Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica comúnmente utilizada en la investigación de la neurociencia. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de la histología cerebral pueden variar entre diferentes investigadores y laboratorios. Presentamos una metodología establecida para estudios histológicos de cerebros de ratón que ha demostrado ser reproducible, confiable y eficiente.

Chunmei Wang, profesor asistente de mi laboratorio Después de confirmar la anestesia exitosa en un ratón C57 negro / 6J de ocho a 16 semanas de edad, fije el mouse en una tabla de espuma y haga una incisión superficial longitudinal a lo largo de la línea media sobre el tórax y el abdomen, luego mueva la piel a un lado para exponer la pared muscular del tórax y el abdomen. A continuación, haga una incisión en la capa muscular para exponer el hígado y el intestino. Luego, usando tijeras, corte la caja torácica para abrir el tórax y exponer el corazón y los pulmones.

Usando pinzas hemostáticas, tire de la caja torácica a un lado para ensanchar el área de trabajo. Próximo. para colocar una cánula de perfusión, penetre directamente en el ventrículo cardíaco izquierdo con una cánula roma e insértela con cuidado en la aorta ascendente. Coloque alfileres alrededor de la conjunción de la cánula y el tubo acoplado en la tabla de espuma para fijar la cánula en su lugar durante la perfusión, y proceda a cortar la aurícula derecha para permitir la salida de sangre de la circulación.

Para la perfusión con solución salina, encienda el interruptor de presión salina y perfunda el ratón transcárdicamente con 40 a 60 mililitros de solución salina. Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado. A continuación, para perfundir con formalina, apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el mouse con 40 mililitros de formalina con tampón neutro al 10%.

Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores. Para el aislamiento cerebral, use tijeras para quitar la cabeza y haga una incisión en la línea media a lo largo del tegumento para exponer el cráneo, luego recorte la piel y la unión muscular. A continuación, haga un corte en la cresta orbital y coloque el extremo afilado de las tijeras del iris en el foramen magnum.

Avance las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo, manteniendo la presión hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Luego, retire cuidadosamente los huesos parietales y frontales y las meninges antes de extraer el cerebro del cráneo abierto. Coloque hielo seco sobre la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible, luego extienda cuidadosamente cinco mililitros de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa base sólida después de que la sacarosa se haya congelado.

A continuación, coloque todas las muestras de cerebro horizontalmente en una línea en la parte superior de la base de sacarosa con 500 microlitros de 30% de sacarosa. Después de cinco a 10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa o región deseada, luego, cambie del modo de recorte al modo de alimentación y seccione el tejido cerebral para generar secciones de 25 micrómetros de espesor. A continuación, prepare una placa de 48 pocillos llena de PBS y marque cinco pocillos para un cerebro de ratón.

Usando un pincel, recoja una sección y colóquela en un pozo, luego recoja la sección posterior del mismo mouse y colóquela en el segundo pozo. Repita el procedimiento hasta que se alcance el quinto pozo colocando las secciones seis a 10 en el primer al quinto pozo, y así sucesivamente. Coloque un colador celular en un pozo de una placa de cultivo celular de seis pocillos llena de PBS y, usando un pincel, transfiera una serie de secciones cerebrales al colador celular.

Enjuague estas secciones en PBS transfiriendo el colador celular a otro pozo lleno de PBS en el agitador. Luego, transfiera las secciones cerebrales del colador celular a un tubo de 1.5 mililitros que contenga un mililitro de WFA marcado con biotina e incube en una plataforma de balanceo a 50 RPM durante la noche. Al día siguiente, enjuague las secciones cerebrales con PBS como se demostró anteriormente, luego transfiera las secciones a un tubo que contenga un mililitro de solución de estreptavidina diurna 488 e incube durante dos horas en una plataforma basculante.

Después de enjuagar las secciones cerebrales con PBS nuevamente, incube en un tampón de bloqueo durante dos horas, seguido de la incubación en anticuerpo primario durante la noche en una plataforma de balanceo. Al día siguiente, después de los enjuagues de PBS, incube las secciones en anticuerpos secundarios durante dos horas. Llene dos placas de Petri con 100 mililitros de PBS y transfiera todas las secciones cerebrales de un colador al primer plato.

Alinear las secciones cerebrales en orden neuroanatómico de caudal a rostral. Luego, sumerja una diapositiva en el segundo plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte, y con un pincel fino, coloque suavemente una sección cerebral justo debajo de la interfaz del amortiguador de aire en la diapositiva inclinada. A continuación, usando una pipeta de transferencia, retire lenta y suavemente el búfer para bajar su nivel hasta que la sección del cerebro esté completamente por encima de la interfaz del búfer de aire.

Continúe repitiendo este proceso hasta que se alcance la parte inferior de la diapositiva y todas las secciones se monten en la diapositiva. Para obtener imágenes, encienda el escáner y la computadora, luego coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas con el dispositivo de carga e inserte el soporte en el escáner. Abra el software del escáner y elija la ubicación de almacenamiento y el perfil de escaneo adecuados.

Inicie el análisis de vista previa haciendo clic en el botón Iniciar análisis de vista previa. Después de la exploración, abra el asistente de detección de tejidos y rodee las regiones de interés para la obtención de imágenes. Después de elegir las regiones para la obtención de imágenes, haga clic en el botón Iniciar escaneo y espere a que la máquina termine de escanear.

Compruebe el archivo de resultados y exporte las imágenes. Aquí se muestran imágenes representativas de inmunohistoquímica de fluorescencia de secciones cerebrales coronales de ratón en Bregma negativo 0,82 milímetros, que muestran la distribución de aglutinina de glicina floribunda, arginina vasopresina y DAPI. Las señales de aglutinina de Wisteria floribunda se observan en el área perifornical del hipotálamo anterior y el núcleo reticular, mientras que las señales de arginina vasopresina se observan en el núcleo paraventricular.

Al probar este protocolo por primera vez, sugerimos realizarlo bajo la supervisión de un investigador experimentado. El protocolo ayudará a generar resultados histológicos óptimos y consistentes entre diferentes investigadores y laboratorios, y servirá de referencia para los principiantes que aprenden esta técnica.