Uso de cambios en la transmisión de hojas para investigar el movimiento de cloroplastos en Arabidopsis thaliana
14 de julio de 2021
Muchas especies de plantas cambian el posicionamiento de los cloroplastos para optimizar la absorción de la luz. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para investigar el movimiento del cloroplasto en las hojas de Arabidopsis thaliana utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como proxy.
Este método mide los cambios en la transmisión de la luz de las hojas como un sustituto del movimiento del cloroplasto que influye en la absorción de la luz de las hojas en diferentes grados dependiendo de la especie, el medio ambiente y las mutaciones. Este dispositivo asequible construido en casa permite cuantificar los cambios dinámicos en el movimiento del cloroplasto de una manera sencilla y semiautomatizada. Los datos complementan los estudios de microscopía.
Es importante seguir de cerca las instrucciones y tratar el instrumento con cuidado. Para comenzar, conecte el dispositivo de transmisión a una fuente de alimentación estable y presione el interruptor de encendido del dispositivo para restablecer el instrumento. A continuación, conecte el iPad a una fuente de alimentación estable.
Presione el botón de la pantalla de inicio para activar la pantalla e ingrese el código de acceso para iniciar sesión. Pulse el icono de configuración, seguido del icono de visualización y brillo. A continuación, presione el bloqueo automático y seleccione nunca para asegurarse de que la pantalla permanezca encendida permanentemente para que el programa se ejecute sin ninguna interrupción.
Luego presione el botón de la pantalla de inicio para volver a la pantalla principal. Después de cerrar todas las aplicaciones, busque y abra la aplicación LeafSensor e ingrese la información en la pantalla verde que muestra texto y campos blancos. Asegúrese de que la palabra conectado se vea en la parte inferior de la pantalla, lo que indica que la aplicación se está comunicando con el dispositivo de transmisión.
Si aparece el mensaje Adafruit NOT Found, verifique que el dispositivo esté enchufado y presione el botón de inicio en el dispositivo nuevamente. Rellene los primeros cuatro campos de la página de la aplicación para configurar las condiciones para una breve ejecución de prueba con clips de hoja abiertos sin hojas. Comience nombrando el experimento en el campo llamado nombre del experimento, luego elija cuántas intensidades de luz azul diferentes se usarán en el experimento escribiendo el número en el campo llamado número de intensidades de luz, luego escriba las intensidades de luz azul que se utilizarán seleccionando un entero entre 0 y 3, 000 y separe cada intensidad de la siguiente con una coma en el campo llamado intensidades azules.
Escriba el período de tiempo para cada intensidad de luz azul en el campo denominado duración azul. Presione Iniciar experimento en la sección central de la pantalla. En la parte inferior de la pantalla, aparecerán ocho guiones con el mensaje Iniciar experimento.
Deje que el experimento se ejecute hasta que aparezcan los primeros datos. Después de asegurarse de que no se emita luz desde el LED durante los primeros dos minutos, observe la emisión de luz azul débil durante dos minutos y luego la emisión de luz azul fuerte durante otros dos minutos. También observe la luz roja intensa que emite brevemente desde el LED una vez por minuto a lo largo de esta secuencia.
Compruebe el estado Experimento finalizado indicado por el mensaje Experimento finalizado en la parte inferior izquierda de la página de la aplicación y, a continuación, pulse el botón de la pantalla de inicio dos veces. Desliza el dedo hacia fuera de la aplicación y ábrela de nuevo. Reinicie el instrumento presionando el botón de encendido / apagado para preparar el instrumento para una carrera con hojas.
En la oscuridad, usando solo una luz blanca o verde muy baja, elija una hoja ancha de la planta adaptada a la oscuridad para cubrir el LED. Prepare la tira de papel de filtro de aproximadamente la longitud de un clip de hoja. Luego perfore un agujero en la parte superior de la tira de papel de filtro para evitar que cubra el LED.
Coloque un papel de filtro humedecido en la parte del clip de hoja que contiene el LED. Retire el clip de hoja adaptado a la oscuridad de la placa de Petri y luego coloque la hoja en la parte superior del papel de filtro húmedo de su clip de hoja, asegurándose de que la superficie de la hoja adaxial esté orientada hacia el LED. Luego coloque la otra parte del clip de hoja con un transistor fotográfico en la parte superior.
Si es necesario, use una banda elástica para mantener unidas dos partes del clip de hojas. Coloque el clip de hojas en el bote respectivo y, utilizando una pipeta, llene los depósitos con agua, asegurándose de que la hoja o al menos el papel de filtro toque el agua para evitar la deshidratación de las hojas durante la carrera. Configure la aplicación LeafSensor en el iPad y escriba EXPLORA1 en el campo denominado nombre del experimento.
Escriba 10 en el campo denominado número de intensidades de luz. Luego ingrese los números en el campo llamado intensidades azules y duración azul. Presione Iniciar experimento.
Después del primer minuto, observe los valores de salida aparecidos. Si los valores están lejos, compruebe si las hojas se colocaron correctamente en los clips de las hojas. Cuando se complete la ejecución, los datos se guardarán automáticamente.
Después de girar la pantalla en posición vertical, aparecerán en la pantalla dos opciones, guardar y utilidades. Presione Utilidades y luego en la lista de los archivos guardados, seleccione el archivo EXPLORA1. Debajo de la lista de archivos, EXPLORA1 aparecerá ahora en el experimento seleccionado.
A continuación, presione Correo electrónico. Ingrese una dirección de correo electrónico y el archivo EXPLORA1 se adjuntará automáticamente al mensaje y luego presione Enviar. Los datos porcentuales de transmisión se trazaron contra el tiempo, lo que muestra que la transmisión de Arabidopsis thaliana disminuyó a bajas intensidades de luz, mientras que se indujo una respuesta de evitación cuando las intensidades de luz aumentaron aún más.
Se muestran los valores porcentuales promedio de transmisión de las hojas de Arabidopsis thaliana de tipo salvaje y mutante durante tiradas de 19 horas de duración. Cuando las hojas fueron expuestas a poca luz azul tanto en mutantes de tipo salvaje como en mutantes phot2, la rápida disminución inicial en la transmisión fue seguida por una disminución lenta, lo que indica que los cloroplastos se estaban moviendo hacia la respuesta de acumulación. En comparación con el tipo salvaje, phot1 mostró una respuesta de acumulación reducida.
Cuando la intensidad de la luz azul aumenta gradualmente después de 11 horas, el porcentaje de transmisión aumenta y los cloroplastos se mueven hacia la respuesta de evitación. Los grados de cambio en el porcentaje de transmisión en relación con el valor oscuro, también llamado Delta T, dependían de las intensidades exactas de la luz azul. Los valores negativos indican que las hojas mostraron una respuesta de acumulación, mientras que los valores positivos indican una respuesta de evitación.
La velocidad de cambio en la transmisión se calcula como la pendiente del cambio en la transmisión cuando se aumenta la luz. En el ejemplo representativo, la velocidad de transmisión cambió durante las respuestas iniciales cuando se activó la evitación a medida que aumentaba la intensidad de la luz azul. Al investigar los cambios de transmisión en un mutante o especie no caracterizada, confirme cómo los valores de transmisión y las posiciones del cloroplasto se correlacionan con un estudio de microscopía.
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Resumen
Este protocolo describe un método para investigar el movimiento de cloroplastos en hojas de Arabidopsis thaliana mediante la medición de cambios en la transmisión de luz. El instrumento construido en el laboratorio permite la cuantificación semiautomatizada de la dinámica de cloroplastos, complementando los estudios de microscopía.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Movimiento de cloroplastos
- Optimización de la absorción de luz
Antecedentes
- La posición de los cloroplastos afecta la absorción de luz en las plantas.
- Diferentes especies y factores ambientales influyen en el movimiento de los cloroplastos.
- Comprender la dinámica de los cloroplastos es fundamental para la fisiología vegetal.
- Este método proporciona una solución rentable para los investigadores.
Objetivo del estudio
- Cuantificar el movimiento de los cloroplastos en respuesta a la luz.
- Proporcionar un método sencillo para los investigadores.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de adaptación de las plantas.
Métodos Utilizados
- Medición de la transmisión de luz a través de hojas.
- Uso de un dispositivo construido en casa para la recopilación de datos.
- Conexión a fuentes de energía estables para su funcionamiento.
- Seguir instrucciones específicas para obtener resultados precisos.
Resultados Principales
- Se cuantificaron los cambios dinámicos en el movimiento de los cloroplastos.
- El método resultó efectivo en diversas condiciones.
- Los resultados complementaron estudios previos de microscopía.
- El cuidado del instrumento es esencial para obtener datos confiables.
Conclusiones
- El método es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de los cloroplastos.
- Permite realizar investigaciones semiautomatizadas y asequibles.
- Estudios futuros pueden ampliar los hallazgos relacionados con la absorción de luz.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo proporciona un método semiautomatizado y rentable para cuantificar el movimiento de cloroplastos en hojas de plantas mediante la medición de cambios en la transmisión de luz. Permite el cribado de alto rendimiento de mutantes y respuestas ambientales que afectan la eficiencia fotosintética, apoyando la validación temprana de objetivos en sistemas de bioproducción basados en plantas. El enfoque complementa la microscopía al proporcionar datos cuantitativos y dinámicos adecuados para la reducción de riesgos mecanicistas en la ingeniería de rutas fotosintéticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis fotosintéticas mediante la correlación de cambios en la transmisión con la posición de los cloroplastos bajo condiciones variables de luz.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de genes implicados en cascadas de señalización desde la percepción de la luz hasta el movimiento en Arabidopsis thaliana.
- Valor predictivo: Cuantifica las respuestas de acumulación y evitación mediante métricas Delta T, facilitando el cribado fenotípico de mutantes fotosintéticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera datos cuantitativos estandarizados de transmisión a través de múltiples intensidades de luz azul para una evaluación fenotípica reproducible.
- Escalabilidad: El instrumento construido en el laboratorio permite la prueba paralela de muestras de hojas bajo regímenes de luz controlados, aumentando el rendimiento del cribado.
- Reutilización de la plataforma: Permite el monitoreo continuo de la dinámica de cloroplastos en respuesta a perturbaciones químicas o ambientales durante ensayos prolongados.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona los mecanismos de percepción de la luz con la reubicación funcional de los cloroplastos, aportando información para modelos predictivos de eficiencia fotosintética.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite el análisis de los fenotipos de mutantes phot1 y phot2 para aclarar los roles de sus componentes en las vías de transducción de señales.
- Sistema con Relevancia Patológica: Proporciona un sistema escalable para estudiar el comportamiento de los cloroplastos en condiciones de estrés relevantes para el rendimiento de cultivos y la producción de biomasa.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la selección fenotípica, particularmente para rasgos relacionados con la utilización de la luz y la aptitud fotosintética en sistemas de andamiaje vegetal.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis sobre los mecanismos de movimiento del cloroplasto mediante la cuantificación de cambios en la transmisión en respuesta a incrementos graduales de luz.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles (porcentaje de transmisión, Delta T, velocidad de transmisión) que permiten comparaciones entre genotipos y condiciones de tratamiento.
- Análisis: Ofrece cálculos de velocidad de transmisión y Delta T basados en pendientes para cuantificar respuestas dinámicas y apoyar el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona mutantes moleculares con resultados funcionales en la fotosíntesis, facilitando el avance ajustado al riesgo en la optimización de cepas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios longitudinales de la dinámica del cloroplasto bajo exposiciones ambientales o químicas variables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la señalización fotosintética al proporcionar indicadores cuantitativos y dinámicos para la localización del cloroplasto.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante el registro de datos semiautomatizado y el funcionamiento estable del instrumento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de cepas al vincular perturbaciones genéticas con fenotipos fotosintéticos medibles.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos fotosintéticos basada en perfiles cuantificados de respuestas de evitación y acumulación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fisiología vegetal y mecanismos fotosintéticos para interpretar los cambios de transmisión en un contexto biológico.
- Depende de fuentes de energía estables y de la conectividad funcional entre la aplicación iPad-LeafSensor para la adquisición continua de datos.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de hojas y adaptación a la oscuridad para garantizar la comparabilidad de las mediciones base entre experimentos.
- Implica un manejo cuidadoso del dispositivo casero de transmisión para mantener la precisión del sensor y la consistencia del LED.
- Se limita a cambios relativos de transmisión; la determinación de la posición absoluta de los cloroplastos requiere microscopía complementaria para su validación.
