Name: Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprende a cuantificar la degeneración neuronal dopaminérgica en Caenorhabditis elegus mediante un sistema de puntuación de siete puntos. Este método estandarizado permite evaluar cambios morfológicos dendríticos con precisión.

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Queremos agradecer a Ian T. Ryde, por sus contribuciones al desarrollo de la escala de puntuación y por su apoyo durante la creación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (T32ES021432 apoyó a KSM, y P42ES010356 a JNM).

1. Preparar gusanos para imágenes
NOTA: Ver artículo31del video de JoVE relacionado: https://www.jove.com/v/835/
<ol><li>Para cada grupo experimental, pipetee o elija de 20 a 30 gusanos en una plataforma de imágenes compatible con el microscopio de imágenes. Las plataformas más comunes incluyen almohadillas de gel de agarosa al 2% montadas en portaobjetos de vidrio con una cubierta de31 y placas de 96 pozos que contienen volúmenes de pozos iguales o inferiores a 100 μL de medio líquido.</li>
	<li>Paralizar los gusanos agregando 30-90 mM de azida de sodio (NaN3),2.5-8.5 mM de levamisol HCl, u otro agente paralizante a los gusanos. Si paraliza en líquido, use una concentración más alta de agente paralizante que si paraliza en almohadillas de agarosa. Toque la plataforma de imágenes suavemente para mezclar.</li>
	<li>Permita que los gusanos se paralicen por completo. NOTA: Esto puede tardar varios minutos.</li>
</ol>2. Imagen neuronas dopaminérgicas
<ol><li>Localice las regiones de la cabeza de los gusanos bajo fluorescencia GFP de un solo color utilizando un microscopio de imágenes capaz de tomar pilas z.<ol>
<li>Tenga en cuenta la exposición y la configuración de apertura; evitar la sobreexposición a las dendritas y mantener la configuración consistente en todos los ensayos. Haga que las dendritas sean tan brillantes como sea necesario para una visualización clara; esto generalmente resulta en una sobreexposición del soma. NOTA: Las imágenes incluidas en este protocolo se capturaron con un aumento de 400x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desplácese por el foco para encontrar límites superiores e inferiores donde las dendritas estén claras. Establezca estos como límites superior e inferior para una captura de imagen de pila z.</li>
	<li>Haga clic para capturar imágenes z-stack para cada gusano. NOTA: Todos los pasos siguientes se pueden realizar en cualquier momento.</li>
</ol>3. Prepare imágenes de neuronas dopaminérgicas para la puntuación
<ol><li>Para cada pila z, abra el archivo de imagen utilizando el software del microscopio o un software de análisis de imágenes externo, cargue la pila en el software y comprima la pila en una sola imagen aplanada.</li>
	<li>Imágenes ciegas entre y dentro de los grupos de tratamiento manualmente o utilizando un software de cegamiento automático.</li>
</ol>4. Puntuación de las dendritas neuronales dopaminérgicas
<ol><li>Trabaje con una imagen de neurona a la vez. Elija una de las cuatro dendritas CEP para evaluar si hay ampollas, roturas e irregularidades, incluidas curvas, torceduras y curvas. Se recomienda puntuar de izquierda a derecha cuando la nariz está en la parte superior de la imagen para garantizar la repetibilidad en la puntuación.</li>
	<li>Con las siguientes directrices, asigne un valor de puntuación a la dendrita. Consulte la Figura 1 para ver ejemplos de imágenes de puntuación representativas. 0- sin daño, neuronas "perfectas" 1- irregular (torceduras, curvas, etc.) 2- <5 ampollas 3- 5-10 ampollas 4- >10 ampollas y/o roturas eliminando <25% del total de dendrita 5- rotura, 25-75% de dendrita eliminada 6- rotura, >75% de dendrita eliminada<ol>
<li>Si se cumplen varios criterios dentro de una sola dendrita (es decir, torceduras y ampollas), asigne la puntuación aplicable más alta.</li>
		<li>No puntúe las dendritas que no son claramente visibles, debido a problemas con la captura de imágenes, superposición con otras dendritas, etc. Si hace zoom en una imagen de pila z aplanada, tenga en cuenta los píxeles agrandados que se asemejan a ampollas falsas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita para cada dendrita. Repita para todas las imágenes.</li>
	<li>Registra todas las puntuaciones. Las puntuaciones pueden no estar cegadas en este momento.</li>
</ol>5. Preparar y presentar datos
<ol><li>Calcular el número total de dendritas en cada grupo de tratamiento asignado a cada puntuación de neurodegeneración. Calcule el número total de dendritas puntuadas en cada grupo de tratamiento.</li>
	<li>Divida los recuentos de la puntuación de neurodegeneración por el número total de dendritas puntuadas en el grupo de tratamiento. Presentar los datos como una proporción de dendritas dentro de un grupo de tratamiento en cada puntuación de neurodegeneración.</li>
</ol>6. Realizar análisis estadísticos
<ol><li>Usando un software de programación o manualmente, ejecute una prueba de chi cuadrado para la independencia entre todos los pares de grupos de tratamiento para ser comparados. Cuando sea apropiado, aplique una corrección de Bonferroni del valor p de acuerdo con el número de grupos experimentales comparados para tener en cuenta las comparaciones múltiples. NOTA: Esta prueba determinará diferencias significativas entre dos grupos, pero los detalles del tipo de diferencia deben ser calificados a simple vista.<ol>
<li>Seleccionar comparaciones entre grupos experimentales. Esto variará en función del diseño experimental. NOTA: En nuestros experimentos, por lo general, los controles se comparan con sus respectivos grupos de tratamiento, se comparan todos los controles y se comparan todos los tratamientos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Practique la puntuación con un conjunto de práctica de imágenes de neuronas dopaminérgicas
<ol><li>Consulte el Archivo complementario 1 para obtener un conjunto de imágenes neuronales que se presentan en toda la gama de nuestro sistema de puntuación con comentarios y claves de puntuación. Este conjunto de prácticas está destinado a capacitar a los investigadores nuevos en este método y garantizar la confiabilidad entre los investigadores.</li>
</ol>8. Considere opciones de protocolo alternativas
<ol><li>En lugar de capturar pilas z, complete la puntuación en el microscopio, sin guardar ni apilar imágenes. NOTA: Esta opción reduce los requisitos de capacidades tecnológicas, pero elimina la opción de crear un archivo de imágenes neuronales para volver a él más adelante, requiere cegamiento manual y permite el cegamiento solo entre y no dentro de los grupos de tratamiento.</li>
	<li>En lugar de crear una sola imagen comprimida por pila, complete la puntuación desplazándose por las imágenes de cada pila z. NOTA: Esta opción puede ser más fácil para algunos anotadores y reduce el riesgo de ver ampollas falsas en gusanos que se movieron durante las imágenes y permite anotar dendritas superpuestas, pero requiere cegamiento manual y permite el cegamiento solo entre y no dentro de los grupos de tratamiento.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen revelaciones.

Este protocolo demuestra cómo utilizar la escala de siete puntos desarrollada en nuestro laboratorio para cuantificar los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Creamos y compartimos esta escala como una herramienta para estandarizar el análisis del trabajo de neurodegeneración dopaminérgica en gusanos. Reconociendo la importancia de estudiar las vías implicadas en enfermedades neurodegenerativas altamente prevalentes, muchos investigadores aprovechan la idoneidad del modelo de C. elegans para la visualización neurobiología para estudiar la neurodegeneración29,31,32,33. Sin embargo, aún no ha habido un esfuerzo para reducir la gran variación en la forma en que se cuantifica el daño neuronal a través de la investigación de neurodegeneración en gusanos. Por lo tanto, el sistema de puntuación que se presenta aquí tiene por objeto promover la coherencia en los análisis y permitir la comparación entre los estudios.
Nuestro sistema de puntuación se puede utilizar para analizar datos derivados de experimentos de C. elegans que utilizan reporteros fluorescentes específicos de la célula que permiten la visualización de neuronas dopaminérgicas, específicamente las dendritas CEP. Específicamente, las cepas marcadas en el gen dat-1 para la visualización GFP de las neuronas dopaminérgicas son compatibles con este protocolo de puntuación, aunque existen muchos otros modelos transgénicos relacionados de EP. Es posible que este sistema de puntuación también sea útil con esos modelos; sin embargo, esto debe validarse antes de usarlos. En particular, es posible (pero no probado hasta donde sabemos) que las cepas con mCherry no sean adecuadas para este protocolo, ya que la agregación de mCherry puede ser indistinguible de las ampollas o provocar estrés celular. En lugar de proporcionar un comentario sobre todos los modelos específicos de EP y trastornos neurodegenerativos relacionados, nos centramos en la puntuación de los datos de neurodegeneración en sí. Además, este protocolo se centra solo en la morfología neuronal y no considera los niveles de fluorescencia del soma. Los ensayos de neurodegeneración se pueden realizar junto con ensayos conductuales relevantes para enfermedades neurodegenerativas, como la locomoción, la esperanza de vida y los experimentos de duración de la salud. Los niveles de degeneración en modelos químicos, genéticos y basados en la edad establecidos de la EP también se pueden confirmar y detallar utilizando este sistema de puntuación. La medición de modelos, contribuyentes y vías asociadas con la EP y otras enfermedades neurodegenerativas puede aumentar el conocimiento científico sobre estos trastornos y apuntar hacia cómo manejar la creciente población de individuos afectados. Tener resultados de neurodegeneración comparables en toda la literatura es clave para apoyar este objetivo.
Para interpretar los resultados derivados de este sistema de puntuación, proponemos considerar cada dendrita puntuada como n=1, ya que diferentes neuronas dentro del mismo gusano a menudo responden de manera diferente al tratamiento. Esto puede ser impulsado por el hecho de que solo las neuronas CEPD están directamente expuestas al fluido corporal pseudoceoómico. Como tal, esto permite que la distribución de la puntuación de los grupos experimentales se muestre como proporciones del número total de dendritas puntuadas en cada grupo. Este método, utilizado para los resultados representativos que se muestran aquí, permite una fácil comparación entre los grupos de tratamiento, tiene en cuenta las respuestas diferenciales dentro del mismo gusano y se analiza fácilmente con una prueba de Chi cuadrado complementada por una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Una plantilla de ejemplo para registrar las puntuaciones de las neuronas y calcular los porcentajes se puede encontrar en el Archivo Suplementario 2. Hemos considerado dos métodos alternativos para el análisis de datos e identificamos fallas en cada uno. La primera opción es promediar las puntuaciones de las cuatro neuronas CEP para cada gusano. Esto parametriiza los datos; sin embargo, asume una relación lineal con el aumento de la puntuación y pierde información sobre cualquier variación en la respuesta al tratamiento dentro del mismo gusano. La segunda opción es sumar las puntuaciones de las cuatro neuronas CEP para cada gusano, lo que también parametriliza los datos. Esto todavía asume una relación lineal entre los puntajes, sin embargo, explica más hábilmente las diferencias dentro de cada gusano que los puntajes promedio al expandir los parámetros de los puntajes posibles. Sin embargo, los investigadores individuales deciden mostrar sus datos, los resultados deben considerarse junto con variables experimentales como la cepa y la edad del gusano; por ejemplo, los gusanos más viejos tienen un nivel basal de degeneración esperado más alto.
A medida que se interpretan estos resultados de la puntuación de neurodegeneración, los investigadores también deben ser conscientes de algunas advertencias y limitaciones del método de puntuación. En primer lugar, ciertos requisitos tecnológicos son necesarios para capturar imágenes adecuadas para la puntuación. El microscopio de imagen debe admitir canales de fluorescencia y ajustes de aumento y exposición que permitan una visualización clara de las dendritas CEP. Como se señala en el protocolo, los requisitos tecnológicos pueden reducirse mediante ajustes de protocolo como la puntuación de imágenes en vivo a través del campo microscópico en lugar de capturar imágenes para archivar y calificar en un momento posterior. En segundo lugar, los posibles métodos de análisis estadístico para estos datos son limitados ya que los datos no son paramétricos. Se presume que la escala de puntuación es progresiva, pero no puede considerarse numérica ya que existen opciones de puntuación discretas y los aumentos de puntuación no son necesariamente proporcionales entre sí con respecto a la función biológica. Por estas razones, las pruebas de chi cuadrado para la independencia son las más adecuadas para este tipo de datos, lo que significa que el análisis estadístico depende del observador para determinar la dirección de cualquier significación estadística. En particular, la prueba de chi cuadrado también solo analiza las diferencias en la distribución de la puntuación y no puede proporcionar evidencia de diferencias en categorías de puntuación específicas. Finalmente, aún no se ha estudiado la significación funcional de los cambios morfológicos cuantificados por este sistema de puntuación.
Las direcciones futuras impulsadas por el desarrollo de este sistema de puntuación implican la determinación de bases biológicas y correlaciones con las puntuaciones de las neuronas individuales. El estudio de la importancia funcional (por ejemplo, señalización neuronal, comportamiento de gusanos) de todos los puntos de la escala de puntuación informará cómo traducir mejor los resultados a conclusiones aplicables a la comprensión de las causas y consecuencias de las enfermedades neurodegenerativas y el desarrollo de opciones de prevención y tratamiento. La investigación futura sobre la neurodegeneración en gusanos debe tener como objetivo descubrir conexiones con otra morfología, como la forma y el tamaño del gusano. Además, la investigación de neurodegeneración puede ser apoyada por el estudio de otras cepas reporteras de C. elegans para medir puntos finales como la bioenergética, la producción de especies reactivas de oxígeno y la morfología mitocondrial.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa cada vez más común que afecta a hasta 10 millones de personas en todo el mundo1. Los hombres y las personas mayores tienen un mayor riesgo de desarrollar EP; la edad media de inicio de la enfermedad es de 60 años, y la incidencia de EP sube de una incidencia del 0,3% en la población general al 3% en individuos mayores de 80 años1,2. Aunque los detalles de la patología de la EP no se comprenden completamente, este trastorno progresivo implica la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la región de la sustancia negra del mesencéfalo. Los mecanismos hipotizados de esta pérdida neuronal implican disfunción mitocondrial, estrés oxidativo e inflamación2. Las causas y los factores de riesgo de la enfermedad aún se están explorando, pero implican una combinación de factores ambientales y genéticos1. Por ejemplo, los estudios han encontrado asociaciones positivas entre el uso de pesticidas de por vida y la EP, así como la susceptibilidad genética a la EP familiar1,3.
El sistema modelo de C. elegans, desarrollado originalmente en parte para la investigación en neurobiología4,es muy adecuado para evaluar la pérdida de neuronas dopaminérgicas in vivo. Nass y sus colegas fueron pioneros en el usode C. elegans para la neurodegeneración dopaminérgica5,y muchos grupos han adoptado desde entonces el gusano como un modelo exitoso para la EP y la disfunción dopaminérgica6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans son buenos modelos de enfermedades neurodegenerativas por muchas de las mismas razones por las que son un organismo modelo tan popular para otras áreas de la biología; su transparencia permite el estudio in vivo de los procesos celulares, la manipulación genética en gusanos es relativamente rápida y fácil, tienen un corto tiempo de generación de unos tres días, y son fáciles de mantener21. La mayoría de los modelos de gusanos de EP se dividen en una de tres categorías: modelos basados en la edad, modelos químicos y modelos genéticos. La capacidad de sincronizar una población de gusanos permite el estudio de la neurodegeneración relacionada con la edad para un modelo basado en la edad de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el envejecimiento, como LA EP22. Las exposiciones químicas que inducen defectos neuronales similares a la EP se han establecido utilizando una variedad de productos químicos que incluyen 6-hidroxidopamina (6-OHDA), rotenona y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)22. Los gusanos también se utilizan con éxito como modelos genéticos de EP; las cepas con knockouts de genes neurales seleccionados pueden modelar varias enfermedades neurodegenerativas1,4. Las combinaciones de factores genéticos y ambientales, o "interacciones gen-ambiente", que probablemente juegan unpapel importante en la EP2,17,23,24,25,26,27,28,han sido examinadas por varios grupos que usan C. elegans. Finalmente, también se ha observado neurodegeneración dopaminérgica relacionada conlaedad29,30. Si se utiliza una cepa transgénica neural apropiada en imágenes fluorescentes, cualquiera de estos modelos de gusanos de EP se puede utilizar para estudiar la neurodegeneración dopaminérgica.
Cuantificar los cambios en la morfología neuronal es un componente crítico de la investigación neurodegenerativa. En C. elegans,se han utilizado muchas cepas reporteras fluorescentes para visualizar cambios morfológicos y pérdida de neuronas. Las cepas adecuadas para la obtención de imágenes neuronales presentan una proteína fluorescente asociada con promotores específicos de la célula. Para los ensayos de neurodegeneración dopaminérgica, nuestro laboratorio ha utilizado la cepa BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], que tiene una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) en el gen dat-1, expresada en las neuronas dopaminérgicas. Tenga en cuenta que el fenotipo de rodillo del BY200 tiene una penetrancia muy baja y rara vez se observa. Otras cepas comunes utilizadas para este tipo de imágenes incluyen BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], y varias otras disponibles en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) o a petición de laboratorios específicos1,21,22,29 . Estas cepas generalmente permiten la visualización de las tres clases de neuronas dopaminérgicas: neuronas cefálicas (CEP), deiridas anteriores (ADE) y postdeiridas (PDE). C. elegans no expresa naturalmente la proteína alfa sinucleína, pero cepas como BY273 han sido diseñadas para expresarla. Sin embargo, observamos que el sistema de puntuación que presentamos fue desarrollado utilizando BY200, que no expresa alfa sinucleína, y necesitaría ser validado con esa cepa (o cualquier otra cepa nueva) antes de su uso. Las neuronas dopaminérgicas adicionales están presentes en los hombres, pero rara vez se consideran porque los hombres normalmente comprenden <1% de una población de C. elegans. Aquí, nos centramos en las cuatro neuronas dopaminérgicas CEP que se encuentran en la región de la cabeza de C. elegans. Este conjunto de neuronas se localiza fácilmente bajo microscopía fluorescente, está presente tanto en gusanos hermafroditas como masculinos, no suele superponerse con otras áreas de autofluorescencia y se informa comúnmente en estudios de gusanos. En particular, aunque estas neuronas no están mielinizadas, las neuronas dorsales CEP (CEPD) están directamente expuestas al líquido corporal pseudocoelómico donde las neuronas ventrales CEP no lo están. Un conjunto saludable de dendritas CEP generalmente se muestra como líneas relativamente rectas e ininterrumpidas. Las dendritas degeneradas pueden mostrar cualquier combinación de irregularidades y signos de daño, incluidos puntos pronunciados llamados ampollas a lo largo de la línea de la dendrita y roturas en la línea de la dendrita. Ejemplos de neuronas CEP en diferentes niveles de degeneración se pueden ver en la Figura 1.
Aunque la neurodegeneración dopaminérgica está siendo estudiada por un número creciente de laboratorios de C. elegans, ha habido una gran variación en los métodos analíticos para cuantificar el daño neuronal dopaminérgico29,31,32,33,34. Muchos estudios publicados han informado sobre la presencia o ausencia de soma CEP con un sistema binario de puntuación de neuronas degenerativas versus típicas o de tipo salvaje31,32. Estos métodos de puntuación pueden identificar ciertos factores estresantes que inducen la neurodegeneración, pero no pueden cuantificar los detalles de la progresión del daño neuronal más sutil, o detectar fácilmente las diferencias entre la neurodegeneración inducida por productos químicos únicos u otras variables. Además, los sistemas de puntuación centrados en los cuerpos celulares pueden no ser sensibles a niveles menos graves de daño o al daño neuronal que afecta solo a una parte de la célula, como la dendrita. Dado que la dendrita parece tener el mayor rango de cambios morfológicos consistentemente detectables en respuesta a factores estresantes químicos, los hemos seleccionado como base para nuestro análisis. El sistema de puntuación que presentamos aquí está modificado a partir de escalas multipunto basadas en la morfología de las dendritas que se han utilizado previamente en nuestro laboratorio29,33. Este sistema expande estas escalas de cinco y seis puntos en una escala de siete puntos para tener en cuenta los cambios morfológicos relacionados con la edad, como un mayor número esperado de torceduras en las dendritas de adultos mayores, y para diferenciar entre el daño severo y la pérdida completa de dendritas. El propósito de introducir este sistema de puntuación es proporcionar la capacidad de capturar una imagen completa de la neurodegeneración en todos los niveles de daño neuronal y proporcionar un sistema universal para apoyar la consistencia en toda la investigación de neurodegeneración dopaminérgica de C. elegan. Debido a que la puntuación es inherentemente subjetiva, es fundamental maximizar la consistencia entre los individuos que anotan, y cegar al anotador a la identidad de las imágenes utilizando el cegamiento manual o un programa de cegamiento automático35. Para mejorar la consistencia, presentamos una serie de imágenes de entrenamiento y utilizamos las capacidades de video de JoVE para demostrar nuestro sistema de puntuación en detalle. Recomendamos utilizar un sistema que permita la puntuación cegada automatizada y permita al anotador cuantificar su consistencia de puntuación al volver a puntuar un subconjunto de imágenes. Esto es particularmente importante cuando se combinan o comparan datos de múltiples científicos, o cuando se capacita a científicos nuevos en la puntuación.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td>Para la adquisición de imágenes en pocillos</td></tr><tr><td>Blinder</td><td>Solibyte Solutions LLC</td><td></td><td>Software gratuito que ciega entre y dentro de conjuntos de archivos de imagen cargados</td></tr><tr><td>BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]</td><td>Aschner Lab</td><td></td><td>C. elegans cepa adecuada para la obtención de imágenes fluorescentes de neuronas dopaminérgicas. Puede ser sustituida por otras cepas con un indicador fluorescente impulsado por promotores específicos de la célula Disponible bajo pedido en el laboratorio de Meyer</td></tr> medio <tr><td>K completo</td><td>51 mM cloruro de sodio, 32 mM cloruro de potasio, 3 mM cloruro de calcio, 3 mM sulfato de magnesio, 13 mM</td>colesterol Cubertores 22x22mm, vidrio n.º 1 VWR VistaVision 48366-067 Para la adquisición de imágenes en portaobjetos dimetilsulfóxido (DMSO)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Disolvente para exposiciones a rotenona</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ 1.5e o más reciente. Rasband, W.S., ImageJ, INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD DE EE. UU., Bethesda, Maryland, EE. UU., https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td><td>Sotware para la manipulación de imágenes</td></tr><tr><td>Keyence BZ-X Microscopio de fluorescencia todo en uno</td><td>Keyence</td><td></td><td>Se utiliza para la captura de imágenes de neuronas dopaminérgicas fluorescentes. Puede ser sustituido por otros microscopios estimulables para la obtención de imágenes fluorescentes de alta resolución</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio 3x1"</td><td>VWR VistaVision</td><td>16004-420</td><td>Para la adquisición de imágenes en portaobjetos</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875 R8875</td><td>Inhibidor del complejo I de la cadena transportadora de electrones</td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN_3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td> paralítico <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>Para lisis de lejía</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>VWR</td><td>RC7495.5-32</td><td>Para lisis de lejía</td></tr><tr><td>Tetramisol (Levamisol) Clorhidrato (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td>Paralytic</td></tr></tbody></table>

cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en caenorhabditis elegans

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

La pérdida de neuronas dopaminérgica está involucrada en la patología de la enfermedad de Parkinson (EP), un trastorno neurodegenerativo altamente prevalente que afecta a más de 10 millones de personas en todo el mundo. Dado que muchos detalles sobre la etiología de la EP siguen siendo desconocidos, se necesitan estudios que investiguen los contribuyentes genéticos y ambientales a la EP para descubrir métodos de prevención, manejo y tratamiento. La caracterización adecuada de la pérdida neuronal dopaminérgica puede ser relevante no solo para la investigación de la EP, sino también para otros trastornos neurodegenerativos cada vez más prevalentes.
Existen modelos genéticos y químicos establecidos de neurodegeneración dopaminérgica en el sistema modelo Caenorhabditis elegans, con fácil visualización de la neurobiología apoyada en la transparencia de los nematodos y la arquitectura neuronal invariante. En particular, los cambios morfológicos de las neuronas dopaminérgicas de C. elegans se pueden visualizar utilizando cepas con reporteros fluorescentes impulsados por promotores específicos de la célula, como el gen transportador de dopamina dat-1, que se expresa exclusivamente en sus ocho neuronas dopaminérgicas.
Con las capacidades de este sistema modelo y la tecnología adecuada, muchos laboratorios han estudiado la neurodegeneración dopaminérgica. Sin embargo, hay poca consistencia en la forma en que se analizan los datos y gran parte de la literatura actual utiliza análisis de puntuación binaria que capturan la presencia de degeneración, pero no los detalles completos de la progresión de la pérdida de neuronas. Aquí, introducimos un sistema de puntuación universal para evaluar los cambios morfológicos y la degeneración en las dendritas de las neuronas cefálicas de C. elegans. Esta escala de siete puntos permite el análisis a través de una gama completa de morfología de dendritas, que van desde neuronas sanas hasta la pérdida completa de dendritas, y considerando detalles morfológicos que incluyen torceduras, ramificaciones, ampollas y roturas. Con este sistema de puntuación, los investigadores pueden cuantificar cambios sutiles relacionados con la edad, así como cambios más dramáticos inducidos por productos químicos. Finalmente, proporcionamos un conjunto de imágenes de práctica con comentarios que se pueden usar para entrenar, calibrar y evaluar la consistencia de puntuación de los investigadores nuevos en este método. Esto debería mejorar la consistencia dentro y entre el laboratorio, aumentando el rigor y la reproducibilidad.

El sistema de puntuación descrito aquí se utilizó para evaluar la neurodegeneración en el estadio larvario L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans después de la exposición a la rotenona. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2 y representan la capacidad de nuestro sistema de puntuación para detectar y cuantificar niveles variables de daño neuronal dopaminérgico. La rotenona es un inhibidor natural del complejo I de la cadena de transporte de electrones utilizado en algunos pesticidas, piscicidas e insecticidas36,37. Tenga en cuenta que trabajar con productos químicos tóxicos como la rotenona es inherentemente peligroso, y todos los laboratorios deben cumplir con todas las regulaciones de uso y eliminación establecidas por sus instituciones. En este experimento, las exposiciones a rotenona líquida a dos dosis, 0,03 μM y 0,5 μM, junto con un grupo de control, se iniciaron inmediatamente después de una lisis de hidróxido de sodio de 0,5 M/hipoclorito de sodio al 1% para cosechar huevos38. Los huevos eclosionaron en K-mediumcompleto 33,39 con 0.25% de dimetilsulfóxido (DMSO), y los gusanos permanecieron en líquido durante ~ 48 horas hasta la etapa larvaria de L4 a mediados de la etapa, momento en el que se eliminaron de la exposición química y se prepararon, se tomaron imágenes y, utilizando la Figura 1 como referencia, se calificaron de acuerdo con los pasos del protocolo anteriores. Para la dosis más alta de 0,5 μM de rotenona, los huevos se cosecharon con 24 horas de anticipación para tener en cuenta un retraso en el desarrollo inducido por rotenona y garantizar que todos los gusanos estuvieran sincronizados en el momento de la imagen.
La Figura 2 demuestra además cómo nuestro laboratorio visualiza los datos recopilados utilizando este sistema de puntuación. En esta figura, se puede apreciar una respuesta de neurodegeneración dependiente de la dosis, y se muestra claramente el desglose específico de la distribución de la puntuación. Estos resultados particulares muestran cómo el daño neuronal puede presentarse de diferentes maneras. Por ejemplo, el grupo expuesto a rotenona de 0,03 μM tiene una proporción disminuida de neuronas sanas con una puntuación de 0, en comparación con el grupo de control, pero también tiene una proporción disminuida de 5 puntuaciones. La detección de este detalle sobre las distribuciones de puntuación entre grupos experimentales pone de relieve la sensibilidad de nuestro sistema de puntuación de siete puntos. Estos datos fueron analizados para la significación estadística de acuerdo con el protocolo, utilizando una prueba de chi cuadrado para la independencia con una corrección de Bonferroni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig01.jpg"> Figura 1. Alteración morfológica de la neurona dopaminérgica y degeneración del sistema de puntuación de imágenes representativas. Este gráfico consolidado contiene ejemplos de neuronas en cada puntuación y está destinado a ser utilizado como referencia para la puntuación. Aquí, cada puntuación etiquetada corresponde a la dendrita más dañada en cada gusano, como lo indica la flecha en cada panel. Estas imágenes fueron tomadas utilizando el protocolo descrito en este trabajo con BY200 C. elegans. Consulte el Archivo complementario 1 para obtener un conjunto de imágenes puntuadas con comentarios que se utilizarán para capacitar a los nuevos en este método de puntuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig02.jpg"> Figura 2. BY200 L4 Morfología de la neurona dopaminérgifa y puntuaciones de degeneración después de la exposición a la rotenona. Esta figura muestra resultados representativos analizados utilizando los métodos de puntuación descritos aquí. Las mayores proporciones visualizadas de neuronas dopaminérgicas dañadas con mayores concentraciones de exposición a rotenona se analizaron estadísticamente utilizando pruebas de chi cuadrado para la independencia. Ambos grupos de tratamiento con rotenona arrojaron valores de p estadísticamente significativos en comparación con el grupo de control. Diferentes letras indican diferencia estadística. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Expediente complementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/Supplemental_Training_Set_KM_V5.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente complementario 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/SupplementaryFile2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

En este artículo, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar consistentemente los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Este sistema está destinado a análisis de ensayos de neurodegeneración dopaminérgica utilizando modelos genéticos, químicos y basados en la edad de trastornos neurodegenerativos.

Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

En este video, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C.elegans. Actualmente hay una gran variación en los métodos analíticos para cuantificar la neurodegeneración en gusanos. Además, algunas habilidades existentes se centran solo en los cuerpos celulares y no son sensibles a ciertos tipos y niveles de daño.El propósito de introducir este sistema de puntuación es proporcionar la capacidad de capturar una imagen completa de la neurodegeneración en todos los niveles de daño, y proporcionar un sistema universal para apoyar la consistencia en toda la investigación de neurodegeneración dopaminérgica de C.elegans. Aquí, demostraremos cómo obtener imágenes de neuronas bajo fluorescencia, asignar puntuaciones a las dendritas de esas neuronas y obtener una vista previa de cómo mostrar e interpretar los resultados. Para cada grupo experimental, pipetee o elija de 20 a 30 gusanos en una plataforma de imágenes compatible con el microscopio de imágenes.Las plataformas más comunes incluyen almohadillas de agarosa al 2% montadas en portaobjetos de vidrio con un resbalón de cubierta y placas de 96 pozos que contienen volúmenes de pozos iguales o inferiores a 100 microlitros de medio líquido. Permita que los gusanos se paralicen por completo. Esto puede tardar varios minutos.Cargue la plataforma de imágenes preparada en un microscopio de imágenes capaz de capturar z-stack. Localice la región de la cabeza del gusano primero en un campo brillante, luego bajo una fluorescencia GFP de un solo color utilizando el microscopio de imágenes. El gusano se muestra aquí en un aumento de 400x.Desplácese por el foco para encontrar límites superiores e inferiores donde las dendritas estén claras. Establezca estos como límites superior e inferior para la captura de imágenes z-stack. Seleccione el tono deseado.Aquí usamos un micrómetro. Haga clic para capturar imágenes de la pila z en el canal de fluorescencia GFP. Para cada pila z, abra el archivo de imagen utilizando el software de microscopio o un software de análisis de imágenes externo.Cargue la pila en el software y comprima la pila en una sola imagen aplanada. Alinee las imágenes entre y dentro de los grupos de tratamiento manualmente o utilizando un software de bobinado automático. Trabaje con una imagen de neurona a la vez.Elija una de las cuatro dendritas CEP para evaluar las ampollas, roturas e irregularidades, incluidas las curvas, torceduras y curvas. Se recomienda puntuar de izquierda a derecha cuando la nariz está en la parte superior de la imagen para garantizar la repetibilidad en la puntuación. Con estas directrices, asigne un valor de puntuación a cada dendrita.Asigne una puntuación de cero para las dendritas sin daño visible, una puntuación de uno para las dendritas con irregularidades pero sin manchas o roturas, una puntuación de dos para las dendritas con menos de cinco ampollas, una puntuación de tres para entre cinco y 10 ampollas, una puntuación de cuatro para más de 10 ampollas y / o roturas que eliminen hasta el 25% de la dendrita, una puntuación de cinco por rotura eliminando del 25 al 75% de la dendrita, y una puntuación de seis si más del 75% de la dendrita está ausente. Si se cumplen varios criterios dentro de una sola dendrita, considere los criterios correspondientes a la puntuación más alta. Estas imágenes de puntuación representativas que se encuentran en la Figura 1 del artículo asociado con este video pueden usarse como referencia.Para demostrar la puntuación, repasaremos la asignación de puntuaciones a algunas imágenes de neuronas de ejemplo. Comience con la parte superior más dendrita, no hay manchas visibles, roturas o irregularidades. Asigne una puntuación de cero.La segunda dendrita tiene alrededor de 14 ampollas y no hay roturas visibles. Asigne una puntuación de cuatro. La tercera dendrita no se puede ver en su totalidad debido a la superposición con la dendrita dos y no se puede puntuar.La dendrita inferior más tiene alrededor de 11 ampollas y algunos descansos. Asigne una puntuación de cinco. En esta imagen, solo tres dendritas son puntuables, ya que una dendrita no se capturó completamente en la captura de la pila z.No hay sangrado en las tres dendritas visibles. Así que esto se anotaría de arriba a abajo como un cero, un cero, y debido a la torcedura aquí, un uno. Finalmente, en esta imagen, las cuatro dendritas están más del 75% perdidas.Todas las dendritas aquí reciben una puntuación de seis. Registra todas las puntuaciones. Las puntuaciones pueden no estar cegadas en este momento.La plantilla de puntuación utilizada aquí se puede encontrar en los Archivos suplementarios. Divida los recuentos de la puntuación de neurodegeneración por el número total de dendritas puntuadas en el grupo de tratamiento. Presentar los datos como proporción de dendritas dentro del grupo de tratamiento en cada puntuación de neurodegeneración.Nuestro sistema de puntuación se utilizó para evaluar la neurodegeneración en el estadio larval L4 BY200 C.elegans después de la exposición a rotenona. Los datos se muestran aquí como con las proporciones del número total de dendritas en cada valor de puntuación para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrita puntuada como n 1.En esta figura, se puede apreciar una respuesta de neurodegeneración dependiente de la dosis a la exposición a la rotenona, y se muestra claramente el desglose específico de la distribución de la puntuación. Estos grupos experimentales fueron estadísticamente diferentes según una prueba de Independencia de Chi cuadrado complementada por una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. En este vídeo, hemos demostrado cómo utilizar la escala de siete puntos desarrollada en nuestro laboratorio para cuantificar los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en C.elegans.El uso del método de puntuación promueve la consistencia en el análisis y permite la comparación entre los estudios de investigación de neurodegeneración en gusanos. Nuestro sistema de puntuación se puede utilizar para analizar datos derivados de experimentos de C.elegans que utilizan reporteros fluorescentes específicos de la célula, como el gen transportador de dopamina dat-1 que permite la visualización de neuronas dopaminérgicas. Ahora, encuentre un conjunto de imágenes de práctica con comentarios que se puedan usar para entrenar, calibrar y evaluar la consistencia de puntuación de los investigadores nuevos en este método en el material complementario de este artículo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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Aquí se presenta un protocolo para monitorear la degradación de la proteína huntingtina fusionada con el fluoróforo fotoconvertible Dendra2.

En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento C. Elegans usando Dendra fotoconvertible2

Los nematodos Caenorhabditis elegans adultos jóvenes están expuestos a diferentes concentraciones de pesticidas comerciales u otros tóxicos durante 2-24 h. Luego, se pueden visualizar diferentes neuronas utilizando cepas que expresan fluorescentes. Este artículo demuestra cómo exponer los nematodos a los pesticidas y evaluar el daño neuronal.

Examinando el efecto de los pesticidas en las neuronas caenorhabditis elegans

Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para obtener imágenes de la morfología mitocondrial en múltiples tejidos de C. elegans durante el envejecimiento.

Imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento

Aprende a cuantificar la degeneración neuronal dopaminérgica en Caenorhabditis elegus mediante un sistema de puntuación de siete puntos. Este método estandarizado permite evaluar cambios morfológicos dendríticos con precisión.

Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans

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