Name: Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende a medir la β-oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios de ratón recién aislados. Este protocolo mantiene la integridad de organelos y minimiza cambios en la expresión génica para obtener resultados metabólicos precisos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención R35GM119528 de los Institutos Nacionales de Salud a Roberta Leonardi.

<ol><li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li>
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<li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li>
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<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li>
<li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Durante la perfusión hepática, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire, ya que bloquean los microcapilarios en el hígado, impidiendo o restringiendo la circulación tampón y disminuyendo en general el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos20,21. Las precauciones, como inspeccionar de cerca la línea de entrada llena de tampón antes de la canulación del IVC y evitar levantar la línea de entrada del tubo que contiene el tampón 1 para cambiar...

La β-oxidación de ácidos grasos es un proceso esencial en el metabolismo de los lípidos, proporcionando una vía catabólica para equilibrar la síntesis de ácidos grasos y la ingesta de la dieta. Este proceso genera energía para múltiples órganos, incluidos el músculo cardíaco, la corteza renal y el hígado en ayunas, y utiliza ácidos grasos obtenidos de la dieta, la lipólisis del tejido adiposo y las reservas internas de triglicéridos 1,2.
La oxidación de los ácidos grasos a través de la vía de β-oxidación da como resultado el acortamiento secuencial de la cadena de acilo graso por dos carbonos a la vez, liberados como acetil-CoA, y este proceso ocurre tanto en las mitocondrias como en los peroxisomas. Mientras que la mayoría de los ácidos grasos sufren sólo β-oxidación, algunos se oxidan en diferentes carbonos antes de entrar en esta vía. Por ejemplo, los ácidos grasos sustituidos por 3-metilo, como el ácido fitánico, se someten a la eliminación de un carbono por α-oxidación en los peroxisomas antes de entrar en la vía de β-oxidación. Del mismo modo, algunos ácidos grasos se convierten primero en ácidos grasos dicarboxílicos por oxidación del grupo metilo terminal (ω-oxidación) en el retículo endoplásmico antes de ser oxidados preferentemente en los peroxisomas por β-oxidación3.
Independientemente del orgánulo específico, un ácido graso primero debe convertirse en un tioéster de coenzima A (CoA), o acil-CoA, para oxidarse a través de la vía de β oxidación. β-Oxidación de acil-CoAs de cadena larga en la matriz mitocondrial requiere el transbordador de carnitina para su translocación, donde la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) cataliza la conversión de acil-CoAs en acilcarnitinas y es la enzima limitante de velocidad en este proceso4. Una vez translocados a la matriz mitocondrial, los acil-CoAs se vuelven a formar y sirven como sustratos para la maquinaria mitocondrial de β-oxidación. En el estado de ayuno, el acetil-CoA producido a través de la β-oxidación en las mitocondrias hepáticas se canaliza principalmente a la cetogénesis. Los peroxisomas sirven como el sitio principal para la β-oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga, cadena ramificada y dicarboxílicos. Los peroxisomas no requieren el transbordador de carnitina para importar sustratos de ácidos grasos, sino que importan los correspondientes acilo-CoAs a través de la actividad de los transportadores de casete de unión a ATP (ABC) ABCD1-35. Dentro de los peroxisomas, los acil-CoAs son oxidados por un conjunto dedicado de enzimas, distintas de la maquinaria de β oxidación de ácidos grasos mitocondriales. Tanto las mitocondrias como los peroxisomas también requieren un suministro de NAD + y CoA libre para oxidar las cadenas de acilo graso. Se ha demostrado que los niveles de CoA en el hígado aumentan en respuesta al ayuno, lo que respalda el aumento de la tasa de oxidación de ácidos grasos que ocurre en este estado6. Además, el aumento de la degradación de CoA en los peroxisomas resulta en una disminución selectiva de la oxidación de ácidos grasos peroxisomales7. Por lo tanto, el proceso de oxidación de ácidos grasos dentro de la célula está regulado por los niveles de expresión y las actividades de las enzimas involucradas en la activación, transporte y oxidación de los ácidos grasos, así como las concentraciones de cofactores y otros metabolitos a través de múltiples compartimentos subcelulares.
Los procedimientos que utilizan homogeneizados de tejidos para medir la oxidación de ácidos grasos destruyen la arquitectura celular que regula y apoya este proceso, lo que lleva a una recopilación de datos que no reflejan con precisión el metabolismo in vivo. Si bien las técnicas que utilizan hepatocitos primarios chapados preservan este sistema, el cultivo de células aisladas durante largos períodos de tiempo resulta en una pérdida del perfil de expresión génica in vivo que estaba presente en las células cuando todavía vivían dentro del animal 8,9. El siguiente protocolo describe un método para aislar los hepatocitos primarios y evaluar su capacidad de β-oxidación de ácidos grasos inmediatamente después del aislamiento y en suspensión, utilizando [1-14C]ácido palmítico. El ensayo se basa en la medición de la radiactividad asociada con los metabolitos solubles en ácido (MAPE) o productos, como el acetil-CoA, producidos por la β-oxidación del ácido palmítico [1-14C]10,11.

<table><tbody><tr><td>(R)-(+)-Sal sódica de Etomoxir</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4539/10</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]-Ácido palmítico, 50&ndash; 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL</td><td>Productos químicos radiomarcados americanos</td><td>ARC 0172A</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, estériles</td><td>Corning</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>10 y micro; L capilares/pistones desechables para pipeta de desplazamiento positivo</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008604</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L, 200 y micro; L, y 10 y micro; L pipetas y puntas</td><td></td><td></td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL, 10 mL y 25 mL pipetas serológicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos de centrífuga estériles</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>70% Ácido perclórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A2296-1LB</td><td></td></tr><tr><td>BSA, sin ácidos grasos</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>E-217</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro, 0.22 &mu; m Filtro PES, 500 mL, CellTreat estéril</td><td></td><td>229707</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de gentamicina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-400-25</td><td></td></tr><tr><td>HDPE, viales de centelleo de 6,5 mL</td><td>Hemocitómetro</td><td></td> Fisher Scientific 03-342-3 <td></td></tr><tr><td>Agujas hipodérmicas 22 G, 1,5 en</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td></td> Isoflurano VetOne <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>502017</tr><tr><td>KCl Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Grado de investigación</td><td>MilliporeSigma</td><td>5401119001</td><td>Mezcla definida de colagenasa purificada I y II con una concentración media de termolisina</td></tr><tr><td>M199 medio</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 heptahidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>accuSpin Micro 17</td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>424270010</tr><tr><td>Ácido palmítico</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de desplazamiento positivo MR-10, 10 y micro; L</td><td>Mettler Toledo 17008575</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada con insertos para tubos cónicos de 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>Fondo redondo, 14 mL, tubos de ensayo para cultivo de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-9A</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>TriCarb 4810 TR</td></tr><tr><td>Cóctel ScintiVerse BD</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitado, 30 L de capacidad</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Modelo G76</td></tr><tr><td>Filtros de células estériles, 100 y micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje para el pulgar</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de flujo variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>138762</td><td></td></tr><tr><td>Baños de agua, 2&ndash; Capacidad de</td><td></td><td></td><td></td> 2,5 L</tr></tbody></table>

medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica clave para satisfacer las demandas de energía del hígado y proporcionar sustratos y cofactores para procesos adicionales, como la cetogénesis y la gluconeogénesis, que son esenciales para mantener la homeostasis de la glucosa de todo el cuerpo y apoyar la función de los órganos extrahepáticos en el estado de ayuno. La β oxidación de ácidos grasos ocurre dentro de las mitocondrias y los peroxisomas y se regula a través de múltiples mecanismos, incluida la absorción y activación de ácidos grasos, los niveles de expresión enzimática y la disponibilidad de cofactores como la coenzima A y NAD +. En los ensayos que miden la β oxidación de ácidos grasos en homogeneizados hepáticos, la lisis celular y la adición común de niveles suprafisiológicos de cofactores enmascaran los efectos de estos mecanismos reguladores. Además, la integridad de los orgánulos en los homogeneizados es difícil de controlar y puede variar significativamente entre preparaciones. La medición de la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios intactos supera las trampas anteriores. Este protocolo describe un método para la medición de la β oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos primarios de ratón recién aislados incubados con ácido palmítico marcado con 14C. Al evitar horas o días de cultivo, este método tiene la ventaja de preservar mejor los niveles de expresión de proteínas y la actividad de la vía metabólica del hígado original, incluida la activación de la β oxidación de ácidos grasos observada en hepatocitos aislados de ratones en ayunas en comparación con ratones alimentados.

La perfusión hepática descrita aquí típicamente produce 30-40 millones de células / hígado con una viabilidad promedio del 80%, según lo estimado por la exclusión del azul de tripano (Figura 2). La concentración típica de glucosa en el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que se utiliza para preparar los tampones de perfusión 1 y 2, es de 11 mM. Al medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos aislados de ratones en ayunas, la concentración de glucosa en el KHB se puede reducir para represen...

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Este protocolo fue desarrollado para proporcionar un método robusto para la medición de la betaoxidación total de ácidos grasos mitocondriales y peroxisomales en hepatocitos primarios de ratón. El uso de células intactas mantiene la integridad de los orgánulos y los mecanismos reguladores en su lugar. Además, el ensayo de hepatocitos recién aislados minimiza los cambios en la expresión génica con respecto al hígado de origen.La cirugía puede ser un desafío. Tienes que ser confiado, diligente y concentrado. Una vez que la canulación sea exitosa, trate de relajarse, pero preste atención y controle la calidad de la perfusión.Para comenzar el procedimiento, rocíe generosamente el abdomen y el pecho del ratón anestesiado con etanol al 70%. Luego use los fórceps para levantar la piel y la pared abdominal cerca de la base del abdomen y corte lateralmente a cada lado de la línea media y hasta el diafragma para exponer los órganos. Exponga la vena cava inferior, o IVC, moviendo los intestinos hacia el lado derecho y volteando suavemente los lóbulos del hígado hacia arriba.Inserte un pequeño objeto cilíndrico, como una tapa de aguja, debajo de la parte posterior del mouse para inclinar liger

measurement-fatty-acid-oxidation-suspension-freshly-isolated-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos la tinción in vitro de lípidos neutros en hepatocitos para detectar la esteatosis hepática o la acumulación excesiva de grasa en el hígado. El exceso de grasa se acumula en las células en forma de gotas de lípidos. Oil Red O es un colorante soluble en lípidos que se une a los lípidos neutros intracelulares en estas gotas de lípidos. Cuando se observan bajo un microscopio óptico, estas gotas de lípidos intracelulares aparecen de color rojo intenso.

Tinción de Aceite Rojo O: Una Técnica de Tinción de Lípidos Neutros en Hepatocitos para la Detección de Esteatosis Hepática In Vitro

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

Aquí, se describen métodos optimizados para generar modelos in vivo e in vitro de esteatosis hepática y para analizar los fenotipos esteatóticos y los parámetros fisiológicos relacionados.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Este protocolo describe un método fácil de usar para examinar la oxidación del sustrato mediante el seguimiento de la producción de 14CO2 in vitro.

Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de CO2

Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.

Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio

La lipólisis de triglicéridos en los adipocitos es un proceso metabólico importante que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para medir la lipólisis basal y estimulada en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones.

Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino ex vivo y preadipocitos primarios diferenciados in vitro

Este artículo describe el uso de células HepG2 inducidas por ácido oleico como modelo para la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica.

Modelado in vitro de la deposición de grasa en la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica

Proponemos un protocolo para identificar los ácidos grasos sin necesidad de purificarlos. Combina información sobre los tiempos de retención con los espectros de masas de tres tipos de derivados de ácidos grasos: ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), derivados de 4,4-dimetil oxazolina (DMOX) y ésteres de 3-piridilcarbinil (picolinilo).

Identificación de los ácidos grasos en la<em&gt; Bacillus cereus</em

A continuación, presentamos una hidrólisis eficiente y la posterior protección Fmoc de un aminoácido aislado a partir de un complejo de Ni-Schiff-base. condiciones de hidrólisis se presentan aquí son adecuados para su uso cuando se requiere retención de los grupos protectores de la cadena lateral lábil en medio ácido. Esta técnica puede ser adaptable a una variedad de sustratos de aminoácidos no naturales.

Hidrólisis de un Ni-Schiff-base compleja usando condiciones adecuadas para la retención de los grupos protectores lábiles en medio ácido

Aprende a medir la β-oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios de ratón recién aislados. Este protocolo mantiene la integridad de organelos y minimiza cambios en la expresión génica para obtener resultados metabólicos precisos.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

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