Name: Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a analizar el estrés oxidativo en organoides intestinales murinos mediante sondas fluorogénicas sensibles a especies reactivas de oxígeno. Este método combina microscopía cualitativa y citometría de flujo cuantitativa.

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Este trabajo fue apoyado por la agencia nacional de investigación francesa (ANR) subvención 17-CE14-0022 (i-Stress).

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Uso del Instituto Pasteur y del Ministerio de Agricultura francés n.º 2016-0022. Todos los pasos se realizan dentro de una campana de cultivo de tejidos.
1. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de organoides intestinales
<ol><li>Para preparar el medio de cultivo de crecimiento, mezcle DMEM/F-12 avanzado suplementado con 1x glutamina, 1x solución de penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de EGF murino, 20 μg/mL de Noggin murino 500 ng/mL de R-Spondin1 de ratón (ver Tabla de Materiales). Deje el medio a temperatura ambiente (RT) durante la extracción de la cripta. NOTA: Congele el medio no utilizado en alícuotas a -20 °C. Evite congelar y descongelar.</li>
	<li>Llene un tubo de 50 ml con 40 ml de DMEM/F-12 avanzado y manténgalo en hielo. NOTA: Mantenga el medio no utilizado a 4 °C. Se utilizará para el pasaje de organoides.</li>
	<li>Precaliente las placas de cultivo celular (cámaras de pozo μ-Slide 8 y/o fondo redondo de 96 pocillos) en la incubadora a 37 °C.</li>
	<li>Descongelar la matriz de membrana basal (BMM) (ver Tabla de Materiales) alícuotas sobre hielo (antes de iniciar el protocolo o al menos 1 h antes de emplatar criptas). NOTA: El BMM se solidificará rápidamente si no se mantiene frío.</li>
	<li>Prepare la solución de lavado/lavado agregando una solución de penicilina-estreptomicina al 1% a DPBS (DPBS-P/S).</li>
	<li>Llene una placa de Petri de 100 mm con 10 ml de DPBS-P/S frío. Llene seis tubos de 15 ml con 10 ml de DPBS y etiquételos de F1 a F6.</li>
	<li>Preparar 30 ml de solución de EDTA de 10 mM por dilución a partir de 0,5 m de EDTA en DPBS. Llene dos tubos de 15 ml con 10 ml de EDTA de 10 ml y etiquételos como E1 y E2.</li>
	<li>Mantenga todas las soluciones preenfriadas a 4 ° C y manténgalas en el hielo durante el procedimiento.</li>
</ol>2. Cultivo de organoides intestinales
<ol><li>Sacrifice un ratón Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8-10 semanas de edad de acuerdo con las normas y regulaciones nacionales.</li>
	<li>Recolecte 5-8 cm del yeyuno que abarca la región entre el duodeno (a 5 cm del estómago) y el íleon (a 10 cm del ciego) y manténgalo en frío DPBS-P / S en hielo.</li>
	<li>Limpie el contenido intestinal enjuagando con 5-10 ml de DPBS-P/S frío. NOTA: Las jeringas de lavado caseras se pueden obtener tapando una punta de 200 μL en una boquilla de jeringa de 10 ml.</li>
	<li>Abra el intestino longitudinalmente usando tijeras de punta de bola (ver Tabla de Materiales) (para evitar dañar el tejido).</li>
	<li>Usando fórceps, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS-P/S frío a temperatura ambiente y agítelo para enjuagar.</li>
	<li>Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo a un tubo de 15 ml etiquetado como E1 que contenga 10 ml de EDTA frío de 10 mM.</li>
	<li>Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Usando una pipeta Pasteur de plástico, transfiera el tejido en el tubo F1 que contiene 10 ml dpbs. Vórtice durante 2 min (en vórtice normal, sosteniendo el tubo con la mano y asegurándose de que el intestino se arremolina bien).</li>
	<li>Coloque 10 μL de la fracción en una placa de Petri y evalúe la calidad de la fracción bajo un microscopio. NOTA: Todos los pasos del vórtice se realizan a la máxima velocidad, y la calidad de cada fracción debe evaluarse bajo el microscopio (Figura 1).</li>
	<li>Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo en el tubo F2 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 2 min.</li>
	<li>Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F3 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 2 min.</li>
	<li>Repita la incubación de EDTA como en el paso 2.6, transfiriendo el tejido en el tubo E2 que contiene 10 mM de EDTA.</li>
	<li>Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 5 min.</li>
	<li>Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F4 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.</li>
	<li>Repita el paso 2.14, transfiriendo el tejido en el tubo F5 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.</li>
	<li>Repita el paso 2.15, transfiriendo el tejido en el tubo F6 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.</li>
	<li>Combine las mejores fracciones filtradas por gravedad a través de un colador celular de 70 μm en un tubo de 50 ml (sobre hielo) para eliminar las vellosidades y los desechos significativos. NOTA: Por lo general, F5 y F6 son las fracciones que contienen numerosas criptas y menos escombros.</li>
	<li>Girar las criptas a 150 x g a 4 °C durante 3 min.</li>
	<li>Vacíe el tubo, interrumpa el pellet mecánicamente y agregue 5 ml de DMEM/F12 frío.</li>
	<li>Coloque 10 μL de la suspensión en una placa de Petri y cuente el número de criptas presentes en la alícuota manualmente bajo un microscopio. NOTA: No cuente células individuales o escombros pequeños.</li>
	<li>Calcule el volumen (V) de suspensión de criptas requerida en μL, considerando que 300 criptas están chapadas por pozo, W es el número de pozos y N es el número de criptas contadas de 10 μL de la suspensión. Transfiera las criptas a un nuevo tubo de 15 ml. NOTA: V = 300 x W x 10/N. Si se utiliza un volumen pequeño en el experimento planificado, se puede utilizar un tubo centrífugo de 1,5 ml.</li>
	<li>Girar las criptas a 200 x g a 4 °C durante 3 min.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Interrumpa mecánicamente el pellet y agregue suavemente el medio de cultivo de crecimiento para obtener una concentración de 90 criptas / μL.</li>
	<li>Agregue 2 volúmenes de BMM sin diluir para tener una concentración final de 30 criptas / μL. Pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla. NOTA: Siempre mantenga el tubo sobre hielo para evitar la solidificación de BMM.</li>
	<li>Placa 10 μL de la mezcla criptas/BMM en cada pozo. Para el análisis de citometría de flujo, use placas de fondo redondo de 96 pocillos. Distribuya 10 μL en el centro de cada pozo como una cúpula. Para la obtención de imágenes, utilice μ-slide 8 (consulte la Tabla de materiales) y deposite los 10 μL como una capa delgada. NOTA: Coloque los organoides como una capa delgada para el ensayo de imágenes para permitir su imagen en profundidad.</li>
	<li>Deje la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.</li>
	<li>Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pozo, teniendo cuidado de no desprender el BMM.</li>
	<li>Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Realizar el análisis ROS entre los días 4 y 6 de cultivo. De lo contrario, cambie el medio y divida los organoides después de la aparición de varias y largas estructuras en ciernes y cuando las células muertas se acumulen en los lúmenes de los organoides.</li>
</ol>3. Paseo de organoides
<ol><li>Comience a pasar organoides del intestino delgado a partir del 6º día de cultivo, cuando se hayan formado estructuras en ciernes significativas y los lúmenes de los organoides se hayan oscurecido. NOTA: La luz del organoide se oscurece debido a la acumulación de células muertas, escombros y moco. Evite dejar que los organoides crezcan demasiado antes de dividirse. La relación de división depende del crecimiento de los organoides. Se recomienda pasar los organoides con una proporción de 1:2 en el día 6 y 1:3 en el día 10.</li>
	<li>Llene un tubo de 15 ml con 4 ml de DMEM/F-12 avanzado frío y manténgalo en hielo. NOTA: Aquí, se proporcionan volúmenes para una placa de cultivo de 96 pocillos. Si se utiliza un formato diferente, ajuste el volumen en consecuencia.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente el medio con una pipeta o una bomba de vacío de los pozos sin tocar las cúpulas BMM, y deséchelo.</li>
	<li>Añadir 100 μL de DMEM/F-12 avanzado en frío por pocillo. Pipete hacia arriba y hacia abajo para romper el BMM y transferir el contenido del pozo al tubo de 15 ml.</li>
	<li>Lavar el pozo con 200 μL frío Advanced DMEM/F-12 y recogerlo en el mismo tubo. NOTA: Si pasa varios pozos de la misma condición experimental, el contenido de los pozos se puede agrupar en el mismo tubo colector de 15 ml.</li>
	<li>Gire el tubo colector de 15 ml a 100 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F-12 avanzado frío al pellet. Usando una punta P1000, tome una punta P10 (sin filtro) y binote hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces.</li>
	<li>Añadir 4 ml de DMEM/F-12 avanzado frío al tubo. Girar a 300 x g durante 5 min a 4°C.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante con una pipeta o una bomba de vacío sin molestar el pellet. Luego, interrumpa el pellet mecánicamente.</li>
	<li>Añadir BMM diluido en medio de cultivo de crecimiento (ratio 2:1). Pipete con cuidado hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.</li>
	<li>Placa 10 μL de la mezcla criptas/BMM en cada pozo.</li>
	<li>Mantenga la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.</li>
	<li>Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pozo. NOTA: Tenga cuidado de no separar el BMM.</li>
	<li>Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.</li>
</ol>4. Preparación de reactivos y materiales para evaluar el estrés oxidativo en organoides intestinales
<ol><li>Preparar una solución madre de 250 mM de inhibidor de N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabla de Materiales), resuspend 10 mg con 245 μL de DPBS. Utilizar a 1 mM de concentración final.</li>
	<li>Preparar una solución madre de 50 mM de inductor Tert-butil hidroperóxido (tBHP), 70% en agua, diluir 3.22 μL con 496.8 μL de DPBS. Utilizar a una concentración final de 200 μM.</li>
	<li>Para el estudio de citometría de flujo, prepare una solución de trabajo de 250 μM de una sonda fluorogénica (ver Tabla de materiales) diluyendo la solución madre 1/10 en DMSO. Utilizar a 1 μM de concentración final. NOTA: Como se indica en las instrucciones del fabricante, la sonda fluorogénica es sensible a la luz y al oxígeno. Las acciones y alícuotas no deben estar abiertas y cerrar demasiadas veces.</li>
	<li>Para el estudio de imágenes, prepare una solución de trabajo de 1,25 mM de la sonda fluorogénica diluyendo la solución madre 1/2 en DMSO. Utilizar a una concentración final de 5 μM.</li>
	<li>Preparar una solución final de 0,1 μg/ml DAPI en DPBS, que se utilizará para la discriminación de células muertas en el ensayo de citometría de flujo.</li>
	<li>Diluir Hoechst 33342 a 1,25 mg/ml en DPBS. Utilizar a una concentración final de 5 μg/ml para ser utilizado para la tinción nuclear en el ensayo de imagen.</li>
	<li>DMEM caliente sin rojo fenol a 37 °C. NOTA: Estos pasos describen el uso de controles negativos y positivos que deben incluirse en cualquier ensayo, utilizando las condiciones indicadas en la Figura 2A. El ensayo se puede utilizar para probar compuestos antioxidantes o prooxidantes. Los pasos son los mismos, y la única diferencia es cuando se agregan los compuestos antes de usar el tinte fluorogénico.</li>
</ol>5. Visualización del estrés oxidativo en organoides 3D mediante microscopía confocal
<ol><li>Tome los organoides chapados en las cámaras de pozos μ-Slide 8 y agregue 1 μL de solución madre de NAC en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 1 mM.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mM de la sonda fluorogénica para obtener una concentración final de 5 μM.</li>
	<li>Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mg/ml de Hoescht para obtener una concentración final de 5 μg/ml.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Retire el medio sin molestar al BMM. Suavemente, agregue 250μL de DMEM caliente sin rojo fenol. NOTA: Si se planea una adquisición a largo plazo, agregue compuestos de factores de crecimiento a DMEM sin rojo fenol.</li>
	<li>Tome una imagen de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica (ROS). NOTA: La excitación/emisión (ex/em) para la sonda fluorogénica es 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) es 361/486, y ex/em para GFP (célula madre intestinal de los ratones Lgr5-GFP) es 488/510. Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite 63x para detectar señales en células madre. No cambie la configuración del láser entre muestras. Se podría utilizar un objetivo 20x para permitir una visión general de la producción de ROS.</li>
	<li>Utilice el control positivo para configurar la intensidad del láser y la exposición temporal para la señal ROS y compruebe que esta señal es menor en el control negativo.</li>
	<li>Usando el ocular, la diapositiva para identificar los organoides GFP que expresan y ajustan la intensidad del láser. NOTA: Este paso se realiza manualmente.</li>
	<li>Definir posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide. Configure una pila z de 25 μm (tamaño de paso 5 μm) para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células. NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración. Usando células vivas, la adquisición debe hacerse dentro de 1 h después del final de la incubación.</li>
	<li>Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes de código abierto (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Vaya a través de la pila z y elija la sección en la que el centro de los organoides está bien representado y cree una nueva imagen con el área seleccionada.</li>
	<li>Cuantifique las imágenes según los pasos 5.15.1 - 5.15.5.<ol>
<li>Seleccione la herramienta de línea a mano alzada.</li>
		<li>Dibuja una línea siguiendo los núcleos. NOTA: Seleccione solo las regiones que presentan células GFP positivas si solo se analizan las células madre.</li>
		<li>Aumente el ancho de la línea para cubrir la capa de celda con la línea sin incluir los desechos luminales.</li>
		<li>Seleccione el canal para la señal ROS y mida la intensidad de fluorescencia en la región seleccionada y anote los valores.</li>
		<li>Dibuja una línea donde no haya señal y mide la intensidad fluorescente del fondo que se restará al valor anterior para obtener la intensidad final.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cuantificación del estrés oxidativo sobre los organoides disociados utilizando citómetro de flujo
<ol><li>Añadir 1 μL de solución madre de NAC en los pocillos para controles negativos para obtener una concentración final de 1 mM. NOTA: Use los organoides chapados en las placas de fondo redondo de 96 pocillos.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Con una pipeta multicanal, retire el medio sin molestar el BMM conectado y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos. Mantenga este plato a un lado.</li>
	<li>Agregue 100 μL de tripsina, y con una pipeta multicanal, binote hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para destruir el BMM.</li>
	<li>Incubar durante no más de 5 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
	<li>Con una pipeta multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para disociar los organoides.</li>
	<li>Girar a 300 x g durante 5 min en RT.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Vuelva a agregar el medio recolectado en el paso 6.3 a los pozos correspondientes y vuelva a suspender las celdas canalizando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.</li>
	<li>Añadir la sonda fluorogénica a la concentración final de 1 μM. Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 250 μM e incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2. NOTA: No agregue la sonda fluorogénica a los pocillos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B).</li>
	<li>Girar a 300 x g durante 5 min en RT.</li>
	<li>Resuspendir las células con 250 μL de solución DAPI de 0,1 μg/ml. Transfiera las muestras en los tubos de citometría de flujo adecuados, mantenga los tubos en hielo y proceda con el análisis. NOTA: Agregue PBS en lugar de DAPI a los pozos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B).</li>
	<li>Optimice la configuración de voltaje de dispersión hacia adelante y lateral en el control no manchado y los voltajes láser para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.</li>
	<li>Utilizando una estrategia de cierre adecuada (Figura 4A), recopile un mínimo de 20.000 eventos. NOTA: Se prefieren 50.000 eventos. Los ajustes detallados de adquisición varían según el instrumento utilizado.</li>
</ol>

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<li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li>
<li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).</li>
<li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para aislar criptas yeyunales murinas, cultivarlas en organoides 3D y analizar ROS en organoides mediante la combinación de una sonda fluorogénica sensible a ROS con imágenes de microscopía cualitativa de organoides completos y medición cuantitativa de ROS utilizando citometría de flujo en células individuales después de la disociación organoide.
El primer paso crítico en este método es el procedimiento de extracción de criptas. De hecho, la ca...

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo celular. También pueden ser producidos activamente por complejos enzimáticos especializados como las NADPH-Oxidasas (NOX) y las Oxidasas Duales (DUOX) unidas a la membrana, que generan anión superóxido y peróxido de hidrógeno1. Al expresar enzimas antioxidantes y eliminadores de ROS, las células pueden ajustar finamente su equilibrio redox, protegiendo así la homeostasis tisular2. Aunque las ROS pueden ser altamente tóxicas para las células y dañar el ADN, las proteínas y los lípidos, son moléculas de señalización cruciales2. En el epitelio intestinal, se requieren niveles moderados de ROS para la proliferación de células madre y progenitoras3; los niveles altos de ROS conducen a su apoptosis4. El estrés oxidativo crónico está relacionado con muchas enfermedades gastrointestinales, como las enfermedades inflamatorias intestinales o el cáncer. Como ejemplo, en un modelo de ratón de cáncer intestinal impulsado por Wnt, se encontró que la producción elevada de ROS a través de la activación de NADPH-oxidasas era necesaria para la hiperproliferación de las células cancerosas5,6. Definir cómo las células intestinales, en particular las células madre, las células madre gestionan el estrés oxidativo y cómo el entorno celular puede afectar a esta capacidad es esencial para comprender mejor la etiología de esta enfermedad7.
En un tejido, diferentes tipos de células presentan un estado oxidativo basal que puede variar según su función y metabolismo y la expresión de niveles variables de moléculas oxidantes y antioxidantes4,7. El monitoreo de ROS in vivo es muy desafiante. Se han desarrollado colorantes permeables a las células que emiten fluorescencia de acuerdo con su estado redox para visualizar y medir las ROS celulares en células vivas y animales. Sin embargo, su eficacia depende de su difusión en el interior de los tejidos vivos y de su rápida lectura, lo que dificulta su uso en modelos animales8.
En el pasado, el estudio del efecto de los compuestos en la generación de ROS se realizaba utilizando líneas celulares, pero esto puede no reflejar la situación in vivo . El modelo organoide intestinal, desarrollado por el grupo de Clevers9, permite el crecimiento de células primarias intestinales ex vivo. El cultivo de criptas intestinales en matrices, en presencia de factores de crecimiento definidos, conduce a estructuras tridimensionales, llamadas organoides (mini-intestino), que reproducen la organización cripta-vellosidad, con células de los diferentes linajes epiteliales que recubren una luz interna, y las células madre intestinales que residen en pequeñas protuberancias similares a criptas.
Aquí, aprovechando este modelo, se describe un método simple para estudiar el estrés oxidativo en células intestinales primarias a la resolución de una sola célula mediante la adición de un tinte sensible a ROS disponible comercialmente en el medio de cultivo de organoides.
Los lectores de placas se utilizan a menudo para detectar la producción de ROS en una población total. Este protocolo utiliza citometría de flujo o ensayo de imágenes para detectar ROS en un tipo de célula en particular con células modificadas genéticamente o tinción de anticuerpos específicos. Este trabajo involucra el cultivo de organoides intestinales de ratón y la visualización de ROS por imágenes confocales y la cuantificación por citometría de flujo. Utilizando organoides del intestino delgado derivados de ratones Lgr5-GFP, es posible analizar específicamente el nivel de estrés oxidativo en las células madre intestinales en diferentes tratamientos. Este protocolo se puede adaptar para probar la influencia de moléculas exógenas, como el muramilo-dipéptido derivado de la microbiota (MDP)10, en el equilibrio de las ROS, después de estimular los organoides con los compuestos seleccionados.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Ratones</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, sin vitamina A</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td>Concentración de existencias: 50x</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050038</td> concentración de <td>existencias: 100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ThermoFisher</td><td>15630056</td><td>concentración de existencias: 1 m</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>R& D</td><td>2028-EG-200 Concentración de</td><td>existencias: 500 y micro; g/mL en PBS</td></tr><tr><td>murine Noggin</td><td>R& D</td><td>1967-NG/CF Concentración de</td><td>existencias: 100 y micro; g/mL en PBS</td></tr><tr><td>Murine R-spondin1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050 Concentración de</td><td>existencias: 50 y micro; g/mL en PBS</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td>Concentración de Stock: 100x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Concentración de Stock: 100x (10,000 unidades/mL de penicilina y 10,000 &micro; g/mL de estreptomicina)</td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 y micro; m colador de células</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Fondo redondo de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>tijera de punta esférica</td><td>Fine Science Tools GMBH</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>CellROX&reg; Reactivo</td><td>rojo intenso ThermoFisher</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-ph&eacute; nylindol, diclorhidrato) (sonda fluorgénica)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>stock a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS 1x sin calcio ni magnesio (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FLuoroBrite DMEM (DMEM sin rojo fenol)</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>stock a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Matrigel Factor de Crecimiento Reducido, Libre de Rojo de Fenol (Matriz de Membrana Basal )</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>una vez recibido descongelar o/n en la nevera, mantener durante 1h en hielo y, hacer 500 mL alícuotas y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Cámaras de pocillos</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>terc-butil hidroperóxido (tBCHP)solución (70% wt. En H2O2)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sin rojo de fenol (tripsina)</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Inhibidor de rocas para minimizar la muerte celular por disociación de tejidos</td></tr><tr><td><Programas y equipos > fuertes</td>Attune NxT (citómetro de flujo)ThermoFischer Analizador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>citómetros de flujo</td>Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads generación de imágenes FlowJo BD Bioscience FACS analysis Observer.Z1 Sistema confocal Zeiss Opterra (confocal de campo barrido)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sistema confocal</td> <td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>de alta velocidad EMCCD Camera Evolve Delta 512</td> Sistema <td>confocal</td><td>fotométrico</td><td></td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>análisis estadístico</td></tr></tbody></table>

análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en la homeostasis intestinal. Las ROS son subproductos naturales del metabolismo celular. Se producen en respuesta a una infección o lesión a nivel de la mucosa, ya que están involucrados en las respuestas antimicrobianas y la cicatrización de heridas. También son mensajeros secundarios críticos, que regulan varias vías, incluido el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, los niveles excesivos de ROS conducen al estrés oxidativo, que puede ser perjudicial para las células y favorecer enfermedades intestinales como la inflamación crónica o el cáncer. Este trabajo proporciona un método sencillo para detectar ROS en los organoides murinos intestinales mediante imágenes en vivo y citometría de flujo, utilizando una sonda fluorogénica disponible comercialmente. Aquí el protocolo describe el ensayo del efecto de los compuestos que modulan el equilibrio redox en organoides intestinales y detectan los niveles de ROS en tipos específicos de células intestinales, ejemplificado aquí por el análisis de las células madre intestinales genéticamente marcadas con GFP. Este protocolo se puede utilizar con otras sondas fluorescentes.

Como prueba de concepto del protocolo descrito, se utilizaron las criptas obtenidas de la línea de ratones Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 en la que las células madre intestinales muestran expresión GFP en mosaico, que fue establecida por Barker et al., para caracterizar inicialmente las células madre intestinales10 y permitir mapear estas células en función de su expresión GFP. De este modo, se proporciona un modelo para comparar los niveles de ROS en una población de tipo celular específico en diferentes...

El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.

Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Este método es una herramienta valiosa en el campo de la biología celular para evaluar los niveles de ROS celulares en células primarias vivas cultivadas in vitro como organoides utilizando una sonda fluorogénica. La principal ventaja de esta técnica es que las ROS pueden visualizarse cualitativamente en organoides intestinales intactos mediante microscopía y analizarse cuantitativamente en células disociadas mediante citometría de flujo utilizando placas de 96 pocillos. Este método se puede aplicar a otros modelos organoides y se pueden usar sensores fluorescentes alternativos para analizar diferentes vías celulares.Antes de aplicar este protocolo por primera vez, el experimentador debe familiarizarse con el cultivo de organoides y el pasaje. Aunque nuestro protocolo está bien adaptado a los enfoques de detección, los principiantes deben comenzar con algunas muestras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sophie Dulauroy, ingeniera del laboratorio.Después de sacrificar un ratón Lgr5-GFP de 8 a 10 semanas de edad, recolecte de cinco a ocho centímetros de la región que abarca el yeyuno entre el duodeno y el íleon, y colóquelo en DPBS frío suplementado con antibióticos en hielo. A continuación, limpie el contenido intestinal enjuagando con cinco a 10 mililitros de DPBS frío que contenga antibióticos. Luego, usando tijeras de punta de bola, abra el intestino longitudinalmente y, con fórceps, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS frío con antibióticos.Agite el pañuelo dentro del plato para enjuagarlo. A continuación, agarre el intestino por aspiración con una pipeta Pasteur de plástico y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de EDTA frío de 10 milimolares. Invierta el tubo tres veces e incube en hielo durante 10 minutos.Después de la incubación, transfiera el tejido en un tubo que contenga 10 mililitros de DPBS y vórtice durante dos minutos. Agregue inmediatamente 10 microlitros de la fracción en una placa de Petri y use un microscopio para evaluar la calidad de la fracción. Después de dos transferencias en DPBS que contienen tubos con vórtice de dos minutos entre cada transferencia, incube el intestino en EDTA en hielo durante cinco minutos como se demostró anteriormente.Después de tres transferencias sucesivas en tubos que contienen DPBS con vórtice de tres minutos entre cada transferencia, combine las mejores fracciones en un tubo de 50 mililitros invirtiendo los tubos seleccionados tres veces y filtrando a través de un colador de células de 70 micras. Luego gire las criptas, deseche el sobrenadante e interrumpa el pellet mecánicamente antes de agregar cinco mililitros de DMEM F12 frío. Cuente el número de criptas presentes en una alícuota de 10 microlitros manualmente bajo un microscopio.Después de contar, gire las criptas nuevamente y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego, interrumpa mecánicamente el pellet y agregue un medio de cultivo de crecimiento al tubo para obtener una concentración de 90 criptas por microlitro. A continuación, agregue dos volúmenes de matriz de membrana basal sin diluir o BMM para obtener una concentración final de 30 criptas por microlitro y pipetee cuidadosamente la suspensión hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.Para el análisis de citometría de flujo, los microlitros de placa 10 de las criptas BMM se mezclan como una cúpula en el centro de cada pozo de una placa de fondo redondo precalentado de 96 pocillos. Y para la obtención de imágenes, deposite 10 microlitros de la mezcla como una capa delgada en una cámara de ocho pocillos de microslídidos precalentados. Después de permitir que el BMM se solidifique a temperatura ambiente durante cinco minutos, coloque las placas en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Después de 15 minutos, agregue 250 microlitros de medio de crecimiento en cada pozo, teniendo cuidado de no separar el BMM, y coloque la placa en la incubadora. Para visualizar el estrés oxidativo por microscopía confocal, agregue un microlitro de solución madre de n-acetilcisteína en los pocillos correspondientes de la cámara de ocho pocillos del microslídeo chapado con organoides. Después de una incubación de una hora, agregue un microlitro de solución madre de hidroperóxido de terc-butilo en los pozos correspondientes e incube durante otros 30 minutos.A continuación, agregue un microlitro de la dilución de 1,25 milimolares de la sonda fluorogénica por pozo, seguido de un microlitro de 1,25 miligramos por mililitro de solución de Hoechst. Después de otra incubación de 30 minutos, retire el medio sin molestar el BMM y agregue suavemente 250 microlitros de DMEM caliente sin rojo fenol. Tome una imagen de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica.Usando el control positivo, configure la intensidad del láser y la exposición de tiempo para la señal ROS, y verifique que esta señal sea menor en el control negativo. A continuación, utilizando un ocular, revise la diapositiva para identificar los organoides que expresan GFP y ajustar la intensidad del láser. Configure una pila Z de 25 micrómetros y defina posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células.Agregue un microlitro de la solución madre de n-acetilcisteína en los pozos de control negativos de la placa inferior redonda de 96 pocillos que contiene los organoides. Después de una incubación de una hora, agregue una solución madre de hidroperóxido de terc-butilo de microlitros en los pozos correspondientes e incube durante 30 minutos. Luego, con una pipeta multicanal, retire el medio sin molestar el BMM conectado y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos.Mantenga este plato a un lado. A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina y use una pipeta multicanal, pipeta hacia arriba y hacia abajo cinco veces para destruir el BMM. Después de una breve incubación de cinco minutos, disocie los organoides mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo por segunda vez.Gire la placa y deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Agregue el medio previamente recolectado en otra placa de 96 pocillos a los pozos correspondientes y vuelva a suspender las celdas canalizando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. A continuación, agregue un microlitro de la sonda fluorogénica e incube durante 30 minutos.Luego gire la placa nuevamente y vuelva a suspender las células con 250 microlitros de solución DAPI. Transfiera las muestras en tubos de citometría de flujo y mantenga los tubos en hielo. Optimice la configuración de voltaje de dispersión hacia adelante y lateral en el control no manchado y los voltajes láser para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.Luego, utilizando una estrategia de cierre adecuada, recopile un mínimo de 20, 000 eventos. Las imágenes confocales representativas de la tinción de ROS y los organoides mostraron que en presencia del inhibidor de NAC, solo es visible la señal de las células muertas contenidas en la luz del organoide. En el organoide no tratado, se pueden ver los niveles basales de ROS, particularmente en células GFP positivas, lo que demuestra que las células madre producen ROS más altas que las células diferenciadas.Las células GFP positivas presentan una señal citoplasmática más significativa con el inductor en presencia de la sonda fluorogénica, lo que demuestra que los niveles de ROS aumentan particularmente en las células madre después del tratamiento. El análisis de citometría de flujo de la producción de ROS en los organoides intestinales muestra que los niveles basales de ROS disminuyen después de la estimulación con el inhibidor y aumentan después del desafío con el inductor. Las células pretratadas con inhibidor y luego estimuladas con inductor presentan niveles más bajos que las estimuladas con inductor solo.Un análisis similar en células madre cerradas como GFP positivas muestra una disminución de 3,5 veces en el nivel de ROS en el tratamiento con inhibidores y un aumento de cuatro veces en el tratamiento con inductores sobre las células no estimuladas. Al intentar este procedimiento, los usuarios deben recordar limitar el estrés celular durante la manipulación y disociación de organoides. Además, siempre se deben incluir controles positivos y negativos al analizar ros.Después de este procedimiento, el análisis se puede complementar con tinción de inmunofluorescencia en organoides intactos fijos, clasificación celular y análisis de expresión génica para obtener información adicional sobre la regulación de ROS. Después de ver este video, debe saber cómo cultivar organoides intestinales murinos, realizar análisis de imágenes en vivo de organoides intactos y procesar órganos intestinales para el análisis de citometría de flujo.

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Investigación

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Biología

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Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno (Video) | JoVE Journal

Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

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