In vivo Métodos para evaluar la función y estructura de las células ganglionares de la retina y el nervio óptico en animales grandes
26 de febrero de 2022
Aquí demostramos varias pruebas in vivo (flash visual evoked potential, electrorretinograma de patrón y tomografía de coherencia óptica) en macaco cabra y rhesus para comprender la estructura y función del nervio óptico y sus neuronas.
Hola a todos. Este es Yikui Zhang del Hospital de Ojos de Wenzhou. El nervio superior carece de Exxons de las células ganglionares de orexina, y luego transmite la señal visual al cerebro.
Un modelo más grande de lesión del nervio superior es esencial para traducir el nuevo tratamiento del modelo de robot a la aplicación de linfa. Aquí, describimos algunos métodos in vivo para evaluar la estructura y función de las células ganglionares de orexina en el nervio superior en animales grandes. Al presentar este método paso a paso, esperamos aumentar las discapacidades reproductivas experimentales y facilitar el uso de modelos más grandes de neurosis óptica.
Afeitarse con una maquinilla de afeitar electrónica. Y, prepárelo con 70% de alcohol tres veces, para limpiar la piel y exponer la vena subcutánea. Inserte un ricino venoso periférico por vía intravenosa.
Luego gotee atropina y propofol. Intubar a la cabra con un tubo traqueal de seis milímetros y conectarla a un respirador artificial. La anestesia se mantuvo con 3,5% de isoflurano en oxígeno a un caudal controlado constante de dos litros.
Coloque el sensor de temperatura debajo de la lengua de la cabra. Recorte la saturación de oxígeno que se escinde hasta el extremo proximal de la oreja de cabra. Ate el manguito de presión arterial a la base del muslo.
Pinza ECG se escinde en las extremidades en orden. Luego, podemos monitorear los indicadores vitales de la cabra. Afeitarse el cabello y desinfectar la piel con betadina y alcohol al 70% tres veces en el centro del hueso frontal.
Abra la bolsa esterilizadora que contiene las tijeras y las uñas. Haga incisiones en la piel para exponer el cráneo con una tijera. Tornillos de acero para implantar en el centro del hueso frontal.
Afeitar el cabello y desinfectar la piel con betadina y alcohol al 70% tres veces en un punto medio de dos orejas en el hueso occipital. Haga incisiones en la piel. Tornillos de acero para implantar en el punto medio de dos orejas en hueso occipital.
El electrodo de la aguja de tierra se inserta por vía subcutánea debajo del tornillo frontal del cráneo. El electrodo activo y el electrodo de referencia están conectados a un tornillo frontal y occipital respectivamente con clips de cocodrilo para reducir la impotencia del electrodo. Parche en un ojo.
Aplique gotas oftálmicas de anestesia tópica en la superficie ocular. Las pupilas de ambos lados están dilatadas por las gotas oftálmicas de midriasis. Coloque la cabeza de la cabra en un estimulador lleno de gas dirigido a la luz ambulante.
Coloque la manta negra sobre el estimulador y la cabeza de cabra durante cinco minutos de adaptación. El espéculo del párpado se utiliza para exponer completamente su pupila. Compruebe la impotencia de contacto del tejido del electrodo.
Asegúrese de que la impotencia esté por debajo de los 10 kilómetros para cada uno para evitar la interferencia electromagnética de otros dispositivos eléctricos en la misma habitación. Compruebe el ruido de referencia sin estimulación lumínica. Inicie la grabación FVEP.
Tenga en cuenta que la grabación FVEP en cada intensidad de luz se realiza dos veces. Tenga en cuenta que humedezca la córnea con lágrima artificial si parece seca. Repita los pasos para el ojo contralateral.
Inicie la grabación FVEP a diferentes intensidades de luz consecutivamente. Para cada grabación, se promedian 64 trazas para producir una forma de onda. El primer pico positivo y activo en la forma de onda FVEP fue designado como P1 y N1. El electrodo de tierra esterilizado se coloca en el lóbulo de la oreja.
Los electrodos activos y de referencia esterilizados se insertan por vía subcutánea a lo largo de la línea media y el hueso frontal y occipital respectivamente. El espéculo del párpado se utiliza para exponer completamente su pupila. Parche en un ojo.
Registre las respuestas VEP del patrón del otro ojo a diferentes frecuencias espaciales consecutivamente. Conéctelo al electrodo de tierra con un clip de cocodrilo. Dos electrodos de referencia de aguja esterilizados se colocan debajo de la piel un centímetro detrás del canto lateral en ambos lados.
El espéculo del párpado se utiliza para exponer completamente su pupila. Dos electrodos de registro ERG desinfectados se centran en ambas córneas después de la aplicación tópica de lágrima artificial. Se colocan dos estimuladores delante de cada ojo con una distancia de visión de 50 centímetros.
Asegúrese de que la impotencia esté por debajo de los 10 kilómetros. Rastree el ruido de referencia sin estimulación de la luz. Apunta la luz ambulante.
Inicie el patrón de grabación ERG desde ambos ojos simultáneamente a diferentes frecuencias espaciales consecutivamente. Por último, retorno de la pantalla para grabar patrón ERG sin estimuladores visuales y un control activo. El filtro de paso de banda está configurado para variar de uno a 75 Hertz para tres ERG de patrón CPD.
El filtro de paso de banda es de uno a 50 Hertz para suavizar la forma sin afectar su amplitud. Los primeros picos positivos y activos en forma de onda se designan como P1 y N1. El patrón de amplitud ERG medido de N1 a P1.To reducir la impotencia del electrodo, se coloca una referencia de aguja esterilizada debajo de la piel frontal. Y se coloca un electrodo de referencia de aguja esterilizado debajo de la piel un centímetro detrás del canto lateral en un lado.
Se coloca un electrodo de registro ERG desinfectado en la córnea en una aplicación tópica de lágrima artificial. Parche en un ojo. Una pantalla se coloca a una distancia de visualización de 50 centímetros.
El espéculo del párpado se utiliza para exponer completamente su pupila. Luego, la cabra se coloca en el reposamentón. Alinee la cabra con la cámara para enviar su cabeza del nervio óptico en la imagen de oftalmoscopia láser de escaneo confocal modificando la posición de su cabeza.
Haga clic en el botón de inicio para entrar en la fase final de detección. Espere a que la máquina termine de cargarse. Presione el botón amarillo de inicio para iniciar la imagen formal.
Ajuste el joystick para iluminar uniformemente la imagen infrarroja para mejorar la calidad de la imagen. Deslice la cámara hacia adelante hasta que se muestre la imagen de OCT retiniana vertical en la pantalla superior derecha. Modifique el joystick para que baile uniformemente en una imagen horizontal de octatoria retiniana.
Presiona el botón del joystick para capturar tu imagen automáticamente. Mantenga presionado este joystick para mantener la calidad de la imagen en la pantalla de imagen en vivo hasta que se complete la ejecución de la imagen. Luego presione adquirir.
Seleccione una foto inicial de alta calidad. Haga clic con el botón derecho y seleccione establecer referencia. Presione el botón de seguimiento para permitir que el programa haga coincidir automáticamente el escaneo actual con el escaneo de línea de base.
Una vez emparejado, presionó el botón en el joystick para activar el seguimiento automático en tiempo real. Haga clic en el botón de medición para ingresar a la plataforma de medición. Elija el borrador de una herramienta y limpie la línea RFL, que se etiqueta automáticamente por máquina.
Elija la herramienta de dibujo de líneas para delinear manualmente el límite entre IPL e INL. Entre las líneas roja y azul se encuentra el complejo GCC. Las imágenes alteradas de la retina en el macaco rhesus se realizan utilizando el mismo equipo y procedimiento que los utilizados en la cabra.
La Figura A muestra el FVEP representativo en cabra. La Figura B muestra el patrón representativo de forma de onda ERG en cabra. La Figura C muestra el patrón representativo FVEP en macaco rhesus.
Y, la figura D muestra el patrón representativo de forma de onda ERG en macaco rhesus. La figura dos muestra imágenes representativas de la OCT retiniana alrededor de la cabeza del nervio óptico y el grosor del complejo GCC en diferentes regiones periféricas en cabra y macaco rhesus. El modelo animal grande juega un papel importante en la investigación traslacional.
En muchos casos, los efectos terapéuticos prometedores en modelos animales pequeños no se tradujeron a pacientes humanos. En este estudio, presentamos el protocolo de video de FVEP, PERG y OCT en cabra y el macaco rhesus. Este método in vivo se puede aplicar en modelos más grandes de diversas neurosis ópticas, como el glaucoma isquémico o la neuropatía óptica traumática y la neuritis óptica.
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Descripción general
Este estudio presenta varias pruebas in vivo, incluyendo potencial evocado visual por destello, electroretinograma de patrón y tomografía de coherencia óptica en cabras y macacos rhesus. La investigación tiene como objetivo explorar la estructura y función del nervio óptico y sus neuronas, aportando conocimientos sobre la transmisión de señales visuales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Oftalmología
Antecedentes
- El estudio se centra en la función de las células ganglionares de orexina en la transmisión de señales visuales.
- Los modelos animales más grandes son fundamentales para trasladar tratamientos de sistemas robóticos a aplicaciones prácticas.
- Comprender la función del nervio óptico puede mejorar el conocimiento sobre los trastornos visuales.
- Los métodos in vivo son esenciales para evaluar estructuras y funciones neuronales.
Objetivo del estudio
- Evaluar los métodos para examinar la respuesta del nervio óptico a los estímulos visuales.
- Mejorar la reproducibilidad de experimentos que involucran modelos animales de mayor tamaño.
- Comprender la biomecánica de la neuritis óptica y sus posibles tratamientos.
Métodos Utilizados
- Se realizaron pruebas in vivo, incluyendo potenciales evocados visuales de destello (FVEP), electroretinogramas de patrón (PERG) y tomografía de coherencia óptica (OCT).
- Los modelos biológicos consistieron en cabras y macacos rhesus.
- Cada método incluyó pasos preparatorios específicos, como el manejo de la anestesia, la preparación quirúrgica y la monitorización eléctrica.
- Los pasos críticos implicaron asegurar la impedancia del electrodo y seguir protocolos rigurosos de recopilación de datos.
Resultados principales
- El estudio detalló la grabación de respuestas FVEP y PERG para evaluar el procesamiento de señales visuales en el nervio óptico.
- Los hallazgos indicaron picos específicos (P1 y N1) en las formas de onda que se correlacionaron con los estímulos visuales.
- La investigación proporcionó metodologías para mantener la calidad y fiabilidad de los datos en las grabaciones.
- Se destacaron conocimientos sobre las respuestas neuronales y las implicaciones potenciales para tratamientos.
Conclusiones
- Este estudio demuestra métodos eficaces para evaluar la función del nervio óptico mediante pruebas in vivo.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la transmisión de señales visuales y las implicaciones para el tratamiento de lesiones del nervio óptico.
- Los resultados subrayan la importancia de los modelos en animales grandes para trasladar la investigación básica en neurociencia a aplicaciones clínicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la función de las células ganglionares de la retina y del nervio óptico en animales grandes sirve de puente entre los hallazgos preclínicos y la traducción clínica humana, al proporcionar modelos anatómica y fisiológicamente relevantes. Los métodos electrofisiológicos e de imagen in vivo permiten la evaluación cuantitativa de la integridad de la vía visual, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en terapias neuroprotectoras y regenerativas. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación de dianas terapéuticas para neuropatías ópticas como el glaucoma, las lesiones traumáticas y los trastornos inflamatorios.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina y la conducción axonal en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona lecturas funcionales y estructurales que aclaran la participación de las vías y la actividad biológica de compuestos novedosos.
- Valor predictivo: Facilita la identificación de compuestos líder al correlacionar la modulación del objetivo con resultados electrofisiológicos y estructurales en modelos animales grandes.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas y repetibles de potenciales evocados visuales y espesor retiniano para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Establece protocolos reproducibles para el monitoreo longitudinal de los efectos del tratamiento en diferentes cohortes de estudio.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en distintas especies (cabra, macaco rhesus) y modelos de lesión (isquémico, traumático, inflamatorio).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mide cambios estructurales relevantes para la enfermedad (grosor del complejo GCC) y déficits funcionales (amplitudes de VEP y PERG) alineados con puntos finales clínicos.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el monitoreo de los mismos parámetros en diferentes sistemas modelo.
- Reducción de riesgos: Orienta las decisiones de avance o interrupción al demostrar la interacción con el objetivo y el efecto biológico en especies con relevancia traslacional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Los métodos descritos se integran en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas preclínicas de eficacia, proporcionando biomarcadores funcionales y estructurales de la salud del nervio óptico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos neuroprotectores mediante la cuantificación de la función de las células ganglionares de la retina y la integridad axonal.
- Selección: Proporciona salidas estandarizadas y listas para ensayos (amplitudes de onda, latencias, grosor de las capas retinianas) para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de los efectos del tratamiento mediante mediciones del pico P1/N1 y cuantificación del complejo GCC.
- Investigación Traducional: Conecta datos funcionales de electrofisiología y estructurales de OCT con resultados visuales clínicos en neuropatías ópticas humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma multi-especie y multi-modelo para pruebas iterativas de terapias que salvan la visión.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la modulación del objetivo con la función y estructura medibles de la vía visual.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de colocación de electrodos, control de impedancia y promediado de señales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de candidatos ineficaces antes de ensayos clínicos costosos.
- Impacto en la cartera: Favorece la priorización ajustada al riesgo mediante biomarcadores objetivos y traslacionales de la preservación del nervio óptico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, preparación quirúrgica y manejo de anestesia en animales grandes.
- Depende de sistemas de registro electrofisiológico, plataformas de imagenología por tomografía de coherencia óptica (OCT) y dispositivos de entrega de estímulos.
- Necesita la estandarización de la impedancia del electrodo (<10 kΩ), la evaluación del ruido de base y el promediado triplicado de señales.
- Implica consideraciones de adaptación para la anatomía específica de cada especie (parámetros craneales y oculares de cabra frente a los de macaco rhesus).
- Limitado por la complejidad del procedimiento y el cumplimiento de las normas de bienestar animal, lo cual puede afectar el rendimiento y la escalabilidad.
