Reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados
10 de agosto de 2021
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados en proteoliposomas definidos.
El uso de AAA-ATPasas para eliminar proteínas de una bicapa lipídica es un tema común en el control de calidad de proteínas. Una comprensión mecanicista de este proceso esencial requiere un sistema reconstituido. La reconstitución previa con AAA-ATPasas fue compleja y heterogénea.
Nuestro sistema es simple y está completamente definido. Esto nos permite manipular la AAA-ATPasa Msp1, el sustrato y el entorno lipídico. Para comenzar, agregue el tampón de reconstitución previamente preparado, las proteínas Msp1 y TA purificadas y los liposomas en un tubo de PCR, luego incube la mezcla en hielo durante 10 minutos.
Durante la incubación, corte la punta de una punta de pipeta P200 a aproximadamente 1/8 de pulgada de diámetro. A continuación, vórtice el tubo que contiene BioBeads a fondo para obtener una mezcla uniforme. Luego, retire rápidamente la tapa y use la punta de pipeta P200 cortada para transferir un volumen apropiado de las perlas a un tubo de PCR vacío.
Una vez que se complete la incubación de 10 minutos para la reconstitución, usando una punta de pipeta sin cortar, retire todo el líquido de las BioBeads. Luego, transfiera 100 microlitros de la reconstitución al tubo con los BioBeads y deje que gire sobre una rueda durante 16 horas. Al día siguiente, haga girar el tubo en un PicoFuge para peletizar las perlas, luego transfiera el material reconstituido a un tubo de PCR limpio y mantenga el tubo en hielo.
Para eliminar las proteínas que no se reconstituyeron en los liposomas, equilibre las columnas de espín de glutatión con un tampón de extracción, que generalmente implica tres rondas de lavado con 400 microlitros de tampón, seguido de centrifugación para eliminar el tampón. A continuación, agregue cinco micromoles de cada chaperona al material reconstituido, seguido de 100 microlitros de tampón de extracción, lo que eleva el volumen a 200 microlitros. Agregue esta mezcla a las columnas de espín de glutatión equilibradas, luego tapone las columnas de espín y gírelas durante 30 minutos, permitiendo que las chaperonas se unan a la resina.
Después de la rotación, gire las columnas brevemente. Recolectar el flujo a través, que es el material pre-limpiado agotado de proteínas agregadas. Colóquelo sobre hielo y proceda directamente al ensayo de extracción.
Preparar tubos para el análisis SDS-PAGE. Agregue 45 microlitros de agua destilada doble al tubo de entrada, 40 microlitros de agua al tubo de flujo y 16.6 microlitros de búfer de carga 4X SDS-PAGE a cada tubo. Para el ensayo de extracción, prepare la reacción de extracción y eleve el volumen final a 200 microlitros con el tampón de extracción.
Luego, precaliente el ensayo de extracción en un bloque de calor de 30 grados Celsius durante dos minutos. Para iniciar el ensayo, agregue ATP a una concentración final de dos milimoles. Gire el tubo durante cinco segundos en un PicoFuge e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.
Durante la incubación, tome una muestra de cinco microlitros de la reacción y agréguela al tubo de entrada. Además, equilibre una columna de espín de glutatión para cada muestra en el ensayo de extracción como se demostró anteriormente. Una vez que se complete la incubación de 30 minutos, agregue 200 microlitros de tampón de extracción al tubo, llevando el volumen total a 400 microlitros.
Luego, agregue esta reacción a la resina de glutatión equilibrada y deje que gire durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la rotación, gire las columnas para recoger el flujo a través, luego tome una muestra de 10 microlitros para el tubo de flujo a través. Lave la resina dos veces con 400 microlitros de tampón de extracción, descartando el flujo después de cada lavado.
Después del tercer lavado, mantenga el flujo y tome una muestra de 50 microlitros para el tubo de lavado. A continuación, prepare cinco mililitros de tampón de elución agregando glutatión reducido a una concentración final de cinco milimoles en el tampón de extracción. Agregue 200 microlitros del tampón de elución a la columna de centrifugado e incube durante cinco minutos.
Luego, centrífuga la columna y recoge el flujo. Repita el paso de elución una vez más. Después de la segunda elución, tome una alícuota de 50 microlitros de la muestra de elución y agréguela al tubo elutorio.
Después de ejecutar un western blot, la eficiencia de extracción se puede determinar comparando la cantidad de sustrato en la fracción elu con la fracción de entrada. La señal en el flujo muestra cierta variabilidad, pero generalmente es similar a la fracción de entrada, y no hay señal en la fracción de lavado. Por lo general, hay una eficiencia de extracción de aproximadamente el 10% para el control positivo y una eficiencia de extracción de uno a 2% para el control negativo.
Cuando las condiciones de reconstitución no están optimizadas, los niveles de extracción son comparables entre las muestras positivas y negativas. Esta técnica permitió a nuestro laboratorio probar las propiedades biofísicas del reconocimiento del efecto del sustrato por Msp1.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para la reconstrucción de la actividad de extracción de Msp1 utilizando componentes completamente purificados en proteoliposomas definidos. El estudio tiene como objetivo simplificar el proceso de reconstitución de las AAA-ATPasas, que son cruciales para el control de calidad de proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología celular
Antecedentes
- Las AAA-ATPasas desempeñan un papel fundamental en la eliminación de proteínas de las bicapas lipídicas.
- Para comprender mecanicísticamente este proceso se requiere un sistema reconstruido.
- Los métodos anteriores eran complejos y heterogéneos.
- Este estudio presenta un sistema de reconstrucción sencillo y completamente definido.
Objetivo del estudio
- Manipular la AAA-ATPasa Msp1 y su sustrato.
- Crear un entorno lipídico definido para el estudio.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de extracción de proteínas.
Métodos Utilizados
- Preparación del tampón de reconstitución.
- Uso de las proteínas Msp1 y TA purificadas.
- Incorporación de liposomas en un tubo de PCR.
- Incubación de la mezcla en hielo durante 10 minutos.
Resultados principales
- Se estableció un protocolo sencillo y eficaz para la reconstrucción de Msp1.
- El sistema definido permite una mejor manipulación de los componentes.
- Se logró una comprensión mejorada del proceso de extracción.
- Los resultados indican una eficiencia mejorada en el control de calidad de proteínas.
Conclusiones
- El estudio proporciona un método sencillo para estudiar las AAA-ATPasas.
- Contribuye a la comprensión de la extracción de proteínas a partir de membranas.
- Este protocolo puede aplicarse a investigaciones futuras en el control de calidad de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la eliminación mecanicista de riesgos en la extracción de proteínas mediada por AAA-ATPasa, una vía conservada de control de calidad relacionada con la proteostasis mitocondrial. Al proporcionar un sistema completamente definido y reconstituido con componentes purificados, apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para enfermedades asociadas a la disfunción mitocondrial, incluyendo la neurodegeneración y el cáncer. El enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento mediante el aislamiento de variables que influyen en el reconocimiento del sustrato y la eficiencia de extracción.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el papel de Msp1 en la eliminación de proteínas con anclaje de cola mal localizadas, lo que apoya la validación funcional de dianas en las vías de proteostasis mitocondrial.
- Valor operativo: Utiliza Msp1 purificado, proteínas TA y liposomas para eliminar la complejidad celular, permitiendo la manipulación precisa del entorno de ATPasa, sustrato y lípidos.
- Valor predictivo: Facilita el análisis estructura-función del reconocimiento del sustrato por Msp1, ayudando en la identificación de compuestos iniciales para moduladores de la actividad de extracción de proteínas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Establece un ensayo de extracción cuantitativo en el que la eficiencia se mide comparando los niveles de sustrato en el eluido frente al material de entrada mediante inmunotransferencia (Western blot).
- Valor operativo: Define condiciones estandarizadas: incubación en hielo de 10 minutos para la reconstitución, rotación de 16 horas con BioBeads y extracción impulsada por ATP de 30 minutos a 30 °C, seguida de elución con glutatión.
- Preparación del ensayo: Los resultados incluyen la eficiencia de extracción (típicamente ~10 % para el control positivo, 1–2 % para el negativo), lo que permite la detección de hits y el cribado de respuesta frente a dosis en un formato reconstituido.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia Translacional: Relaciona los mecanismos de proteostasis mitocondrial con modelos de enfermedades en los que la disfunción de Msp1 está implicada en el cáncer, el envejecimiento y la neurodegeneración.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Aísla variables que afectan la extracción, como la composición lipídica y la biofísica del sustrato, para aclarar el acoplamiento al blanco y reducir la ambigüedad en la validación preclínica del blanco.
- Continuidad: Facilita la transición desde la validación bioquímica del blanco hasta el cribado fenotípico en sistemas relevantes para la enfermedad, al definir un módulo de extracción mínimo y controlable.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se enmarca en la fase inicial del descubrimiento, permitiendo la validación del blanco mediante el análisis mecanicista de la extracción de proteínas, lo que orienta el desarrollo de ensayos para cascadas de cribado y apoya las decisiones de continuar o descartar basadas en la interacción con el blanco y la modulación de la vía.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre cómo el entorno lipídico y las características del sustrato influyen en la actividad ATPasa de Msp1 y en la eficiencia de extracción.
- Selección: Proporciona una plataforma reconstituida y cuantitativa para evaluar los efectos de compuestos sobre la extracción impulsada por ATPasa, con controles positivos y negativos definidos.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables—eficiencia de extracción mediante comparación por inmunotransferencia de las fracciones eluida y de entrada—que permiten comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se relaciona con relevancia preclínica al modelar una vía conservada de control de calidad cuya alteración se asocia con enfermedades humanas.
- Reutilización Empresarial: El sistema definido reconstituido en liposomas permite su reutilización en múltiples proyectos que estudian AAA-ATPasas, especificidad de sustratos o modulación dependiente de lípidos en la extracción.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de extracción de proteínas mediante un sistema simplificado y definido.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante componentes purificados y un protocolo escalonado (reconstitución, tratamiento con BioBead, pre-limpieza con chaperonas, extracción impulsada por ATP, elución con glutatión).
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al permitir una evaluación temprana del potencial de modulación del objetivo antes de realizar ensayos celulares o fenotípicos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos en el control de calidad mitocondrial al aclarar la responsabilidad mecanicista y la trazabilidad del objetivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la purificación de proteínas, la reconstrucción en liposomas y el diseño de ensayos de ATPasa.
- Depende del acceso a ultracentrífugas o PicoFuge para la formación de precipitados, columnas de glutatión en espín y bloques calefactores con control de temperatura.
- Necesita la estandarización de la composición lipídica, las relaciones proteína:lipido y la concentración de ATP entre laboratorios para lograr una eficiencia de extracción reproducible.
- La adaptación a otras proteínas TA u otras AAA-ATPasas puede requerir la optimización del tampón de reconstrucción, el tiempo de incubación y los pasos de deslipidación mediada por perlas.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en la señal del flujo directo y la dependencia de la sensibilidad del inmunotransferencia por Western blot para sustratos de baja abundancia, como se indica en la fuente.
