Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans
20 de noviembre de 2021
En este artículo, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar consistentemente los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Este sistema está destinado a análisis de ensayos de neurodegeneración dopaminérgica utilizando modelos genéticos, químicos y basados en la edad de trastornos neurodegenerativos.
En este video, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C.elegans. Actualmente hay una gran variación en los métodos analíticos para cuantificar la neurodegeneración en gusanos. Además, algunas habilidades existentes se centran solo en los cuerpos celulares y no son sensibles a ciertos tipos y niveles de daño.
El propósito de introducir este sistema de puntuación es proporcionar la capacidad de capturar una imagen completa de la neurodegeneración en todos los niveles de daño, y proporcionar un sistema universal para apoyar la consistencia en toda la investigación de neurodegeneración dopaminérgica de C.elegans. Aquí, demostraremos cómo obtener imágenes de neuronas bajo fluorescencia, asignar puntuaciones a las dendritas de esas neuronas y obtener una vista previa de cómo mostrar e interpretar los resultados. Para cada grupo experimental, pipetee o elija de 20 a 30 gusanos en una plataforma de imágenes compatible con el microscopio de imágenes.
Las plataformas más comunes incluyen almohadillas de agarosa al 2% montadas en portaobjetos de vidrio con un resbalón de cubierta y placas de 96 pozos que contienen volúmenes de pozos iguales o inferiores a 100 microlitros de medio líquido. Permita que los gusanos se paralicen por completo. Esto puede tardar varios minutos.
Cargue la plataforma de imágenes preparada en un microscopio de imágenes capaz de capturar z-stack. Localice la región de la cabeza del gusano primero en un campo brillante, luego bajo una fluorescencia GFP de un solo color utilizando el microscopio de imágenes. El gusano se muestra aquí en un aumento de 400x.
Desplácese por el foco para encontrar límites superiores e inferiores donde las dendritas estén claras. Establezca estos como límites superior e inferior para la captura de imágenes z-stack. Seleccione el tono deseado.
Aquí usamos un micrómetro. Haga clic para capturar imágenes de la pila z en el canal de fluorescencia GFP. Para cada pila z, abra el archivo de imagen utilizando el software de microscopio o un software de análisis de imágenes externo.
Cargue la pila en el software y comprima la pila en una sola imagen aplanada. Alinee las imágenes entre y dentro de los grupos de tratamiento manualmente o utilizando un software de bobinado automático. Trabaje con una imagen de neurona a la vez.
Elija una de las cuatro dendritas CEP para evaluar las ampollas, roturas e irregularidades, incluidas las curvas, torceduras y curvas. Se recomienda puntuar de izquierda a derecha cuando la nariz está en la parte superior de la imagen para garantizar la repetibilidad en la puntuación. Con estas directrices, asigne un valor de puntuación a cada dendrita.
Asigne una puntuación de cero para las dendritas sin daño visible, una puntuación de uno para las dendritas con irregularidades pero sin manchas o roturas, una puntuación de dos para las dendritas con menos de cinco ampollas, una puntuación de tres para entre cinco y 10 ampollas, una puntuación de cuatro para más de 10 ampollas y / o roturas que eliminen hasta el 25% de la dendrita, una puntuación de cinco por rotura eliminando del 25 al 75% de la dendrita, y una puntuación de seis si más del 75% de la dendrita está ausente. Si se cumplen varios criterios dentro de una sola dendrita, considere los criterios correspondientes a la puntuación más alta. Estas imágenes de puntuación representativas que se encuentran en la Figura 1 del artículo asociado con este video pueden usarse como referencia.
Para demostrar la puntuación, repasaremos la asignación de puntuaciones a algunas imágenes de neuronas de ejemplo. Comience con la parte superior más dendrita, no hay manchas visibles, roturas o irregularidades. Asigne una puntuación de cero.
La segunda dendrita tiene alrededor de 14 ampollas y no hay roturas visibles. Asigne una puntuación de cuatro. La tercera dendrita no se puede ver en su totalidad debido a la superposición con la dendrita dos y no se puede puntuar.
La dendrita inferior más tiene alrededor de 11 ampollas y algunos descansos. Asigne una puntuación de cinco. En esta imagen, solo tres dendritas son puntuables, ya que una dendrita no se capturó completamente en la captura de la pila z.
No hay sangrado en las tres dendritas visibles. Así que esto se anotaría de arriba a abajo como un cero, un cero, y debido a la torcedura aquí, un uno. Finalmente, en esta imagen, las cuatro dendritas están más del 75% perdidas.
Todas las dendritas aquí reciben una puntuación de seis. Registra todas las puntuaciones. Las puntuaciones pueden no estar cegadas en este momento.
La plantilla de puntuación utilizada aquí se puede encontrar en los Archivos suplementarios. Divida los recuentos de la puntuación de neurodegeneración por el número total de dendritas puntuadas en el grupo de tratamiento. Presentar los datos como proporción de dendritas dentro del grupo de tratamiento en cada puntuación de neurodegeneración.
Nuestro sistema de puntuación se utilizó para evaluar la neurodegeneración en el estadio larval L4 BY200 C.elegans después de la exposición a rotenona. Los datos se muestran aquí como con las proporciones del número total de dendritas en cada valor de puntuación para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrita puntuada como n 1.
En esta figura, se puede apreciar una respuesta de neurodegeneración dependiente de la dosis a la exposición a la rotenona, y se muestra claramente el desglose específico de la distribución de la puntuación. Estos grupos experimentales fueron estadísticamente diferentes según una prueba de Independencia de Chi cuadrado complementada por una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. En este vídeo, hemos demostrado cómo utilizar la escala de siete puntos desarrollada en nuestro laboratorio para cuantificar los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en C.elegans.
El uso del método de puntuación promueve la consistencia en el análisis y permite la comparación entre los estudios de investigación de neurodegeneración en gusanos. Nuestro sistema de puntuación se puede utilizar para analizar datos derivados de experimentos de C.elegans que utilizan reporteros fluorescentes específicos de la célula, como el gen transportador de dopamina dat-1 que permite la visualización de neuronas dopaminérgicas. Ahora, encuentre un conjunto de imágenes de práctica con comentarios que se puedan usar para entrenar, calibrar y evaluar la consistencia de puntuación de los investigadores nuevos en este método en el material complementario de este artículo.
Descripción general
Este artículo demuestra la implementación de un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar los cambios en la morfología de las dendritas en neuronas dopaminérgicas de C. elegans. El objetivo es estandarizar los análisis de neurodegeneración en diversos ensayos, mejorando la consistencia en el estudio de los trastornos neurodegenerativos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurodegeneración
- Evaluación morfológica
Antecedentes
- Los métodos actuales para evaluar la neurodegeneración en C. elegans varían significativamente.
- Las técnicas existentes suelen centrarse en los cuerpos celulares más que en el daño dendrítico.
- Se necesita un sistema integral de puntuación para obtener una imagen más completa de los efectos neurodegenerativos.
- Este sistema registra la gravedad del daño a múltiples niveles.
Objetivo del estudio
- Establecer un sistema universal de puntuación para analizar los cambios en las dendritas de neuronas dopaminérgicas.
- Permitir evaluaciones consistentes de neurodegeneración en diferentes estudios con C. elegans.
- Permitir a los investigadores comparar resultados entre diversos modelos genéticos y químicos.
Métodos Utilizados
- El estudio utiliza un microscopio de imagen para capturas en z-stacks de imágenes de neuronas.
- C. elegans es el modelo biológico clave, centrándose en las morfologías de neuronas dopaminérgicas.
- Las puntuaciones oscilan entre cero y seis, abordando diversos niveles de daño dendrítico.
- La metodología incluye pasos precisos de imagen, capturando y puntuando dendritas para garantizar consistencia.
- Los datos se presentan como la proporción de dendritas en cada puntuación de neurodegeneración.
Resultados principales
- El sistema de puntuación diferencia eficazmente los niveles de cambios neurodegenerativos en neuronas dopaminérgicas.
- Los datos sugieren una respuesta neurodegenerativa dependiente de la dosis tras la exposición a rotenona.
- El análisis estadístico muestra diferencias significativas entre los grupos experimentales.
- En general, el sistema permite una cuantificación y comparación clara entre estudios.
Conclusiones
- Este estudio permite un análisis más estandarizado de la neurodegeneración en modelos de C. elegans.
- El método de puntuación promueve la consistencia y permite comparaciones más claras en la investigación.
- Contribuye a comprender los mecanismos de degeneración neuronal relevantes para los trastornos neurodegenerativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación estandarizada de la morfología de neuronas dopaminérgicas en C. elegans respalda la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Un sistema de puntuación universal permite una evaluación cuantitativa y reproducible de la degeneración dendrítica, mejorando la confianza predictiva en modelos preclínicos. Esto facilita la comparación entre estudios y la selección de carteras para programas de enfermedad de Parkinson y otras neurodegeneraciones relacionadas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de cambios morfológicos a nivel dendrítico en neuronas dopaminérgicas.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante una escala estandarizada de siete puntos que registra neurodegeneración desde leve hasta severa.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en el blanco al proporcionar datos de respuesta dependientes de la dosis, como los efectos de la exposición a rotenona, para la validación del mecanismo de acción.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de la morfología dendrítica adecuados para la estandarización de ensayos y la preparación para cribado de alto contenido.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo de imagen escalables y reproducibles mediante la captura de fluorescencia en z-stacks y la puntuación automatizada o manual de dendritas.
- Utilidad del ensayo: Produce distribuciones de puntuaciones proporcionales que permiten comparaciones estadísticas entre grupos de tratamiento mediante pruebas de chi-cuadrado con corrección de Bonferroni.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Relaciona los modelos de neuronas dopaminérgicas de C. elegans con las vías de neurodegeneración humana mediante puntos finales morfométricos conservados.
- Utilidad preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación del progreso de la degeneración en modelos genéticos y químicos.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Clarifica las relaciones estructura-función al correlacionar el daño dendrítico (blebs, roturas, dobleces) con la pérdida funcional de neuronas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, apoyando la identificación de compuestos activos mediante la fenotipificación cuantitativa de la neurodegeneración en modelos de C. elegans.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre compuestos neuroprotectores mediante la evaluación de la integridad de las dendritas en neuronas que expresan dat-1::GFP.
- Tamizaje: Genera salidas estandarizadas listas para ensayos mediante imágenes de z-stacks y puntuación de dendritas para la evaluación de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona puntuaciones cuantitativas de neurodegeneración (0–6) que facilitan el análisis estadístico y la reproducibilidad entre laboratorios.
- Investigación Traducional: Relaciona la morfología de los neuritos en gusanos con la patología dendrítica en mamíferos, permitiendo la validación de dianas alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco de puntuación escalable y transferible para evaluaciones consistentes de neurodegeneración en plataformas de descubrimiento basadas en C. elegans.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al capturar todo el espectro de alteraciones dendríticas, desde blebs hasta la pérdida completa.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante un sistema universal de puntuación y un conjunto de imágenes de práctica para la calibración de los investigadores.
- Valor estratégico: Aumenta la eficiencia del capital al permitir decisiones tempranas de avance o interrupción del proyecto basadas en perfiles cuantitativos de neurodegeneración.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos mediante datos de respuesta a la dosis y significancia estadística obtenidos de poblaciones dendríticas puntuadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y neuroanatomía de neuronas dopaminérgicas de C. elegans.
- Depende de infraestructura de imagen capaz de capturar z-stacks y aplanar imágenes para la visualización de dendritas.
- Necesita una estandarización entre equipos mediante entrenamiento con conjuntos de imágenes anotadas para garantizar la consistencia en la puntuación.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar la escala a diferentes subtipos neuronales o modelos de enfermedad.
- Presenta limitaciones prácticas, como la dependencia de la captura completa de z-stacks para visualizar completamente las dendritas y el entrenamiento de los evaluadores para minimizar la variabilidad entre observadores.
