna 488 e incube durante dos horas en una plataforma basculante.Después de enjuagar las secciones cerebrales con PBS nuevamente, incube en un tampón de bloqueo durante dos horas, seguido de la incubación en anticuerpo primario durante la noche en una plataforma de balanceo. Al día siguiente, después de los enjuagues de PBS, incube las secciones en anticuerpos secundarios durante dos horas. Llene dos placas de Petri con 100 mililitros de PBS y transfiera todas las secciones cerebrales de un colador al primer plato.Alinear las secciones cerebrales en orden neuroanatómico de caudal a rostral. Luego, sumerja una diapositiva en el segundo plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte, y con un pincel fino, coloque suavemente una sección cerebral justo debajo de la interfaz del amortiguador de aire en la diapositiva inclinada. A continuación, usando una pipeta de transferencia, retire lenta y suavemente el búfer para bajar su nivel hasta que la sección del cerebro esté completamente por encima de la interfaz del búfer de aire.Continúe repitiendo este proceso hasta que se alcance la parte inferior de la diapositiva y todas las secciones se monten en la diapositiva. Para obtener imágenes, encienda el escáner y la computadora, luego coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas con el dispositivo de carga e inserte el soporte en el escáner. Abra el software del escáner y elija la ubicación de almacenamiento y el perfil de escaneo adecuados.Inicie el análisis de vista previa haciendo clic en el botón Iniciar análisis de vista previa. Después de la exploración, abra el asistente de detección de tejidos y rodee las regiones de interés para la obtención de imágenes. Después de elegir las regiones para la obtención de imágenes, haga clic en el botón Iniciar escaneo y espere a que la máquina termine de escanear.Compruebe el archivo de resultados y exporte las imágenes. Aquí se muestran imágenes representativas de inmunohistoquímica de fluorescencia de secciones cerebrales coronales de ratón en Bregma negativo 0,82 milímetros, que muestran la distribución de aglutinina de glicina floribunda, arginina vasopresina y DAPI. Las señales de aglutinina de Wisteria floribunda se observan en el área perifornical del hipotálamo anterior y el núcleo reticular, mientras que las señales de arginina vasopresina se observan en el núcleo paraventricular.Al probar este protocolo por primera vez, sugerimos realizarlo bajo la supervisión de un investigador experimentado. El protocolo ayudará a generar resultados histológicos óptimos y consistentes entre diferentes investigadores y laboratorios, y servirá de referencia para los principiantes que aprenden esta técnica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

A gran escala inmunodetección de las proteínas diana a través del cerebro de los primates todo es posible mediante el empleo de tejidos novedosos métodos de inclusión y corte en combinación con el uso de aparatos creativas para la tinción de lotes de varias secciones de flotación libre en un momento dado.

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Este video muestra el procedimiento para inmunoteñir una sección fija de tejido cerebral de ratón con astrocitos marcados con fluorescencia utilizando anticuerpos primarios y secundarios y capturar las imágenes de los astrocitos teñidos a través de microscopía confocal.

Inmunotinción de astrocitos marcados con fluorescencia en una sección de tejido cerebral de ratón

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

La administración mejorada por convección (CED) es un método que permite la entrega efectiva de terapias en el cerebro mediante la perfusión directa de grandes volúmenes de tejido. El procedimiento requiere el uso de catéteres y un procedimiento de inyección optimizado. Este protocolo describe una metodología para CED de un anticuerpo en un cerebro de ratón.

Entrega de anticuerpos en el cerebro murino a través de la entrega mejorada por convección

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Aprende la técnica de inmunotinción flotante en cerebros de ratón C57BL/6J para neurociencia. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad y calidad de los resultados histológicos en estudios neuroanatómicos.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

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