Name: In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende hibridación in situ optimizada para detectar expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo del mesonephros. Este método mejora la penetración de sondas y la visualización del riñón.

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La financiación fue proporcionada por la Academia de Ciencias de Pensilvania, y los Biólogos de la Mancomunidad de Pensilvania, y la Universidad de Indiana de Pensilvania (Escuela de Estudios de Posgrado e Investigación, Departamento de Biología y el Fondo de Biología de Pregrado Cynthia Sushak para la Excelencia). La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) fue proporcionada por el Dr. Neil Hukriede (Universidad de Pittsburgh).

El uso de larvas y juveniles de pez cebra está aprobado por el IUP IACUC (protocolo #02-1920, #08-1920). Los detalles del contenido de la solución se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cría de larvas
NOTA: Tomará hasta 21 días o más para elevar larvas y juveniles a la etapa de interés.
<ol><li>Configure el pez cebra adulto para que se aparee agregando 1 pez macho y 1 hembra en un tanque de apareamiento al final de la tarde después de su última comida. NOTA: No todas las parejas de peces se aparearán. Comience configurando 20 pares para determinar la tasa de apareamiento y ajuste en consecuencia en futuros experimentos.</li>
	<li>Al día siguiente, después de que los peces hayan terminado de aparearse (alrededor de la 1 pm), recoja los embriones con medio E3 en placas de Petri.<ol>
<li>Asegúrese de que no haya más de 30 embriones por placa.</li>
		<li>Retire los desechos (como las heces) de las placas de Petri y agregue 20 ml de medio E3.</li>
		<li>Incubar a 28,5 °C durante 1 día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a colocar al pez cebra adulto en el sistema acuático.</li>
	<li>A 1 dpf, reemplace el medio E3 por E3 fresco.<ol>
<li>Incubar a 28,5 °C durante 4 días más hasta 5 dpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque una pantalla de 400 μm en un tanque de 2.8 L y llénela con 2 cm de agua del sistema.<ol>
<li>Agregue las larvas de 5 dpf de 1 placa (hasta 30 larvas en total).</li>
		<li>Coloque el tanque en el sistema acuático, pero no inicie el flujo de agua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimente a las larvas con 4 ml de alimento en polvo dos veces al día hasta 14 dpf.</li>
	<li>A 6 dpf, inicie el flujo de agua a 1 goteo por segundo. NOTA: Verifique el flujo de agua diariamente y ajuste en consecuencia.</li>
	<li>A 8 dpf, aumente el flujo de agua a un flujo lento y constante.</li>
	<li>A 14 dpf, alimente camarones vivos de salmuera además del alimento en polvo.</li>
</ol>2. Día 1 - 2: Fijación de larvas
<ol><li>Retire un tanque de larvas en el punto de tiempo deseado.</li>
	<li>Llene una placa de Petri con 20 ml de agua del sistema.</li>
	<li>Use una red de malla fina para recoger suavemente las larvas y llevarlas a la superficie del agua.<ol>
<li>Corte la punta de una pipeta de transferencia para dar una abertura más ancha y transfiera las larvas a la placa de Petri. La boca de pipeta más grande permite la transferencia de varias larvas pequeñas o algunas más grandes a la vez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 2 ml de tricaína (2%, pH 7 stock) para inmovilizar las larvas.<ol>
<li>Después de que las larvas dejen de moverse, retire la mayor parte del agua y agregue 10 ml de tricaína. Espere 15 minutos para que las larvas sean sacrificadas.</li>
		<li>Opcional: Para juveniles de más de 8 mm, corte las cabezas y colas con una cuchilla de afeitar (después de la eutanasia) bajo un microscopio de disección para mejorar la penetración de la solución de fijación. Asegúrese de registrar la longitud total de cada animal antes de cortar la cabeza y la cola y aísle cada uno en su propia placa de Petri. Consulte el paso 3 para saber cómo medir a los animales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reemplace la tricaína con 20 ml de solución de fijación (4% de paraformaldehído, 1% de DMSO). Vuelva a colocar la tapa en la placa de Petri y mece lentamente en una campana extractora de humos. NOTA: Es importante utilizar una plataforma basculante. Una plataforma temblorosa con un movimiento circular hará que el eje del animal se curve. Use solo solución de fijación fresca (no congelada prefabricada). PRECAUCIÓN: La solución fijadora contiene paraformaldehído, que es un probable carcinógeno. Use campana extractora (o máscara) y guantes para medir el polvo.</li>
	<li>Después de 30 minutos, reemplace la solución de fijación con una solución de fijación nueva.<ol>
<li>Recoja la solución de fijación usada en un contenedor de residuos separado para su eliminación adecuada.</li>
		<li>Transfiera las larvas a un tubo de 50 ml que contenga 25 ml de solución de fijación fresca.</li>
		<li>Asegúrese de que la tapa esté apretada y se balancee lentamente a 4 ° C durante 2 días. Es posible incubar más tiempo para mayor comodidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Día 3: Medición de larvas
<ol><li>En una campana extractora de humos, reemplace la solución de fijación con 20 ml de PBST.</li>
	<li>Transfiera las larvas a una placa de Petri.</li>
	<li>Coloque una regla plana en un microscopio de disección y coloque la placa de Petri encima de la regla.</li>
	<li>Use un manipulador de pestañas para mover cada larva hacia la regla para medir su longitud total (desde el hocico hasta la punta de la aleta caudal) (Figura 1).</li>
	<li>Combine varias larvas de longitudes similares (por ejemplo, 5,0 mm y 5,1 mm) en un vial de vidrio de 5,5 ml, hasta 10 larvas por vial.</li>
</ol>4. Día 3 - 4: Deshidratación
<ol><li>Reemplace el PBST con 4 ml de 100% metanol. Balancee el vial durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace el metanol con metanol fresco y roca durante 5 min. Repite una vez más.</li>
	<li>Conservar el vial a -20 °C durante 2 días. Es posible incubar más tiempo para mayor comodidad.</li>
</ol>5. Día 5: Rehidratación
<ol><li>Caliente el vial a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace el metanol con 4 ml de metanol al 75%/25% PBST. Roca durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 5.2 con 4 ml de metanol al 50% / PBST al 50% y roca durante 5 min.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 5.3 con 4 ml de metanol al 25% / PBST al 75% y roca durante 5 min.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 5.4 con 4 ml de PBST y roca durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
</ol>6. Día 5: Digestión de la proteinasa K
<ol><li>Reemplace el PBST con 2 ml de la solución de proteinasa K (20 μg/mL, concentración final de DMSO al 1% en PBST) y roca a temperatura ambiente durante 30 min. NOTA: Las larvas de más de 6 mm necesitarán un tiempo de incubación más largo y/o una mayor concentración de proteinasa K. El tiempo exacto y la concentración deberán determinarse empíricamente. Comience con un aumento de 10 minutos en el tiempo de incubación por cada 0,5 mm más de 6 mm.</li>
	<li>Reemplace la solución de proteinasa K con 4 ml de PBST y roca durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de solución de fijación fresca y roca durante 1 h. Es posible incubar más tiempo a 4 ° C para mayor comodidad.</li>
</ol>7. Día 5: Blanqueamiento
<ol><li>Reemplace la solución de fijación con 4 ml de PBST y roca a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Transfiera las larvas a una placa de 6 pocillos (hasta 10 larvas por pozo).</li>
	<li>Reemplace el PBST con 3 ml de solución blanqueadora fresca.</li>
	<li>Roca a temperatura ambiente y controle la pigmentación bajo un microscopio de disección cada 5 minutos. Busque la desaparición de la pigmentación a lo largo de los mesonefros (dorsal a la vejiga natatoria y el intestino). NOTA: Para larvas de hasta 6 mm de largo, tomará hasta 20 minutos blanquear la pigmentación que rodea a los mesonephros. No blanquear más de lo necesario para preservar la integridad de las larvas.</li>
	<li>Transfiera las larvas de nuevo a un vial de vidrio.</li>
	<li>Reemplace la solución blanqueadora con 4 ml de PBST. Rock durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de solución de fijación fresca y roca durante 1 h. Es posible incubar más tiempo a 4 ° C para mayor comodidad.</li>
</ol>8. Día 5: Prehibridación
NOTA: Para los pasos realizados a 70 °C, es importante trabajar rápidamente para minimizar el enfriamiento del vial.
<ol><li>Reemplace la solución de fijación con 4 ml de PBST y roca a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de la solución Hyb- y roca a temperatura ambiente durante 10 min. PRECAUCIÓN: Las soluciones Hyb-, Hyb+ y sonda contienen formamida, que puede irritar la piel. Use guantes para manejar estas soluciones.</li>
	<li>Reemplace el Hyb- con 4 mL de Hyb- fresco y roca durante 10 min. Repite una vez más.<ol>
<li>Recoja las soluciones Hyb-, Hyb+ y sonda usadas en un contenedor de residuos separado para su eliminación adecuada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reemplace el Hyb- con 4 ml de la solución Hyb+.</li>
	<li>Incubar el vial a 70 °C durante la noche.</li>
	<li>Diluir la sonda EGFP-fluoresceína 1:100 en 500 μL de Hyb+ e incubarla O/N a 70 °C. NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para la síntesis de sondas.</li>
</ol>9. Día 6: Hibridación de sondas
<ol><li>Reemplace la solución Hyb+ en el vial con la sonda precalentada e incube a 70 °C durante la noche. NOTA: Las larvas de más de 6 mm necesitan 2 días de incubación.</li>
	<li>Precaliente el tampón de lavado, 2 soluciones SSCT y 0,2 x SSCT a 70 °C durante la noche.</li>
</ol>10. Día 7: Lavado de sonda
<ol><li>Reemplace la sonda con 4 ml del tampón de lavado precalentado e incube a 70 °C durante 30 min.<ol>
<li>Recoja la sonda usada en un contenedor de residuos separado para su eliminación adecuada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reemplace el tampón de lavado con 4 ml de tampón de lavado fresco e incube a 70 °C durante 30 min.</li>
	<li>Reemplace el tampón de lavado con 4 ml de la solución precalentada 2x SSCT e incube a 70 °C durante 15 min.</li>
	<li>Agregue 50 ml de SSCT 0.2x precalentado en un tubo de 50 ml.<ol>
<li>Inserte un colador celular (100 μm) en la parte superior del tubo. Asegúrese de que el colador celular se empuje hacia abajo hasta que se detenga.</li>
		<li>Transfiera las larvas del vial de vidrio al colador celular. Asegúrese de que las larvas estén sumergidas en el tampón e incuben a 70 °C durante 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare un tubo nuevo que contenga 50 ml de SSCT 0.2x precalentado.<ol>
<li>Transfiera el colador celular del paso 10.4.2 al nuevo tubo de 0.2x SSCT e incube a 70 °C durante 2 h.</li>
		<li>Repita el paso 10.5 una vez más.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Día 7: Bloqueo
<ol><li>Transfiera las larvas a un nuevo vial de vidrio y enfríe a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace el SSCT 0.2x con 4 mL de 67% 0.2x SSCT / 33% MABT y roca a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 11.2 con 4 ml de 33% 0.2x SSCT / 67% MABT y roca durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 11.3 con 4 ml de MABT y roca durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el MABT con 4 ml de MABT fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el MABT con 4 ml de la solución de bloqueo e incube a 4 °C durante la noche. Es posible incubar más tiempo para mayor comodidad.</li>
</ol>12. Día 8 - 9: Incubación de anticuerpos
<ol><li>Diluir el anticuerpo anti-fluoresceína 1:5.000 en una solución de bloqueo de 500 μL.</li>
	<li>Reemplace la solución de bloqueo con la solución de anticuerpos e incube a 4 °C durante 2 días. Es posible incubar más tiempo para mayor comodidad.<ol>
<li>Gire el vial dos veces al día para agitar las larvas. NOTA: Las larvas de más de 6 mm necesitan 1-2 días más de incubación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Día 10 - 11: Lavado de anticuerpos
<ol><li>Reemplace la solución de anticuerpos con 4 ml de PBST y roca a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Transfiera las larvas a un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 40 ml de PBST2. Coloque el tubo de lado y mezca a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Reemplace el PBST2 con 40 ml de PBST2 fresco y roca a 4 ° C durante la noche. Es posible incubar más tiempo para mayor comodidad. NOTA: Las larvas de más de 6 mm necesitan 1-2 días más de lavado.</li>
</ol>14. Día 12: Tinción
<ol><li>Transfiera las larvas a una placa de 6 pocillos.</li>
	<li>Reemplace el PBST2 con 3 ml de tampón de tinción y roca a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Reemplace el tampón de tinción con 3 ml de tampón de tinción fresco y roca durante 5 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el tampón de tinción con 3 ml de la solución de tinción. Cubra con papel de aluminio y controle la tinción durante las próximas horas.<ol>
<li>Para sondas con una señal débil, incube a 4 °C durante la noche y reemplace la solución de tinción con una solución de tinción fresca una vez en el medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando se alcance la intensidad de tinción deseada, reemplace la solución de tinción con 3 ml de la solución de parada y la roca durante 30 min.</li>
	<li>Reemplace la solución de parada con 3 ml de solución de parada fresca y roca durante 30 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Transfiera las larvas a un nuevo vial de vidrio y reemplace la solución de parada con 4 ml de solución de fijación fresca e incube durante 1 h a temperatura ambiente. Es posible incubar más tiempo a 4 ° C para mayor comodidad.</li>
	<li>Almacene las larvas en la solución de fijación en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de un año.</li>
</ol>15. Día 12: Imágenes
<ol><li>Reemplace la solución de fijación con 4 ml de PBST y roca a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera las larvas a una placa de 6 pocillos.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 4 ml de PBST fresco y roca durante 10 minutos. Repite una vez más.</li>
	<li>Reemplace el PBST con 3 ml de glicerol al 50% (en PBST) y roca durante 10 min.</li>
	<li>Reemplace la solución en el paso 15.4 con 3 ml de glicerol al 100% sin balanceo durante 10 min.</li>
	<li>Use un microscopio de disección para obtener imágenes de las larvas directamente en la placa de 6 pocillos o transfiera las larvas a un portaobjetos de depresión a la imagen bajo un microscopio compuesto. Use un manipulador de pestañas para orientar las larvas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El método de hibridación in situ descrito aquí está dirigido a estudiar el desarrollo de mesonephros. Sin embargo, se puede aplicar para estudiar el desarrollo de otros tejidos y órganos durante la metamorfosis, como el intestino, el sistema nervioso, las escamas y la pigmentación14. Se pueden generar sondas para genes endógenos o marcadores fluorescentes en líneas transgénicas.
Es fundamental que las larvas permanezcan intactas para observar los órganos y teji...

El embrión de pez cebra es un modelo importante para estudiar el desarrollo tisular debido a su pequeño tamaño, transparencia, herramientas disponibles y supervivencia sin alimentación hasta por cinco días1,2. Ha contribuido en gran medida a la comprensión del desarrollo renal y la conservación entre el pez cebra y los mamíferos3,4,5. El riñón juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis de líquidos, filtrando la sangre y excretando desechos6. La nefrona, la unidad funcional del riñón, comprende un filtro de sangre conectado a un túbulo largo. En el pez cebra, se forman dos estructuras renales a lo largo de su vida. El pronephros (el riñón embrionario temporal) se forma primero durante el desarrollo temprano. Consiste en dos nefronas que corren a lo largo del eje anterior-posterior y se vuelve funcional alrededor de los 2 días posteriores a la fertilización (dpf). La utilidad del pronephros radica en su simplicidad, teniendo solo dos nefronas que son en su mayoría lineales y fáciles de visualizar (aunque el túbulo contorneado proximal comienza a enrollarse a tres dpf)3. Esto ha facilitado no solo los estudios de su desarrollo temprano a partir del mesodermo intermedio, sino también el patrón de segmentación y reparación de túbulos7,8.
La utilidad del pez cebra se limita después de cinco dpf, cuando la yema disminuye y las larvas dependen de la alimentación en el sistema acuático9. Alrededor de las 2 semanas de edad, las larvas sufren metamorfosis en juveniles, donde se forman nuevos tejidos y se pierden y/o reorganizan tejidos viejos9. Esto es también cuando se forma el mesonephros (el riñón adulto permanente)10,11,12. La primera nefrona adulta se forma cerca del sexto somita, y se fusiona con el túbulo temprano distal del pronephros. Las nefronas adicionales se agregan después de esta posición inicialmente, pero también hacia la anterior más adelante. Las nefronas primarias en esta primera ola se fusionan con los túbulos de los pronefros y comparten un lumen común para depositar sus desechos. Las nefronas secundarias se forman en la siguiente ola y se fusionan con las nefronas primarias. Este proceso reiterativo crea un mesonephros que está ramificado, algo similar al riñón de los mamíferos. Presumiblemente, el pronephros eventualmente pierde su identidad de túbulo y se convierte en dos conductos colectores principales donde todas las nefronas drenan sus desechos13.
Antes de la formación de la primera nefrona adulta, las células progenitoras individuales comienzan a aparecer en larvas de ~ 4 mm (longitud total) (~ 10 dpf). Estas células, que están marcadas en la línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP), se adhieren a los pronephros y parecen migrar a futuros sitios de nefrogénesis. Las células individuales se unen en grupos, que se diferencian en nuevas nefronas12. No está claro dónde residen estas células o qué genes expresan antes del inicio de la mesonefrogénesis.
Comprender el desarrollo de los mesonephros proporciona información sobre el riñón de los mamíferos de maneras que los pronephros no pueden. Estos incluyen la formación de agregados nefrogénicos a partir de células progenitoras individuales, la integración funcional de nuevas nefronas con las existentes y la morfogénesis ramificada. Sin embargo, existen limitaciones para estudiar el desarrollo postembrionario. Las larvas son menos transparentes debido a su mayor tamaño y a que tienen pigmentación. La línea de tiempo del desarrollo no es sincrónica entre los animales individuales y depende en gran medida de factores ambientales, como la alimentación y el hacinamiento9,14. Aunque existen reactivos de derribo, son menos efectivos en larvas en comparación con embriones15. En este protocolo, se describe un método de hibridación in situ para determinar la expresión génica durante el desarrollo del pez cebra mesonephros. Se optimizan varios pasos para aumentar la visualización de los mesonefros y la penetración y el lavado de la sonda y el anticuerpo. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza junto con una sonda para EGFP para etiquetar células progenitoras individuales, agregados nefrogénicos y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este método proporcionará una comprensión más profunda del desarrollo de mesonephros y una visión de las terapias regenerativas.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo antifluoresceína</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> blanqueadora <td>0,8% KOH, 0,9% H2O2 en PBST</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Úselo para la solución de bloqueo, prepárese de acuerdo con las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 22-363-549</td><td>100 &mu; m</td></tr><tr><td>E3 medio</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001% azul de metileno</td></tr><tr><td>Manipulador de pestañas</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1083208</td><td>Uso para manipular larvas</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de fijación <td>4% paraformaldehído, 1% DMSO en PBS; calentar a 65 grados; C mientras agita hasta que el polvo se disuelva, luego agregue DMSO después de que se enfríe</td></tr><tr><td>Síntesis de sonda de fluoresceína</td><td>11685619910</td><td></td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Frasco de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr><tr><td>Encapsulación Hatchfry</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyb- solución</td><td></td><td></td><td>50% formamida, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>Hyb+ solución</td><td></td><td></td><td>HYB-, 5 mg/mL de ARN de torula, 50 ug/mL de heparina</td></tr><tr><td>MAB (10X)</td><td></td><td></td><td>1 M de ácido maleico, 1,5 M de NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>1X MAB, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td></td><td></td><td>8% NaCl, 0,2% KCl, 1,44% Na2HPO4, 0,24% KH2PO4</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBST2</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td></tr><tr><td>Alimento</td><td></td><td></td> en polvo <td>Mezcle 2 g de espirulina y encapsulón de hatchfry en 50 mL de agua del sistema de peces y agite bien</td></tr><tr><td>la proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5568</td><td>Uso para permeabilizar larvas</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> <td>de proteinasa K20&nbsp; &mu; g/mL, 1% DMSO concentración final en PBST</td></tr><tr><td>Polvo microfino de espirulina</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 0,3 M acetato de sodio anhidro, pH 7, autoclave</td></tr><tr><td>SSCT (0,2X)</td><td></td><td></td><td>Diluido a partir de 20X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (2X)</td><td></td><td></td><td>Diluido a partir de 20X SSC, 0,1% Tween-20 Tampón</td></tr><tr><td>de tinción</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de tinción</td><td>200 &mu; g/mL de cloruro de yodonitrotetrazolio, 200 &mu; g/mL 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato sal disódica, en tampón de tinción</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de parada <td>1 mM EDTA, pH 5,5, en PBST</td></tr><tr><td>Torula (levadura) ARN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>2%, pH 7</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado <td>50% formamida, 2X SSC, 0,1% Tween-20</td></tr></tbody></table>

in situ hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

El pez cebra forma dos estructuras renales en su vida. El pronephros (riñón embrionario) se forma durante el desarrollo embrionario y comienza a funcionar a los 2 días después de la fertilización. Compuesto por solo dos nefronas, el pronephros sirve como el único riñón durante la vida larvaria hasta que se requiere más función renal debido al aumento de la masa corporal. Para hacer frente a esta mayor demanda, el mesonephros (riñón adulto) comienza a formarse durante la metamorfosis. Las nuevas nefronas primarias se fusionan con los pronefros y forman lúmenes conectados. Luego, las nefronas secundarias se fusionan con las primarias (y así sucesivamente) para crear una red de ramificación en los mesonephros. La gran mayoría de la investigación se centra en los pronephros debido a la facilidad de uso de embriones. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas para estudiar larvas y peces juveniles más viejos y más grandes para comprender mejor el desarrollo de los mesonephros. Aquí, un protocolo de hibridación in situ para el análisis de expresión génica está optimizado para la penetración de la sonda, el lavado de sondas y anticuerpos, y el blanqueo de pigmentos para visualizar mejor los mesonephros. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza para etiquetar las células progenitoras y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este protocolo llena un vacío en la investigación de mesonephros. Es un modelo crucial para comprender cómo se forman e integran los nuevos tejidos renales con las nefronas existentes y proporcionar información sobre las terapias regenerativas.

Utilizando la línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP), se demostró que este protocolo de hibridación in situ es efectivo en el etiquetado de células progenitoras renales y diversas estructuras de nefrona durante el desarrollo de mesonephros. Como era de esperar, el sistema nervioso central también está etiquetado en esta línea transgénica (no se muestra). La nefrona mesonéfrica inicial se forma a aproximadamente 5,2 mm, dorsal al pronephros (Figura 2A), y el túbulo distal de esta ...

El pez cebra es un modelo importante para comprender el desarrollo renal. Aquí, se optimiza un protocolo de hibridación in situ para detectar la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros.

In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Este protocolo es significativo porque permite la determinación de la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra más viejos durante la metamorfosis. La ventaja de esta técnica es que se han optimizado varios pasos para la penetración de la sonda y la visualización del riñón. Para comenzar, configure el pez cebra adulto para que se aparee agregando un pez macho y una hembra en un tanque de apareamiento al final de la tarde después de su última comida.Al día siguiente, recoge los embriones en placas de Petri que contengan medio E3. Cinco días después de la fertilización, coloque una pantalla de 400 micrómetros en un tanque de 2.8 litros y llénelo con 2 centímetros de agua del sistema. Luego agregue la larva de una placa de Petri.Para fijar la larva, retire un tanque de larva en el punto de tiempo deseado, luego, usando una red y una pipeta de transferencia con su punta cortada, transfiera la larva a la placa de Petri. A continuación, agregue dos mililitros de 2% de tricaína para inmovilizar la larva. Después de la inmovilización, reemplace la tricaína con 20 mililitros de solución de fijación.Después de 30 minutos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución de fijación fresca. Luego, asegurándose de que la tapa esté apretada, balancee lentamente el tubo a cuatro grados centígrados durante dos días. En el tercer día, reemplace la solución de fijación con 20 mililitros de PBST y luego transfiera la larva a una placa de Petri.Para medir la larva, coloque la placa de Petri encima de una regla plana bajo un microscopio de disección, luego, usando un manipulador de pestañas, mueva cada larva sobre la regla para medir su longitud total. Después de medir todas las larvas, combine varias larvas de longitudes similares en un vial de vidrio de 5,5 mililitros con PBST. Para la deshidratación, reemplace el PBST en el vial de vidrio con cuatro mililitros de metanol al 100%, luego guarde el vial a menos 20 grados Celsius durante dos días.Para la rehidratación, reemplace el 100% de metanol con cuatro mililitros de una solución de 75% de metanol y 25% de PBST y mueva el vial durante cinco minutos. Luego, reemplace la solución de metanol y PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el vial durante 10 minutos. Para la digestión de la proteinasa K, reemplace el PBST con dos mililitros de una solución de proteinasa K y mueva el vial a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, para el blanqueamiento, transfiera la larva a una placa de seis pocillos y reemplace el PBST con tres mililitros de solución blanqueadora fresca. Después de la desaparición completa de la pigmentación a lo largo de los mesonephros, transfiera la larva de nuevo a un vial de vidrio, reemplace la solución blanqueadora con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos. Para la predihridación, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos, luego, reemplace el PBST con cuatro mililitros de Hyb-solution y roca durante 10 minutos.Después de dos incubaciones adicionales en la solución Hyb, reemplace la solución con cuatro mililitros de la solución Hyb +. Diluya simultáneamente la sonda de fluoresceína EGFP de uno a 100 en 500 microlitros de hibridación más solución, e incube el vial y la sonda a 70 grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, para hibridar la sonda, reemplace la solución Hyb+ en el vial con la sonda precalentada e incube a 70 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, agregue 50 mililitros de SSCT precalentado 0.2 veces en un tubo de 50 mililitros. Luego, inserte un colador celular de 100 micrómetros en la parte superior del tubo, transfiera la larva del vial de vidrio al colador celular y, asegurándose de que la larva esté sumergida en el tampón, incube el vial a 70 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, transfiera el colador celular a un nuevo tubo que contenga 0,2 veces SSCT precalentado e incube de nuevo a 70 grados centígrados durante dos horas.A continuación, para el bloqueo, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Luego, reemplace la solución de SSCT 0.2 veces con cuatro mililitros de una solución de SSCT al 67%0.2 veces y una solución de MABT al 33% y balancee el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, reemplace la solución SSCTT MABT con cuatro mililitros de MABT fresco e incube el vial en un balancín durante 10 minutos.Luego, reemplace el MABT con cuatro mililitros de solución de bloqueo e incube cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reemplace la solución de bloqueo con una solución de anticuerpos e incube a cuatro grados centígrados durante dos días. Para el lavado de anticuerpos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros, luego agregue 40 mililitros de PBST2 y coloque el tubo tendido de lado para la incubación nocturna a cuatro grados centígrados.El día 12, después de transferir la lava a una placa de seis pocillos, reemplace el PBST2 con tres mililitros de tampón de tinción. Después de una incubación de cinco minutos en un balancín, reemplace el tampón de tinción con tres mililitros de la solución de tinción. Cuando se alcance la intensidad de tinción deseada, reemplace la solución de tinción con tres mililitros de la solución de parada y roca durante 30 minutos.Luego, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio, reemplace la solución de parada con cuatro mililitros de solución de fijación fresca e incube durante una hora a temperatura ambiente. Para la obtención de imágenes, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST fresco. Después de una incubación de 10 minutos en un balancín, transfiera la larva a una placa de seis pocillos, luego reemplace el PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el plato durante 10 minutos.A continuación, agregue tres mililitros de glicerol al 50% en PBST y roca durante 10 minutos, luego, usando un microscopio de disección, obtenga una imagen de la larva directamente en la placa de seis pocillos. Este protocolo de hibridación in situ etiqueta eficazmente las células progenitoras renales y varias estructuras de nefrona utilizando el desarrollo de mesonephros. La nefrona mesonéfrica inicial se forma a aproximadamente 5,2 milímetros dorsales de los pronefros.Los grupos de células progenitoras están presentes durante el desarrollo de mesonephros, además de las células progenitoras individuales. En los juveniles más grandes, la tinción de fondo puede ocurrir en los somitas. En general, este método se puede utilizar para estudiar otros tejidos que se forman durante la metamorfosis, además de los órganos adultos disecados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

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In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

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