Name: Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a medir el flujo de sustrato mitocondrial en células tumorales A549 y Hep G2 permeabilizadas con perfringolysin O recombinante. Este método evalúa los efectos de la metformina sobre la respiración celular en investigación oncológica.

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Los autores agradecen a los miembros del personal del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de Hradec Králové y del Departamento de Fisiopatología de la Tercera Facultad de Medicina por la ayuda con los productos químicos y la preparación de muestras. Este trabajo fue apoyado por los programas de subvenciones de la Universidad Charles PROGRES Q40/02, la subvención NU21-01-00259 del Ministerio de Salud de la República Checa, la subvención de la fundación científica checa 18-10144 y el proyecto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financiado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa y por la Unión Europea.

1. Un día antes del ensayo
<ol><li>Preparación de reactivos y sustratos.<ol>
<li>Solución de ensayo mitocondrial (MAS): Preparar soluciones madre de todos los reactivos como se describe en la Tabla 1. Caliente las existencias de manitol y sacarosa a 37 °C para disolverlas por completo. Mezcle los reactivos para preparar 2x MAS, luego caliente la mezcla a 37 ° C. Ajuste el pH con 5N KOH a 7.4 (~ 7 mL), luego agregue agua para llevar el volumen hasta 1 L. Filtre-esterilice y almacene las alícuotas a -20 ° C hasta el día de la medición.</li>
		<li>Albúmina sérica bovina (5% BSA): Disolver 5 g de BSA en 90 ml de agua estéril precalentada en un agitador magnético y evitar temblores. Ajuste el pH a 7.4 con 5 N KOH, y luego agregue agua para llevar el volumen hasta 100 ml. Filtrar-esterilizar y almacenar las alícuotas a -20 °C hasta el día de la medición.</li>
		<li>Sustratos mitocondriales: Prepare soluciones madre de 1 M de succinato de sodio, piruvato de sodio y glutamato de sodio en agua estéril. Prepare una solución madre de 100 mM de malato de sodio en agua estéril y use agua estéril precalentada para preparar una solución madre de 10 mM de palmitoil carnitina. Ajuste el pH de cada solución a 7.4 por 5 N KOH y esterilice el filtro. Conservar los sustratos a 2-8 °C. En el momento de su uso, caliente palmitoyl carnitina a 37 ° C para disolver cualquier precipitado. Para su uso posterior, conservar las alícuotas de todos los sustratos excepto el piruvato a -20 °C.</li>
		<li>Inhibidores mitocondriales: Use dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar soluciones madre de 25 mM de oligomicina, 50 mM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), 20 mM de rotenona y 20 mM de antimicina A. Guarde las alícuotas a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siembra y tratamiento de las células: Como se muestra en la Figura 2,sembra las células en las columnas 2-11. Las columnas 1 y 12 deben dejarse vacías para que sirvan como pozos de fondo. En este trabajo se utilizaron células HepG2 y A549.<ol>
<li>Sembrar las células a una densidad de 20.000 células por pozo. Utilice 50-80 μL de medio de cultivo celular para la siembra.</li>
		<li>Llene los pocillos en blanco con un volumen igual de medio de cultivo celular e incube las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Deje que las células se adhieran durante 3-4 horas y luego agregue 100 μL de medio de cultivo celular a todos los pocillos.</li>
		<li>Con esa adición final del medio, aplique el tratamiento en las columnas 7-11. En este trabajo, el grupo experimental fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas, y el grupo de control fue tratado con un volumen igual de agua destilada estéril como un control de vehículo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hidratación de los sensores: Pipete 200 μL de agua estéril por pozo en la placa de servicio, luego devuelva cuidadosamente el cartucho del sensor mientras sumerge los sensores en agua. Incubar el cartucho en una incubadora libre deCO2a 37 °C hasta el día siguiente.</li>
	<li>La plantilla de protocolo de ensayo: Encienda el analizador (consulte la Tabla de materiales)y la unidad controladora. Inicie el software de control de instrumentos y adquisición de datos y diseñe el protocolo de ensayo como se describe en la Tabla 2. En Definiciones degrupo, cree cuatro estrategias de inyección donde el puerto A difiere según el sustrato inyectado(Figura 3). Nombra las estrategias después de los sustratos o sus abreviaturas.</li>
	<li>A los puertos B, C y D, asigne los compuestos oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A, respectivamente. Cree ocho grupos y asígneles el nombre que se muestra en la Figura 4. En Mapa de placas, asigne los grupos a los pozos correspondientes y, a continuación, guarde el protocolo como una plantilla lista para usar. Deje el analizador encendido para permitir que la temperatura se estabilice durante la noche. Mantenga el analizador en un lugar con una temperatura estable para evitar cambios bruscos de temperatura.</li>
</ol>2. El día del ensayo
<ol><li>Sustitución del agua por el calibrante: Deseche el agua de la placa de servicios públicos y bombee 200 μL de calibrante precalentado por pozo en la placa de servicio. Devuelva el cartucho a la incubadora libre de CO2hasta el momento del ensayo. Para evitar la evaporación rápida del calibrante, mantenga una fuente de humedad dentro de la incubadora y apague o reduzca la velocidad del ventilador al mínimo.</li>
	<li>Preparación de las soluciones de trabajo: Comience calentando 2x MAS, 5% BSA y agua estéril a 37 ° C. Mientras tanto, permita que las existencias de inhibidores alcancen la temperatura ambiente. Utilice 2x MAS caliente y agua destilada estéril para preparar 5 ml de la concentración de trabajo de los sustratos e inhibidores como se describe en la Tabla 3.</li>
	<li>Carga de los puertos de inyección: Como se muestra en la Figura 3,cargue 20 μL de los sustratos en el puerto A. Cargue la mezcla de succinato/rotenona en el puerto A de las filas A y B. Cargue la mezcla de piruvato/malato en el puerto A de las filas C y D. Cargue la mezcla de glutamato/malato en el puerto A de las filas E y F. Cargue la mezcla de palmitoil carnitina/malato en el puerto A de las filas G y H. Para toda la placa, puerto de carga B con 22 μL de preparación de oligomicina, puerto C con 25 μL de preparación fccP y puerto D con 27 μL de mezcla de rotenona/antimicina A.</li>
	<li>Inicio del paso de calibración: En la pestaña Ejecutar ensayo, haga clic en Iniciar ejecución para iniciar el ensayo. Inserte el cartucho del sensor cargado e inicie el paso de calibración. Espere a que se complete la calibración antes de continuar con el siguiente paso.</li>
	<li>Preparación del medio de ensayo (MAS-BSA-rPFO): Para preparar 20 mL del medio de ensayo, mezcle 10 mL de 2x MAS, 9.2 mL de agua estéril y 0.8 mL de BSA al 5% en un tubo de 50 mL. Añadir 2 μL de rPFO de 10 μM para alcanzar una concentración de 1 nM y volver a suspender la mezcla con pipeteo suave. Evite agitar y no use un mezclador de vórtice para mezclar. Incubar el tubo a 37 °C hasta el momento de su uso.</li>
	<li>Lavado de las células: Lave las células y los pozos vacíos en blanco dos veces con solución salina tamponada (PBS) sin fosfato libre de calcio y magnesio precalentada con una pipeta multicanal. Evite reutilizar los mismos consejos para desechar el medio de cultivo celular y agregar PBS. Realice este paso fuera del flujo laminar para proteger las células de la desecación por el flujo de aire.</li>
	<li>Permeabilización celular en medio de ensayo: Utilizando una pipeta multicanal, deseche el PBS y reemplácelo por 180 μL del medio de ensayo precalentado (MAS-BSA-rPFO).</li>
	<li>Inicio de la medición: Inmediatamente después de la permeabilización, reemplace la placa de utilidad del cartucho del sensor calibrado con la placa de celda e inicie la medición.</li>
</ol>

<ol><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function%2C+biology%2C+and+role+in+disease%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li>
<li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics+3%22">Bioenergetics 3</a>. , Academic press. London. (2002).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Staňková, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).</li>
<li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+%28TPMP%29+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Este protocolo es una modificación de los estudios publicados previamente7,8,9,10 y la guía del usuario del producto. En contraste con el protocolo del fabricante, se utiliza 2x MAS en lugar de 3x MAS, ya que 2× MAS es más fácil de disolver y no forma precipitaciones después de la congelación. Las alícuotas MAS congeladas 2x se pueden almacenar hasta seis meses y muestran resultados consistente...

La respirometría basada en microplacas ha revolucionado la investigación mitocondrial al permitir el estudio de la respiración celular de un tamaño de muestra pequeño1. La respiración celular generalmente se considera como un indicador de la función mitocondrial o "disfunción", a pesar del hecho de que el rango mitocondrial de funciones se extiende más allá de la producción de energía2. En condiciones aeróbicas, las mitocondrias extraen la energía almacenada en diferentes sustratos descomponiendo y convirtiendo estos sustratos en intermedios metabólicos que pueden alimentar el ciclo del ácido cítrico3 (Figura 1). El flujo continuo de sustratos es esencial para que el flujo del ciclo del ácido cítrico genere 'donantes de electrones' de alta energía, que entregan electrones a la cadena de transporte de electrones que genera un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, lo que permite que la ATP-sintasa fosforila ADP a ATP4. Por lo tanto, un diseño experimental para evaluar la respiración mitocondrial debe incluir la naturaleza de la muestra (células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas) y sustratos mitocondriales.
Las células mantienen un almacén de sustratos autóctonos5,y las mitocondrias oxidan varios tipos de sustratos simultáneamente6,lo que complica la interpretación de los resultados obtenidos de los experimentos realizados sobre células intactas. Un enfoque común para investigar la capacidad mitocondrial para oxidar un sustrato seleccionado es aislar las mitocondrias o permeabilizar las células investigadas5. Aunque las mitocondrias aisladas son ideales para estudios cuantitativos, el proceso de aislamiento es laborioso. Se enfrenta a dificultades técnicas como la necesidad de un gran tamaño de muestra, la pureza del rendimiento y la reproducibilidad de la técnica5. Las células permeabilizadas ofrecen una solución para las desventajas del aislamiento mitocondrial; sin embargo, los agentes permeabilizantes rutinarios de naturaleza detergente no son específicos y pueden dañar las membranas mitocondriales5.
La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como agente permeabilizante selectivo de la membrana plasmática7,y se utilizó con éxito en combinación con un analizador de flujo extracelular en varios estudios7,8,9,10. Hemos modificado un protocolo utilizando rPFO para detectar el flujo de sustrato mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular XFe96. En este protocolo, se comparan cuatro vías oxidantes de sustrato diferentes en dos fenotipos celulares mientras se tienen suficientes réplicas y el control adecuado para cada material probado.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime; -difosfato sal monopotásica dihidratado</td><td>Merck</td><td>A5285</td><td>almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Merck</td><td>A3803</td><td>tienda en 2 - 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona</td><td>Merck</td><td>C2920</td><td>almacenado a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Merck</td><td></td><td>D8418</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Tienda Merck</td><td>63559</td><td>en RT</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>en RT</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiloéter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético</td><td>Merck</td><td>03777</td><td>en RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H7523</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>L(-)Sal disódica de ácido málico</td><td>Merck</td><td>M9138</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sodio sal hidratado</td><td>Merck</td><td>G5889</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Merck</td><td>M2670</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>tienda en -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro de palmitoil-DL-carnitina</td><td>Merck</td><td>P4509</td><td>tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio Tienda Merck</td><td></td><td>484016</td><td>en RT</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Tienda Merck</td><td>R8875</td><td>en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Software de escritorio Tecnologías</td><td>Agilent Descargar</td><td></td><td>desde www.agilent.com</td></tr><tr><td>Analizador Seahorse XFe96 Tecnologías</td><td></td><td></td><td>Agilent</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Tecnologías Agilent</td><td>102416-100</td><td>Cartuchos de sensor XFe96 y microplacas de cultivo celular XF96</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Merck</td><td>P2256</td><td>tienda en 2 - 8 & deg; C</td></tr><tr><td>Succinato de sodio dibásico hexahidratado</td><td>Merck</td><td>S2378</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>Sacarosa</td> Tienda <td>Merck</td><td>S7903</td><td>en RT</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tienda Merck</td><td>W3500</td><td>en RT</td></tr><tr><td>XF calibrador</td><td>Agilent technologies</td><td>100840-000</td><td>tienda en RT</td></tr><tr><td>XF Perpermeabilizante de membrana plasmática</td><td>Agilent technologies</td><td>102504-100</td><td>Perfringolisina O recombinante (rPFO) - Alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr></tbody></table>

medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

El flujo de sustrato mitocondrial es una característica distintiva de cada tipo de célula, y los cambios en sus componentes, como transportadores, canales o enzimas, están involucrados en la patogénesis de varias enfermedades. El flujo de sustrato mitocondrial se puede estudiar utilizando células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas. La investigación de células intactas encuentra varios problemas debido a la oxidación simultánea de diferentes sustratos. Además, varios tipos de células contienen almacenes internos de diferentes sustratos que complican la interpretación de los resultados. Métodos como el aislamiento mitocondrial o el uso de agentes permeabilizantes no son fácilmente reproducibles. Aislar mitocondrias puras con membranas intactas en cantidades suficientes a partir de muestras pequeñas es problemático. El uso de permeabilizadores no selectivos causa varios grados de daño inevitable de la membrana mitocondrial. La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como un permeabilizante más apropiado, gracias a su capacidad para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática sin afectar la integridad mitocondrial. Cuando se usa en combinación con la respirometría de microplacas, permite probar el flujo de varios sustratos mitocondriales con suficientes réplicas dentro de un experimento mientras se usa un número mínimo de células. En este trabajo, el protocolo describe un método para comparar el flujo de sustrato mitocondrial de dos fenotipos o genotipos celulares diferentes y se puede personalizar para probar varios sustratos o inhibidores mitocondriales.

Comience por normalizar los resultados a la segunda medición de la respiración basal para mostrar los valores como porcentaje de tasa de consumo de oxígeno (OCR%). Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 5,Figura 6, Figura 7 y Figura 8. Es importante asignar los pozos de fondo adecuados para cada grupo e inactivar los pozos de fondo de otros grupos. <stron...

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Porque prueba el flujo de sustrato mitocondrial que puede verse afectado con diferentes patologías o tratamientos. Por ejemplo, hoy lo usaremos para revelar la respuesta de las células cancerosas al tratamiento con metformina. Requiere un número mínimo de células mientras tiene suficientes réplicas y el control apropiado para cada material distinto.El analizador es solo para uso de investigación. Esta técnica puede identificar errores en el metabolismo mitocondrial y se puede utilizar para evaluar los medicamentos guerreros que afectan a las mitocondrias. Demostrando el procedimiento estará Karolina Vaneckova, una estudiante de pregrado y técnica de investigación de mi laboratorio.Para comenzar la siembra de células A549 a una densidad de 20, 000 células por pozo en columnas, de dos a 11 de una microplaca de cultivo celular XF 96 de caballito de mar. Dejando las columnas uno y 12 vacías como pozos de fondo. Llene los pozos en blanco con un volumen igual del medio de cultivo celular, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono para la unión celular.Después de tres o cuatro horas, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular en los pozos. Trate las columnas del grupo experimental de siete a 11 con una metformina milimolar y el grupo de control con un volumen igual de agua destilada estéril, luego devuelva la placa a la incubadora. Para hidratar los sensores, pipetee 200 microlitros de agua estéril por pozo en la placa de servicios públicos.A continuación, devuelva con cuidado el cartucho del sensor mientras sumerge el sensor en agua. Incubar el cartucho en una incubadora libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados hasta el día siguiente. Encienda el analizador y la unidad de control.Inicie el software de control de instrumentos y adquisición de datos, y diseñe el protocolo de ensayo como se describe en el manuscrito de texto. Bajo las definiciones de grupo, cree cuatro estrategias de inyección donde el puerto A difiera según el sustrato inyectado y nombre las estrategias después de los sustratos o abreviaturas. Asignar oligomicina al puerto B, FCCP al puerto C y rotenona Antimicina A mezcla al puerto D.Crear y nombrar ocho grupos, bajo el mapa de placas, asignar grupos a los pozos correspondientes.A continuación, guarde el protocolo como una plantilla lista para usar. Deje que el analizador esté encendido para permitir que la temperatura se estabilice durante la noche. Al día siguiente, deseche el agua de la placa de servicios públicos y agregue 200 microlitros del calibrante precalentado por pozo en la placa de servicios públicos.Devuelva el cartucho a la incubadora libre de dióxido de carbono hasta el momento del ensayo. Mantenga una fuente de humedad dentro de la incubadora y apague o reduzca la velocidad del ventilador al mínimo, para evitar la evaporación rápida del calibrante. Preparar cinco mililitros de la solución de trabajo de los sustratos e inhibidores con solución de ensayo mitocondrial precalentada dos veces, BSA al 5% y agua estéril como se describe en el manuscrito de texto.A continuación, cargue los puertos del inyector con sustrato e inhibidores como se describe en el manuscrito de impuestos. Para la calibración en la pestaña ensayo de ejecución, haga clic en el inicio de la ejecución para iniciar el ensayo. Inserte el cartucho censor cargado y espere a que se complete la calibración.Prepare un medio de ensayo de 20 mililitros, mezclando dos veces la solución de ensayo mitocondrial, agua estéril y BSA al 5% en un tubo de 50 mililitros. Añadir dos microlitros de 10 micromolinos recombinantes perfrendolisina O, para alcanzar una concentración de un nanomolar. Y vuelva a suspender la mezcla con pipeteos suaves, evitando temblores y vórtices.Incubar el tubo a 37 grados centígrados hasta su uso. Use una pipeta multicanal para lavar las células y los pozos vacíos en blanco dos veces, utilizando una solución de PBS libre de calcio y magnesio precalentada. Deseche el PBS y agregue 180 microlitros del medio de ensayo precalentado para la permeabilización celular.Inmediatamente después de la permeabilización, reemplace la placa de utilidad del cartucho del sensor calibrado con la placa de celda que contiene celdas permeabilizadas e inicie la medición. El grupo de tratamiento tuvo una tasa más alta de respiración inducida por succinato. La respuesta de las células A549 al tratamiento con metformina fue mayor que la hepatitis G2. Para la respiración inducida por el malato de piruvato, las células A549 mostraron una mayor inducción en comparación con las células Hep G2 entre cinco y 15 minutos.Se obtuvieron resultados similares para la respiración inducida por el malato de glutamato y la respiración inducida por el malato de palmitoilcarnitina. Alcanzar la concentración correcta de sustrato e inhibidores. El volumen correcto debe cargarse en el puerto correcto.Cuando se identifica un cambio en una vía metabólica de un determinado sustrato, será necesario evaluar la función de las enzimas y transportadores implicados en esa vía.

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Biología

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

Estos protocolos ayudarán a los usuarios a sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides derivados de líneas celulares de cáncer 3D utilizando el análisis de flujo extracelular Seahorse.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Los métodos para estudiar la bioenergética mitocondrial bajo concentraciones de sustrato fisiológicamente relevantes en las células inmunitarias son limitados. Proporcionamos un protocolo detallado que utiliza fluororrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios en la respuesta del potencial de la membrana mitocondrial a la demanda de energía en células T humanas, monocitos y células mononucleares periféricas.

Fluorrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios dinámicos en el potencial de la membrana mitocondrial en células inmunitarias humanas

Aprenda a medir el flujo de sustrato mitocondrial en células tumorales A549 y Hep G2 permeabilizadas con perfringolysin O recombinante. Este método evalúa los efectos de la metformina sobre la respiración celular en investigación oncológica.

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

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