Clasificación celular activada por fluorescencia-tejido tratado con radioligando (FACS-RTT) para determinar el origen celular de la señal radiactiva

Este protocolo es complementario a la imagen in vivo. Permite cuantificar el tipo de célula y el nivel celular de los radiotrazadores, que es una escala diferente a la obtenida in vivo. La principal ventaja de esta técnica es su sensibilidad y la resolución celular dada por el uso de radioligandos y la clasificación celular.

Encienda la cámara y cargue el software operativo. Haga clic en el botón Inicio XYZ escenario para realizar la orientación. Configure el experimento compuesto por una adquisición de escaneo de 10 minutos.

Establezca el modo Step en Fine y el modo Acquisition en Listmode para registrar todo el espectro de emisión. Configure la cama y asegúrese de que el sistema de calentamiento, el sensor de respiración y la anestesia sean funcionales y seguros. Luego, coloque un fantasma donde se colocará la cabeza del animal.

Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores para las tres dimensiones con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que el volumen de escaneo del fantasma y el animal sea el mismo. Inicie el escaneo fantasma para su posterior calibración con los parámetros previamente establecidos.

Asegurarse de trabajar en un entorno apropiado, autorizado para experimentos que involucren radiactividad. Incubar 100 microgramos de precursor de tributilina en 100 microlitros de ácido acético con yoduro de sodio y cinco microlitros de ácido paracético al 37% a 70 grados centígrados durante 20 minutos en un termociclador colocado en una guantera. Diluir la reacción utilizando 50% de acetonitrilo en agua para alcanzar un volumen de 500 microlitros.

Inyecte los 500 microlitros de la reacción diluida en una columna de fase inversa. Aísle el CLINDE con un HPLC de gradiente lineal de 5 a 95% ACN en ácido fosfórico siete milimolares durante 10 minutos. Diluya el aislado en agua para alcanzar un volumen final de 10 mililitros y luego inyecte la reacción diluida en una columna de concentración.

Eluya el CLINDE de la columna con 300 microlitros de etanol absoluto y luego evapore el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío a temperatura ambiente durante 40 minutos. Diluya el residuo que contiene el CLINDE en 300 microlitros de solución salina para crear una solución madre. Después de medir su radiactividad, diluir la solución madre en solución salina para obtener una solución de 0.037 megabecquerel en 500 microlitros.

Establecer las curvas de calibración con compuestos de referencia fríos y resolver la ecuación de regresión lineal:Y igual a AX más B para obtener coeficientes A y B. X representa la masa del compuesto frío, e Y representa el área bajo las curvas. Compruebe el área bajo la curva del radioligando, midiendo la absorbancia ultravioleta a 450 nanómetros en función de la curva de calibración y el área bajo la curva del radioligando.

Estimar la masa y medir la actividad del radioligando. Asegurar que la actividad específica sea superior a 1.000 gigabecquerel por micromol. Haga clic en el botón Actualizar imagen para actualizar la posición del animal.

Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla para las tres dimensiones. Configure el experimento en un escaneo de 60 minutos que constituye 60 cuadros de un minuto. Reutilice todos los demás parámetros configurados inicialmente.

Inyecte 500 microlitros del radiotrazador radiactivo y luego enjuague el tubo con 300 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Simultáneamente, haga clic en Iniciar adquisición para iniciar el escaneo. Abra el software de reconstrucción de escaneo y luego abra el conjunto de datos, buscando el archivo de parámetros de nombre de archivo creado en la carpeta del escaneo.

Seleccione el isótopo de interés. Tenga en cuenta que el parámetro de modo de lista permite la selección de varios isótopos en este paso. Establezca los diferentes parámetros de reconstrucción, como el tamaño del vóxel, el número de subconjuntos y las iteraciones como se describe en el manuscrito.

Seleccione el formato de salida como NIFTI y, a continuación, seleccione Iniciar reconstrucción SPECT. Use una espátula de metal plana y una cuchilla de afeitar para diseccionar las regiones de interés del cerebro. Coloque los tejidos en un tubo centrífugo de dos mililitros y pese el tejido obtenido.

Coloque las muestras en un tubo de centrífuga de dos mililitros con un mililitro de HBSS libre de calcio y magnesio y luego centrífuga a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante sin molestar el pellet. Agregue 1, 900 microlitros de mezcla de enzimas y incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados mientras agita los tubos por inversión cada cinco minutos. Añadir 30 microlitros de enzima mezclar dos.

Agitar suavemente con una pipeta de 1.000 microlitros hacia adelante y hacia atrás 30 veces. Luego, incuba la mezcla durante 15 minutos a 37 grados centígrados mientras agitas los tubos por inversión cada cinco minutos. Mezcle suavemente hacia adelante y hacia atrás con una pipeta de 200 microlitros y luego una pipeta de 10 microlitros antes de incubar la mezcla durante 10 minutos a 37 grados Celsius para disociar los tejidos.

Filtre las células con un colador celular de 70 micrómetros y agregue 10 mililitros de HBSS libre de calcio y magnesio. Centrifugar a 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Para el agotamiento de la mielina, vuelva a suspender el pellet con 400 microlitros de tampón de eliminación de mielina y luego agregue 100 microlitros de perlas de eliminación de mielina antes de incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Agregue cinco mililitros de tampón de eliminación de mielina y centrífuga 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agregue 500 microlitros de tampón de eliminación de mielina y coloque los gránulos suspendidos en la columna de campo magnético. Lave la columna con un mililitro de tampón de eliminación de mielina cuatro veces.

Centrifugar a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Vórtice brevemente para disociar las células y añadir cinco microlitros de Fc Block CD32. Añadir 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios de interés e incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando. Vórtice el tubo brevemente, luego agregue 100 microlitros de la mezcla secundaria de anticuerpos e incube durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Agregue un mililitro de tampón de eliminación de mielina y repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y seque los tubos boca abajo en papel blando. Resuspend las células en 250 microlitros de PBS estéril y proceda directamente a la clasificación celular.

La exploración SPECT in vivo de ratas de tipo salvaje mostró una mayor unión de CLINDE en el sitio de la inyección de lipopolisacáridos que en la región contralateral del cerebro. Las muestras ex vivo que se sometieron a fluorescencia activaron células de clasificación de tejido tratado con radioligando, o FACS-RTT, revelaron la presencia de un mayor número de sitios de unión a CLINDE solo en microglia, lo que demuestra que el origen celular de la señal clinde en el lado ipsilateral del cerebro era microglia. El aumento de la proteína translocadora, o unión a TSPO, a los 12 meses en ratas TgF344-AD se restringió a los astrocitos.

En ratas de 24 meses de edad, se observó un aumento en la unión a TSPO debido a alteraciones astrocíticas y microgliales. En ratas TgF344-AD más viejas, los astrocitos estriatales mostraron una densidad disminuida de 5HT2AR en comparación con el tipo salvaje. Se observó una sobreexpresión cortical de TSPO tanto en astrocitos como en microglía de sujetos con EA en comparación con los controles de la misma edad cuando se realizó FACS-RTT en muestras humanas de EA postmortem.

Cuando trabaje con radiactividad, siga las instrucciones de protección por radio y use el equipo de protección personal adecuado. Luego, después del procedimiento, asegúrese de descontaminar el entorno de trabajo. La cuantificación de proteínas y el análisis de expresión génica se pueden realizar fácilmente después de este procedimiento en poblaciones celulares aisladas.