Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Porque prueba el flujo de sustrato mitocondrial que puede verse afectado con diferentes patologías o tratamientos. Por ejemplo, hoy lo usaremos para revelar la respuesta de las células cancerosas al tratamiento con metformina. Requiere un número mínimo de células mientras tiene suficientes réplicas y el control apropiado para cada material distinto.

El analizador es solo para uso de investigación. Esta técnica puede identificar errores en el metabolismo mitocondrial y se puede utilizar para evaluar los medicamentos guerreros que afectan a las mitocondrias. Demostrando el procedimiento estará Karolina Vaneckova, una estudiante de pregrado y técnica de investigación de mi laboratorio.

Para comenzar la siembra de células A549 a una densidad de 20, 000 células por pozo en columnas, de dos a 11 de una microplaca de cultivo celular XF 96 de caballito de mar. Dejando las columnas uno y 12 vacías como pozos de fondo. Llene los pozos en blanco con un volumen igual del medio de cultivo celular, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono para la unión celular.

Después de tres o cuatro horas, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular en los pozos. Trate las columnas del grupo experimental de siete a 11 con una metformina milimolar y el grupo de control con un volumen igual de agua destilada estéril, luego devuelva la placa a la incubadora. Para hidratar los sensores, pipetee 200 microlitros de agua estéril por pozo en la placa de servicios públicos.

A continuación, devuelva con cuidado el cartucho del sensor mientras sumerge el sensor en agua. Incubar el cartucho en una incubadora libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados hasta el día siguiente. Encienda el analizador y la unidad de control.

Inicie el software de control de instrumentos y adquisición de datos, y diseñe el protocolo de ensayo como se describe en el manuscrito de texto. Bajo las definiciones de grupo, cree cuatro estrategias de inyección donde el puerto A difiera según el sustrato inyectado y nombre las estrategias después de los sustratos o abreviaturas. Asignar oligomicina al puerto B, FCCP al puerto C y rotenona Antimicina A mezcla al puerto D.Crear y nombrar ocho grupos, bajo el mapa de placas, asignar grupos a los pozos correspondientes.

A continuación, guarde el protocolo como una plantilla lista para usar. Deje que el analizador esté encendido para permitir que la temperatura se estabilice durante la noche. Al día siguiente, deseche el agua de la placa de servicios públicos y agregue 200 microlitros del calibrante precalentado por pozo en la placa de servicios públicos.

Devuelva el cartucho a la incubadora libre de dióxido de carbono hasta el momento del ensayo. Mantenga una fuente de humedad dentro de la incubadora y apague o reduzca la velocidad del ventilador al mínimo, para evitar la evaporación rápida del calibrante. Preparar cinco mililitros de la solución de trabajo de los sustratos e inhibidores con solución de ensayo mitocondrial precalentada dos veces, BSA al 5% y agua estéril como se describe en el manuscrito de texto.

A continuación, cargue los puertos del inyector con sustrato e inhibidores como se describe en el manuscrito de impuestos. Para la calibración en la pestaña ensayo de ejecución, haga clic en el inicio de la ejecución para iniciar el ensayo. Inserte el cartucho censor cargado y espere a que se complete la calibración.

Prepare un medio de ensayo de 20 mililitros, mezclando dos veces la solución de ensayo mitocondrial, agua estéril y BSA al 5% en un tubo de 50 mililitros. Añadir dos microlitros de 10 micromolinos recombinantes perfrendolisina O, para alcanzar una concentración de un nanomolar. Y vuelva a suspender la mezcla con pipeteos suaves, evitando temblores y vórtices.

Incubar el tubo a 37 grados centígrados hasta su uso. Use una pipeta multicanal para lavar las células y los pozos vacíos en blanco dos veces, utilizando una solución de PBS libre de calcio y magnesio precalentada. Deseche el PBS y agregue 180 microlitros del medio de ensayo precalentado para la permeabilización celular.

Inmediatamente después de la permeabilización, reemplace la placa de utilidad del cartucho del sensor calibrado con la placa de celda que contiene celdas permeabilizadas e inicie la medición. El grupo de tratamiento tuvo una tasa más alta de respiración inducida por succinato. La respuesta de las células A549 al tratamiento con metformina fue mayor que la hepatitis G2. Para la respiración inducida por el malato de piruvato, las células A549 mostraron una mayor inducción en comparación con las células Hep G2 entre cinco y 15 minutos.

Se obtuvieron resultados similares para la respiración inducida por el malato de glutamato y la respiración inducida por el malato de palmitoilcarnitina. Alcanzar la concentración correcta de sustrato e inhibidores. El volumen correcto debe cargarse en el puerto correcto.

Cuando se identifica un cambio en una vía metabólica de un determinado sustrato, será necesario evaluar la función de las enzimas y transportadores implicados en esa vía.