Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis

Se proporciona un protocolo de alto rendimiento para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optimizando los pasos de manejo de líquidos con un dispositivo de succión simple construido con una bomba de vacío. Cientos de muestras de semillas pueden ser esterilizadas superficialmente en un día.

Este protocolo mejora la esterilización de la superficie de las semillas, un paso fundamental en la genómica funcional de la especie modelo Arabidopsisthaliana. Las principales ventajas de esta técnica son la facilidad y el alto rendimiento, lo que permite el procesamiento de cientos de muestras por día. Con algunas modificaciones simples, este método se puede aplicar a muchas otras especies de plantas modelo y no modelo.

Para los usuarios primerizos, preste atención a la temperatura del medio y la velocidad de centrifugación, ya que ambos son críticos para la supervivencia de las semillas. Para comenzar, prepare etanol al 70% agregando etanol técnico al 95% al agua destilada y mezclándolo bien. A continuación, prepare una solución de lejía al 5% agregando cinco mililitros de lejía doméstica a 95 mililitros de agua destilada estéril.

Luego, agregue unas gotas de detergente no iónico a la solución de lejía y mezcle bien. A continuación, prepare Murashige y Skoog medio de fuerza agregando 2.2 gramos de polvo medio de EM que incluye vitaminas y 10 gramos de sacarosa en 800 mililitros de agua destilada. Ajuste el pH del medio a 5.7 usando un hidróxido de potasio molar, luego lleve el volumen a un litro usando agua destilada.

Alícuota 500 mililitros del medio en una botella de un litro, y agregue cuatro gramos de agar para preparar un medio sólido. Después del autoclave, deje que el medio se enfríe a 50 a 53 grados Celsius en un baño de agua. Luego viértelo en placas de Petri debajo de la campana de flujo laminar.

Para preparar el medio selectivo, agregue kanamicina al medio y viértalo en placas de Petri como se demostró anteriormente. Para configurar el aspirador, conecte la entrada de la bomba de vacío a un extremo de un tubo de polietileno de un tamaño adecuado. A continuación, conecte el otro extremo del tubo a la salida de la tapa bidireccional de la botella de decantación.

Envuelva la unión del tubo herméticamente con una película de sellado para garantizar una conexión hermética. A continuación, conecte un segundo tubo de polietileno a la entrada del tapón de rosca en la botella de decantación. Luego conecte el otro lado del tubo a la salida de una válvula de acuario equipada con un tubo delgado de polietileno.

Si es necesario, envuelva la unión con la película de sellado para eliminar las fugas de aire. Después de etiquetar dos lotes de 48 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con números progresivos, agregue de 100 a 200 semillas de Arabidopsis a cada uno de los 96 tubos de microcentrífuga estériles, aproximadamente uno o dos milímetros por encima de la parte inferior del extremo cónico del tubo. A continuación, con una pipeta serológica estéril de 10 mililitros, agregue alrededor de un mililitro de etanol al 70% en cada tubo y cierre cuidadosamente las tapas.

Agite los tubos a una frecuencia de oscilación de ocho hercios durante tres minutos en un agitador. Luego retire los adaptadores del agitador y transfiéralos a la canasta de una microcentrífuga de sobremesa para hacer girar las semillas utilizando la función de pulso. Después de transferir los tubos a un bastidor, abra todos los tubos debajo de la campana de flujo laminar.

No toque la parte de las tapas que encaja en los tubos para evitar la contaminación. Luego, debajo de la campana de flujo laminar, coloque una punta amarilla estéril de 200 microlitros en la entrada de la válvula del acuario del aspirador casero y encienda la bomba. Inserte la punta justo por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al succionar el líquido.

A continuación, utilizando una pipeta serológica estéril de 10 mililitros, alícuota un mililitro de solución de lejía al 5% en cada tubo. Cierre las tapas antes de volver a colocar los tubos en los adaptadores del agitador, luego agite los tubos como se demostró anteriormente. Después de girar las semillas utilizando la función de pulso de una centrífuga de sobremesa, coloque una nueva punta amarilla estéril de 200 microlitros en la válvula del acuario y encienda la bomba.

Inserte la punta por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al succionar la solución de lejía. A continuación, utilizando una pipeta serológica estéril de 10 mililitros, alícuota un mililitro de agua esterilizada en cada tubo. Después de colocar una nueva punta amarilla estéril de 200 microlitros en la válvula del acuario, encienda la bomba.

Inserte la punta justo por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al chupar el agua. Finalmente, alícuota 500 microlitros de agua esterilizada en cada tubo y cierre todas las tapas de la campana de flujo laminar. Las semillas ya están listas para ser sembradas.

Si es necesario, mantenga los tubos a temperatura ambiente hasta por unas pocas horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Usando una pipeta de un mililitro, transfiera las semillas con 300 a 400 microlitros de agua estéril a una placa de Petri. Después de transferir 10 tubos, vierta de 1.5 a dos mililitros de Murashige y Skoog medio fundidos de media fuerza sin antibióticos en cada placa.

Gire rápidamente el plato para distribuir las semillas y pegue las placas en lados opuestos. Envuelva las placas en plástico o papel de aluminio, y colóquelas en un refrigerador durante tres días en la oscuridad para obtener una germinación uniforme. Los análisis de germinación realizados en los días dos, tres, cuatro y siete no indicaron diferencias significativas entre 10 a 40 minutos de tiempo de esterilización con etanol al 70%.

Sin embargo, cuando el tiempo de esterilización superó los 40 minutos, las tasas de germinación disminuyeron. En consecuencia, las tasas de emergencia de cotiledón verde también disminuyeron. Según el estudio, se seleccionaron tres minutos para el 70% de etanol y tres minutos para el 5% de lejía como el tiempo mínimo para esterilizar las semillas.

Para demostrar que las semillas utilizadas originalmente estaban contaminadas con microorganismos, se sembraron semillas no estériles directamente en las placas. En comparación con las semillas estériles, las semillas no estériles mostraron una apariencia fúngica después de dos días, que se extendió por todas las placas después de una germinación de siete días. Un ensayo de contaminación cruzada realizado utilizando una sola punta de pipeta estéril para procesar diferentes muestras de semillas mostró que no se observaron cotiledones verdes en las semillas del genotipo Columbia-0 sembradas en placas con kanamicina.

Paralelamente, en las semillas de Columbia-0 sembradas en placas sin kanamicina, todos los cotiledones aparecieron verdes después de la germinación. Estos resultados indican que no hay arrastre de contaminación entre muestras a pesar de usar una sola punta de pipeta para eliminar la solución estéril. Este procedimiento es la base de muchos otros métodos de genómica funcional como la sobreexpresión de genes, la edición del genoma, la localización subcelular, la actividad promotora y las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN.