Name: Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprende a registrar la actividad de redes neuronales en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos en ratones. Este método permite analizar la dinámica de la sustancia gris dorsal y evaluar compuestos antinociceptivos.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) de Australia (subvenciones 631000, 1043933, 1144638 y 1184974 a B.A.G. y R.J.C.) y el Instituto de Investigación Médica Hunter (subvención a B.A.G. y R.J.C.).

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
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<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
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<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
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<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

A pesar de la importancia de la DH espinal en la señalización nociceptiva, el procesamiento y las respuestas conductuales y emocionales resultantes que caracterizan el dolor, los circuitos dentro de esta región siguen siendo poco conocidos. Un desafío clave en la investigación de este tema ha sido la diversidad de poblaciones de neuronas que comprenden estos circuitos 6,31,32. Los recientes avances en tecnologías tra...

Las funciones de tipos específicos de interneuronas inhibitorias y excitatorias dentro de la DH de la médula espinal se están descubriendo a un ritmo rápido 1,2,3,4. Juntas, las interneuronas constituyen más del 95% de las neuronas en la DH y están involucradas en el procesamiento sensorial, incluida la nocicepción. Además, estos circuitos interneuronales son importantes para determinar si las señales periféricas ascienden al neuroeje para llegar al cerebro y contribuyen a la percepción del dolor 5,6,7. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios han investigado el papel de las neuronas DH a nivel de análisis de una sola célula o de todo el organismo utilizando combinaciones de electrofisiología intracelular in vitro, etiquetado neuroanatómico y análisis conductual in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Estos enfoques han avanzado significativamente en la comprensión del papel de poblaciones específicas de neuronas en el procesamiento del dolor. Sin embargo, sigue habiendo una brecha en la comprensión de cómo los tipos específicos de células y los pequeños macrocircuitos influyen en grandes poblaciones de neuronas a nivel de microcircuito para posteriormente dar forma a la salida de la DH, las respuestas conductuales y la experiencia del dolor.
Una tecnología que puede investigar la función de macrocircuito o multicelular es la matriz de microelectrodos (MEA)15,16. Los AMUMA se han utilizado para investigar la función del sistema nervioso durante varias décadas17,18. En el cerebro, han facilitado el estudio del desarrollo neuronal, la plasticidad sináptica, el cribado farmacológico y las pruebas de toxicidad17,18. Se pueden utilizar tanto para aplicaciones in vitro como in vivo, dependiendo del tipo de MEA. Además, el desarrollo de los AMUMA ha evolucionado rápidamente, con diferentes números de electrodos y configuraciones ahora disponibles19. Una ventaja clave de los AMUMA es su capacidad para evaluar simultáneamente la actividad eléctrica en muchas neuronas con alta precisión espacial y temporal a través de múltiples electrodos15,16. Esto proporciona una lectura más amplia de cómo las neuronas interactúan en circuitos y redes, en condiciones de control y en presencia de compuestos aplicados localmente.
Un desafío de las preparaciones de DH in vitro es que los niveles de actividad en curso suelen ser bajos. Aquí, este desafío se aborda en los circuitos dh de la médula espinal utilizando el bloqueador de canales K + dependiente de voltaje, 4-aminopryidine (4-AP), para estimular químicamente los circuitos DH. Este fármaco se ha utilizado previamente para establecer la actividad eléctrica síncrona rítmica en la DH de cortes agudos de la médula espinal y en condiciones agudas in vivo 20,21,22,23,24. Estos experimentos han utilizado parches unicelulares y registro extracelular o imágenes de calcio para caracterizar la actividad inducida por 4-AP 20,21,22,23,24,25. En conjunto, este trabajo ha demostrado el requisito de transmisión sináptica excitatoria e inhibitoria y sinapsis eléctricas para la actividad rítmica inducida por 4-AP. Por lo tanto, la respuesta 4-AP se ha visto como un enfoque que desenmascara los circuitos polisinápticos nativos de DH con relevancia biológica en lugar de como un epifenómeno inducido por fármacos. Además, la actividad inducida por 4-AP exhibe un perfil de respuesta similar a los fármacos analgésicos y antiepilépticos como las condiciones de dolor neuropático y se ha utilizado para proponer nuevas dianas farmacológicas analgésicas basadas en la columna vertebral como las conexinas 20,21,22.
Aquí, se describe una preparación que combina MEA y activación química de la DH espinal con 4-AP para estudiar este circuito nociceptivo en el macrocircuito, o nivel de análisis de red. Este enfoque proporciona una plataforma estable y reproducible para investigar circuitos nociceptivos en condiciones ingenuas y neuropáticas "similares al dolor". Esta preparación también es fácilmente aplicable para probar la acción a nivel de circuito de analgésicos conocidos y para detectar analgésicos novedosos en la médula espinal hiperactiva.

<table><tbody><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (Carbógeno - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de mango largo curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr>Cámara <td></td><td></td><td></td>de<td>incubación de interfaz de aire hecha a medida</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td></td> Pinzas de 10091130 <td></td><td>Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>tijeras quirúrgicas grandes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Pernos adhesivos</td><td>instantáneos y suministros industriales</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEAs,</td><td>sistemas multicanal</td> tridimensionales <td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 electrodos de nitruro de titanio (TiN) con 1 electrodo de referencia interno, organizados en una cuadrícula cuadrada de 8x8. Los electrodos son 12 y micro; m de diámetro, 40 y micro; m (100/12/40) o 50 y micro; m (200/12/50) de altura y equidistantes 100 &micro; m (100/12/40) o 200 &micro; m (200/12/50) de distancia.</td></tr><tr><td>Cabecera MEA</td><td>Sistemas multicanal</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>Placa de interfaz MEA</td><td>Sistemas multicanal</td><td>MCS-IFB 3.0 Red MEA de arranque</td><td></td></tr><tr><td></td><td>múltiple Sistemas multicanal</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión MEA</td> Sistemas <td>multicanal</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>MEAs, sistemas multicanal planos</td><td></td><td>60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti</td><td>60 electrodos de nitruro de titanio (TiN) con 1 electrodo de referencia interno, dispuestos en una rejilla cuadrada de 8x8 (200/30) o en una rejilla rectangular de 6x10 (500/30). Los electrodos son 30 y micro; m de diámetro y equidistantes 200 &micro; m (200/30) o 500 y micro; m (500/30) de distancia.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cámara microscópica</td><td>Motic</td><td>Moticam X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>Software Analizador Multicanal</td> Sistemas <td>Multicanal</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>Software Experimentador Multicanal</td> Sistemas <td>Multicanal</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher ACR207805000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte pequeñas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo de cianoacrilato</td><td>Superglue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Newport</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibratorio</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

Los roles y la conectividad de tipos específicos de neuronas dentro del asta dorsal de la médula espinal (DH) se están delineando a un ritmo rápido para proporcionar una visión cada vez más detallada de los circuitos que sustentan el procesamiento del dolor espinal. Sin embargo, los efectos de estas conexiones para una actividad de red más amplia en la DH siguen siendo menos conocidos porque la mayoría de los estudios se centran en la actividad de neuronas individuales y microcircuitos pequeños. Alternativamente, el uso de matrices de microelectrodos (AMUMA), que pueden monitorear la actividad eléctrica en muchas células, proporciona una alta resolución espacial y temporal de la actividad neuronal. Aquí, se describe el uso de AMUMA con cortes de médula espinal de ratón para estudiar la actividad de DH inducida por circuitos de DH químicamente estimulantes con 4-aminopiridina (4-AP). La actividad rítmica resultante está restringida a la DH superficial, estable en el tiempo, bloqueada por tetrodotoxina, y puede ser investigada en diferentes orientaciones de corte. Juntos, esta preparación proporciona una plataforma para investigar la actividad del circuito DH en tejidos de animales ingenuos, modelos animales de dolor crónico y ratones con función nociceptiva genéticamente alterada. Además, los registros de MEA en cortes de médula espinal estimulados con 4-AP se pueden utilizar como una herramienta de detección rápida para evaluar la capacidad de los nuevos compuestos antinociceptivos para interrumpir la actividad en la DH de la médula espinal.

Modelo de actividad en red en el asta dorsal de la médula espinal La aplicación de 4-AP induce de manera confiable la actividad rítmica síncrona en la DH de la médula espinal. Dicha actividad se presenta como un aumento de los EAP y LFP. La señal posterior es una forma de onda de baja frecuencia, que se ha descrito previamente en las grabacionesMEA 30. Los cambios en la actividad de EAP y / o LFP después de la aplicación del medicamento reflejan una actividad neuronal alterada....

Se describe el uso combinado de la tecnología de matriz de microelectrodos y la estimulación química inducida por 4-aminopiridina para investigar la actividad nociceptiva a nivel de red en el asta dorsal de la médula espinal.

Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

La preparación de rodaja espinal MEA 4-AP que se describe proporciona una plataforma para estudiar la conectividad de los circuitos del asta dorsal y cómo estas redes interactúan durante el procesamiento sensorial espinal. La metodología presentada permite investigar la actividad del circuito del asta dorsal a un nivel macroscópico de resolución regional. Esta preparación se puede utilizar como una herramienta de detección rápida para evaluar la capacidad de los compuestos para interrumpir la señalización en los circuitos sensoriales espinales.Este método ayuda a cerrar la brecha en nuestra comprensión de cómo la actividad de tipos celulares específicos y pequeños microcircuitos influyen en grandes poblaciones de neuronas para posteriormente dar forma a la salida de las respuestas de comportamiento del asta dorsal y, en última instancia, a la experiencia del dolor. Para empezar, llene bien el MEA con suero de caballo durante 30 minutos. Después de retirar el suero, enjuague bien el MEA cinco veces con agua destilada hasta que el agua destilada no sea espumosa.Luego, llene el pozo con LCR artificial. Después de decapitar al ratón anestesiado, retire la piel sobre la región abdominal haciendo un pequeño corte en la piel a nivel de las caderas. Luego, tire de la piel a cada lado del corte rostralmente hasta que toda la piel se retire de la parte superior de la caja torácica a la parte superior de la pelvis, tanto ventral como dorsalmente.Después de colocar el cuerpo sobre hielo, use un enfoque ventral para exponer la columna vertebral eliminando las vísceras y cortando las costillas lateralmente hasta el esternón. Retire la caja torácica ventral, ambas escápulas, y las extremidades inferiores y la pelvis. Transfiera la columna vertebral y la preparación de las costillas a un baño de disección que contenga LCR artificial de sacarosa helada.Fije las cuatro esquinas de la preparación colocando alfileres a través de los músculos de la espalda baja y las costillas superiores unidas. Elimine todo el músculo y el tejido conectivo que recubre la superficie ventral de las vértebras con los rongeurs e identifique la región vertebral sobre el agrandamiento lumbo-sacro, que se encuentra aproximadamente debajo de los cuerpos vertebrales T12-L2. Retire un cuerpo vertebral caudal a la región de agrandamiento lumbo-sacra para acceder a la médula espinal que se encuentra en el canal vertebral.Usando tijeras curvas de resorte, corte a través de los pedículos vertebrales bilateralmente mientras levanta y tira del cuerpo vertebral rostralmente para separar los aspectos ventral y dorsal de las vértebras y exponer la médula espinal. Una vez que se extraigan los cuerpos vertebrales para revelar el agrandamiento lumbo-sacro, limpie cuidadosamente las raíces restantes que anclan la médula espinal con tijeras de resorte hasta que la médula flote libre. Aísle la médula espinal con cortes rostrales y caudales por encima y por debajo del agrandamiento lumbo-sacro para hacer que la región objetivo de la médula flote libremente.Para rodajas transversales, levante y coloque el segmento lumbo-sacro por una ruta adjunta en un bloque de poliestireno precortado con un canal poco profundo cortado en el centro. Luego, use adhesivo de cianoacrilato para unir el bloque y el cordón a la plataforma de seccionamiento y colóquelo en el baño de corte que contenga purín artificial de LCR de sacarosa helada. Una vez que se obtengan las rodajas de 300 micrómetros de grosor, transfiera las rebanadas a una cámara de incubación de interfaz de aire que contenga LCR artificial oxigenado y permita que las rebanadas se equilibren durante una hora a temperatura ambiente.Para comenzar a registrar la actividad del cuerno dorsal, transfiera la rebanada de la incubadora al pozo MEA utilizando una pipeta pasteur de punta grande llena de LCR artificial y agregue LCR artificial adicional. Use un pincel fino para el cabello corto para colocar la rebanada sobre la matriz de grabación de 60 electrodos. Luego, coloque un cuello pesado sobre el tejido para mantenerlo en su lugar y promover un buen contacto con los electrodos MEA.Coloque el MEA en el escenario principal de grabación. Verifique la posición del tejido sobre los electrodos usando un microscopio invertido para confirmar que tantos electrodos como sea posible estén debajo del DH superficial. Asegúrese de que al menos dos a seis electrodos no entren en contacto con la rebanada. Después de conectar la cámara al dispositivo, tome una imagen de referencia de la rebanada en relación con el MEA para usarla durante el análisis.Luego, presione start DAQ en el software de grabación y confirme que todos los electrodos reciben una señal clara. A continuación, conecte las líneas de entrada y salida de perfusión al MEA bien lleno de LCR artificial y encienda el sistema de perfusión. Compruebe el caudal y asegúrese de que el flujo de salida es suficiente para evitar el desbordamiento del superfusado.Después de equilibrar el tejido durante cinco minutos, registre los datos de referencia sin procesar durante cinco minutos. Mueva la línea de entrada de perfusión del LCR artificial a una solución de 4-aminopiridina y espere 12 minutos para que la actividad rítmica inducida por 4-aminopiridina alcance el estado estacionario. Luego, registre cinco minutos de actividad inducida por 4-aminopiridina y prepárese para las grabaciones posteriores para probar los medicamentos o verificar la estabilidad de la 4-aminopiridina.Después de cada sesión de grabación, enjuague las líneas con LCR artificial. Después de retirar el MEA de la etapa de la cabeza y eliminar la red y el tejido del pozo MEA, enjuague el MEA y la red con LCR artificial y repita todo el proceso con una nueva rebanada. Abra el software de análisis y cargue el diseño de análisis prefabricado.Abra el archivo de interés y anule la selección del electrodo de referencia y de los electrodos que se consideren excesivamente ruidosos. Establezca la ventana de tiempo para el análisis. A continuación, vaya a la pestaña filtro de canal cruzado.Seleccione los electrodos de referencia y referencia complejos en función de la imagen tomada y las notas realizadas durante el experimento y pulse Explorar antes de continuar. Vaya a la pestaña filtro EAP y aplique un filtro Butterworth de paso alto de segundo orden para eliminar la actividad LFP. Vaya a la pestaña filtro LFP y aplique un filtro Butterworth de paso de banda de segundo orden para eliminar la actividad de EAP.En la pestaña Detector EAP, asegúrese de seleccionar el umbral automático, marque las casillas de borde ascendente y descendente y establezca el tiempo muerto en tres milisegundos. Para establecer umbrales positivos y negativos, inspeccione los datos volviendo a la pantalla del analizador de datos sin procesar, moviendo el marcador de tiempo, volviendo a la pestaña del detector EAP y presionando explorar. Repita el proceso hasta que el umbral de detección establecido capture los EAP sin capturar el ruido o la actividad no fisiológica.En la pestaña detector LFP, asegúrese de seleccionar el umbral manual, marque las casillas de borde ascendente y descendente y establezca el tiempo muerto en tres milisegundos. Establezca el umbral para un electrodo y, una vez satisfecho, seleccione aplicar a todos y luego presione iniciar análisis. La aplicación en el baño del antagonista del canal de sodio dependiente de voltaje tetrodotoxina abolió la actividad de EAP y LFP, confirmando la dependencia de pico de estas señales.La estabilidad de los parámetros de actividad inducidos por 4-aminopiridina se caracterizó para EAP o LFP. Todas las características de actividad más la coincidencia de actividad para las LFP fueron estables en función de la similitud de la actividad inducida por 4-aminopiridina a los 12 minutos después de la aplicación de 4-aminopiridina y 15 minutos después. Los EAP o LFP de la función se caracterizaron por un aumento en el número de eventos coincidentes detectados en múltiples electrodos.El número de electrodos adyacentes unidos y la fuerza de los enlaces entre los electrodos adyacentes y los LFP después de la estimulación con 4-aminopiridina y luego la estabilidad relativa. La orientación de la rebanada es una consideración importante para las preparaciones in vitro. La estimulación con 4-aminopiridina indujo una actividad rítmica similar en la SDH independientemente de la orientación del corte.Finalmente, para arrojar más luz sobre la relevancia de la activación de 4-aminopiridina de las redes dh, se aplicó un baño de solución de LCR artificial de potasio elevado y se demostró que evoca una respuesta de DH similar a la estimulación de 4-aminopiridina. Los pasos clave en el protocolo son la preparación del tejido y la colocación de secciones, asegurando que el tejido esté sano a través de una disección cuidadosa, pero oportuna, así como un delicado posicionamiento óptimo del tejido en el MEA que ayudará a obtener resultados de calidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El video demuestra cómo usar una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs). Se registra la actividad electrofisiológica de un MEA multipocillo que contiene un cocultivo neurona-astrocito para detectar potenciales de acción de múltiples neuronas en la red, lo que confirma la diferenciación exitosa de las hiPSC en neuronas.

Medición de la actividad electrofisiológica de las redes neuronales mediante matrices de microelectrodos

Este video muestra el registro de la actividad neuronal espontánea y dependiente de la estimulación de cultivos primarios de neuronas espirales espirales murinas (SGN) en una matriz de electrodos múltiples (MEA). Consiste en lavar y preparar el MEA, registrar la actividad neuronal espontánea y aplicar estímulos eléctricos controlados para identificar la actividad neuronal dependiente de la estimulación.

Análisis de la actividad neuronal en neuronas primarias de ganglios espirales murinos mediante matrices de electrodos múltiples

Este video describe el registro intracelular in vivo de motoneuronas de rata bajo estimulación transespinal de corriente continua. El protocolo describe cómo medir las propiedades de la membrana y registrar la activación rítmica de las motoneuronas antes, durante y después de la polarización anódica o catódica de la médula espinal.

Estimulación transespinal de corriente directa de la motoneurona espinal de una rata

Este video muestra un ensayo basado en una matriz de microelectrodos para estudiar la actividad de la red neuronal en secciones de la médula espinal de ratón. En primer lugar, se registra la actividad electrofisiológica del asta dorsal superficial (SDH) del corte. Luego, se introduce un inhibidor del canal de potasio para prolongar la despolarización, lo que resulta en una actividad rítmica sincrónica a través de la red neuronal.

Evaluación de redes neuronales en cortes de médula espinal de ratón mediante matrices de microelectrodos

Este video muestra una grabación de una sola fibra de la conducción nerviosa de la fibra C en ratas. Se incide una incisión en una rata anestesiada para exponer el nervio ciático, que proporciona suministro sensorial y motor a las extremidades inferiores. A continuación, se exponen las fibras C individuales. La estimulación eléctrica se proporciona mediante electrodos de estímulo implantados en el pie, y se registra una respuesta a partir de una sola fibra nerviosa.

Registro in vivo de fibras C del nervio ciático en ratas

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Hemos desarrollado una técnica que registra simultáneamente la electrocorticografía y los potenciales de campo local en respuesta a estímulos nociceptivos laser se mueva libremente las ratas. Esta técnica ayuda a establecer una relación directa de señales electrocortical mesoscópicos y macroscópicos, que facilita la investigación de procesamiento en el cerebro de la información nociceptiva.

Grabaciones simultáneas de los potenciales de campo Local Cortical y Electrocorticograms en respuesta a estímulos nociceptivos Laser se mueva libremente las ratas

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

APTrack es un complemento de software desarrollado para la plataforma Open Ephys que permite la visualización de datos en tiempo real y el seguimiento de umbral eléctrico de bucle cerrado de potenciales de acción neuronal. Hemos utilizado con éxito esto en microneurografía para nociceptores de fibra C humana y nociceptores de fibra C y fibra Aδ de ratón.

Seguimiento de umbral eléctrico de circuito cerrado en tiempo real de código abierto para la investigación traslacional del dolor

Aquí presentamos un método para evaluar la activación y bloqueo de axones sensoriales en nervios periféricos en experimentos agudos, anestesiados y in vivo con ratas, utilizando dos tipos de mediciones electrofisiológicas espinales que pueden discriminar la actividad de subtipos de fibras nerviosas: Potenciales de Campo Local y registros neuronales individuales de rango dinámico amplio.

Métodos electrofisiológicos para evaluar el bloqueo del dolor periférico en una rata anestesiada

Aprende a registrar la actividad de redes neuronales en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos en ratones. Este método permite analizar la dinámica de la sustancia gris dorsal y evaluar compuestos antinociceptivos.

Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

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