Name: Interrogatorio de mecanobiología totalmente óptica de proteína asociada a sí en cáncer humano y células normales utilizando un sistema multifuncional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprende a investigar la mecanosensibilidad de YAP en células de cáncer humano y normales mediante un sistema óptico multifuncional automatizado. Este protocolo permite adquisición de imágenes multiposición de larga duración.

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Este proyecto cuenta con el apoyo financiero del Cancer Pilot Award de UF Health Cancer Center (X. T. y D. S.) y el Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Los autores aprecian sinceramente las discusiones intelectuales y los apoyos técnicos del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), el Dr. Rolf Renne (UFHCC), el Dr. Ji-Hyun Lee (Bioestadística, UF), el Dr. Hugh Fan (MAE, UF), el Dr. Warren Dixon (MAE, UF), el Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), el Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), el Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), el Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Universidad de Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Universidad Politécnica de Hong Kong) y el Equipo de Apoyo de Nikon (Dres. José Serrano-Vélez, Larry Kordon y Jon Ekman). Los autores están profundamente agradecidos por el apoyo generoso y efectivo de todos los miembros de los laboratorios de investigación de Tang, Siemann y Guan y todos los miembros del personal de mae & ECE & Physics & Radiation Oncology Departments, UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+force+and+motion+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal force and motion in collective cell migration.</a> Scientific Data. 7 (1), 197(2020).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Tulpule, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-mediated+RAS+signaling+via+membraneless+cytoplasmic+protein+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules.</a> Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).</li>
<li>Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+traction+force+microscopy+to+study+multi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system.</a> PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+split+fluorescent+proteins+for+endogenous+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.</a> Nature Communications. 8, 370(2017).</li>
<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
<li>Micro-Manager. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2">https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
<li>Okumurai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+generalization+of+Cerruti%27s+problem+in+an+elastic+half-space%5BTitle%5D)+AND+%22Doboku+Gakkai+Ronbunshu%22%5BJournal%5D)">On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space.</a> Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Hong, W. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YAP+and+TAZ+transcription+co-activators%3A+Key+downstream+effectors+of+the+mammalian+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+roots+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the roots of cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+yes-associated+protein+contributes+to+progression+and+poor+prognosis+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer.</a> Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+YAP+suppresses+CML+cell+proliferation+and+enhances+efficacy+of+imatinib+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically-induced+colon+cancer+cell+population+shows+increased+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential.</a> Molecular Cancer. 13, 131(2014).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
<li>Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+redistribution+mediated+by+nuclear+deformation+determines+dynamic+localization+of+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+regulates+cellular+mechanical+states%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Migration regulates cellular mechanical states.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+nucleus+and+cell+migration+through+the+perinuclear+actin+cap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que declarar.

El proceso de obtención de imágenes (paso 6.3) es fundamental para garantizar que las imágenes de fluorescencia sean de calidad suficientemente buena para obtener resultados de cuantificación válidos. Las imágenes z-stack de proteínas fluorescentes o perlas deben tener un rango z que sea lo suficientemente grande como para incluir las imágenes enfocadas para todas las posiciones Z que abarca la muestra. Otro paso crítico es recolectar las imágenes de referencia de las perlas fluorescentes después de disolver las células (paso 6.5). Debido a que las imágenes de referencia deben tomarse en las mismas posiciones en el paso 6.3, no se debe inducir ningún desplazamiento relativo entre la placa de Petri, la cámara de ambiente y el microscopio. Los investigadores que realizan el paso de disolución deben tener cuidado de quitar la tapa de la placa de Petri y asegurarse de que la perturbación mecánica aplicada no sea lo suficientemente grande como para alterar la ubicación de la placa en la cámara de ambiente.
A continuación se proporcionan soluciones para resolver algunos errores que pueden ocurrir durante los experimentos. Si no se activa ninguna macro después de hacer clic en Entrar en el paso 6.4, lo más probable es que se deba a que el área inferior izquierda de la pantalla está ocupada por una ventana que no es elemento. En tal caso, el área inferior izquierda de la ventana debe borrarse para que las macros se puedan activar en Elements. Otro error común es que las imágenes de campo brillante aparecen negras. Este problema es causado por un intervalo de tiempo insuficiente entre las adquisiciones de fluorescencia y las imágenes de campo brillante. Los ligeros retrasos en el conteo del tiempo de imágenes de fluorescencia pueden acumularse con el tiempo y causar retrasos considerables e interferir con las imágenes de campo brillante. Una solución es ajustar la duración de un ciclo de imágenes de todas las posiciones para que sea menor que (no igual a) el intervalo de tiempo entre el inicio de movimientos consecutivos. Esta operación actualiza el conteo de tiempo y elimina el error acumulativo al comienzo de cada ciclo de imágenes.
Esta tecnología de interrogación totalmente óptica admite (1) una amplia gama de hardware / software, que incluye, entre otros, Nikon, (2) diversos tipos de sistemas de hidrogel validados, incluidos geles de gelatina, PEG, Matrigel y colágeno I, y (3) la personalización programable basada en diferentes necesidades de los investigadores. Sin embargo, si alguna de las funciones de control de nivel inferior no está disponible en un microscopio comercial, la personalización de las funciones utilizando AMFIP se convierte en un desafío. Otra limitación de esta técnica es la deriva espacial de la muestra tanto en el plano XY como en el de enfoque (Z). Aunque esta limitación se puede superar durante el post-procesamiento de las imágenes, es esencial mejorar la función de autoenfoque para corregir la deriva en tiempo real de las muestras. Esta mejora aumentará el rendimiento del proceso de obtención de imágenes y reducirá el error potencial causado por la deriva durante los experimentos.
Los mecanotransductores, como el YAP, pueden servir como nuevas dianas terapéuticas para el desarrollo de prometedoras terapias contra el cáncer25,26,27. Los datos emergentes sugieren que YAP promueve la proliferación e invasión de células cancerosas. La translocación YAP inducida por la mecánica del citoplasma al núcleo activa la transcripción de genes relacionados con la migración celular, proliferación, invasión y apoptosis, dando lugar a comportamientos celulares aberrantes28,29,30,31. Este trabajo tuvo como objetivo explorar la correlación potencial de la relación YAP N / C y la mecánica celular en dos líneas celulares típicas de cáncer de pulmón humano y líneas celulares normales. Durante el período de propagación celular de 10 h, las células PC9 muestran concentraciones similares de YAP en el núcleo y el citoplasma (Figura 3D y Figura 5A). Las células B2B muestran una mayor concentración de YAP en el núcleo que en el citoplasma (Figura 3C y Figura 5A). Esta relación encontrada durante la etapa de propagación temprana es diferente de la mayoría de los hallazgos publicados que comparan la concentración de YAP en el núcleo entre las células normales y las cancerosas. Aunque no necesariamente en la etapa de propagación temprana, la mayoría de los hallazgos publicados muestran que la YAP está más concentrada en el núcleo de las células cancerosas que en el núcleo de las células normales27,28. Solo un estudio sobre el cáncer de mama reportó una excepción32 que muestra que la YAP está más concentrada en el citoplasma, lo que concuerda con nuestras observaciones actuales realizadas en células PC9 de cáncer de pulmón. Según el mejor conocimiento de los autores, este trabajo es el primero en mostrar una relación YAP N / C más baja en una línea celular de cáncer de pulmón humano. Los autores plantean la hipótesis de que la razón de una relación YAP N / C estable en las células PC9 podría deberse a la baja variación en el área de propagación de la célula / núcleo y la tracción en las células PC9 en la etapa temprana de propagación. La disección de los mecanismos moleculares subyacentes de la baja relación YAP N/C en células PC9 y B2B está en curso.
Durante las primeras 10 h de propagación, estas dos líneas celulares muestran una relación distinta entre la relación YAP N/C, la tracción celular y el área de propagación (Figura 5). Para las células B2B, una mayor relación YAP N/C se correlaciona con un área de propagación celular y núcleo más alta (Figura 6A,B), lo que es consistente con los datos reportados de otras células normales33. Curiosamente, aunque la tendencia de desarrollo de esta relación se encuentra generalmente en todas las células B2B registradas, se encuentran dos grados diferentes (alto y bajo) de esta relación. Las células B2B que se propagan y migran simultáneamente muestran una menor tracción y un área de propagación celular y núcleo más alta con una relación YAP N/C más alta (2.05 ± 0.32). Para las células B2B que se propagan y permanecen en el mismo lugar, muestran una mayor tracción y un área de propagación celular y núcleo más baja con una relación YAP N / C más baja (1.74 ± 0.21). Estos dos grados de relaciones se demuestran en los grupos de datos dispersos bifurcados (Figura 6C,D). Como se informó en la literatura, las células normales estacionarias, como las células NIH 3T3 de fibroblastos embrionarios, tienen mayor tracción que las células migratorias34. Los datos reportados en este documento sugieren que las células B2B que se propagan y no migran aplicaron una tracción más alta que las células B2B que se propagan y migran, lo que probablemente sugiere que se necesita una alta tracción para que las células no migratorias se estabilicen en el sustrato.
Además, estos datos muestran que las células B2B normales estacionarias generan una mayor fuerza perinuclear, mientras que investigaciones anteriores realizadas por otros investigadores informaron solo una mayor tracción celular generada en la periferia de las células estacionarias34,35,36,37. Los autores piensan que la diferencia en la tendencia intrínseca de la migración en los experimentos podría causar estos resultados contradictorios. En los experimentos publicados, se había utilizado el micropatronaje de forma cuadrada para confinar la propagación de células individuales e inhibir la migración; se desconoce si las células tenían la tendencia a migrar. Como las células migratorias a menudo muestran una alta fuerza de tracción en la periferia de las células38, es probable que las células con tendencia a migrar aún mantengan una alta tracción periférica a pesar de que su migración está restringida. En este estudio, las células estacionarias no están restringidas por ningún micropatrón, pero no migran, lo que indica que las células tienden a mantener su estado no migratorio. Otra posibilidad es que la forma celular definida por el micropatrones pueda afectar a la distribución de las adherencias focales y las fuerzas de tracción39. Los resultados de este estudio se generaron sin ningún micropatronaje confinante y representan la distribución de la fuerza de las células estacionarias en su forma original.
Hasta la fecha, sólo una publicación hasta la fecha informó específicamente del hallazgo de fuerzas perinucleares en células normales (fibroblastos embrionarios de ratón), potencialmente causadas por la tapa de actina que se extiende a través del núcleo40. La translocación del citoplasma al núcleo del YAP se correlaciona con el aumento de la fuerza perinuclear40. Una búsqueda exhaustiva de la literatura relevante no arrojó ninguna publicación que informe una fuerza perinuclear o la tapa de actina en las células cancerosas. Un estudio indirecto sobre células cancerosas de melanoma demostró que el borde de actina (otra organización de actina perinuclear ubicada alrededor pero no cubriendo el núcleo) reduce las tasas de migración celular41, lo que sugiere indirectamente la existencia de una fuerza perinuclear. Sin embargo, no se reportan datos experimentales directos. En este estudio, los autores encontraron que tanto las células PC9 como las B2B muestran desplazamiento y tracción perinuclear. Los mecanismos de generación de las fuerzas perinucleares y sus efectos siguen siendo controvertidos. En células normales, se ha informado que la tapa de actina desempeña un papel en la regulación de la morfología del núcleo y la organización de la cromatina42, transmitiendo señales mecánicas de adherencias focales al núcleo a través de enlazadores del complejo de nucleoesqueletos y citoesqueletos (LINC)43, y regulando la migración celular44. Lamin A/C está relacionado con la formación e interrupción de la actina cap40,41,42,43,44. Sin embargo, el informe que afirmaba que la tapa de actina genera una fuerza perinuclear no consideraba el papel potencial de la acción rim40. En las células cancerosas, la sobreexpresión de Lamin A facilita la formación de un borde de actina y restringe la migración de células cancerosas. La sobreexpresión de Lamin B reduce la formación del borde de actina y promueve la migración. La fuerza perinuclear podría estar involucrada en este proceso debido a la existencia de la organización de la actina perinuclear y el efecto de Lamin A. Sin embargo, los resultados de este estudio no mostraron ninguna evidencia de fuerzas perinucleares medidas o el comportamiento de la tapa de actina. Por lo tanto, el descubrimiento de fuerzas perinucleares en células PC9 en este estudio es el primer informe que muestra fuerzas y desplazamientos perinucleares en células de cáncer de pulmón. Los autores están investigando actualmente los mecanismos moleculares y las funciones de las fuerzas perinucleares en células PC9 y B2B diseñadas por CRISPR / Cas9.
Más allá del interrogatorio de mecanobiología totalmente óptico que se demuestra en este artículo, el sistema multifuncional integrado se puede aplicar para sondear ópticamente una miríada de otras señales fisiológicas y patobiológicas esenciales en sistemas vivos. Por ejemplo, el laboratorio de los autores ha establecido recientemente múltiples líneas celulares de cáncer humano transducidas de manera estable que coexpresan tres proteínas de membrana sensibles a la luz: indicador de voltaje de membrana QuasAr2 (excitación: 640 nm; emisión: 660 nm-740 nm), despolarizador de voltaje de membrana CheRiff (excitación: 488 nm) e hiperpolarizador de voltaje de membrana eNpHR3 (excitación: 590 nm). Estas tres proteínas funcionales pueden ser activadas por líneas láser de espectro-ortogonal de una manera libre de diafonía, lo que permite comunicaciones de señalización bidireccional totalmente ópticas (lectura y control) de electrofisiología de membrana. Utilizando un sistema optoelectrónico integrado y una pinza de parche manual, los autores han validado el control totalmente óptico y la lectura del voltaje de membrana (Vm) en células cancerosas humanas individuales y esferoides tumorales multicelulares. El interrogatorio de electrofisiología totalmente óptica abre la posibilidad de exploraciones detalladas de la bioelectricidad previamente inaccesible en las células cancerosas, lo que puede ayudar a avanzar en la biología tumoral desde un nuevo eje.

El objetivo general de este método es permitir imágenes multifuncionales totalmente ópticas y análisis de células vivas. Un programa de imágenes todo en uno que permite la coordinación automática de dispositivos optoelectrónicos multifuncionales reducirá las operaciones manuales intensivas en mano de obra y propensas a errores y es esencial para que los investigadores realicen imágenes de células vivas a largo plazo1,2,3,4. Sin embargo, la mayoría de los programas públicos existentes en la comunidad de investigación biomédica solo se aplican a dispositivos optoelectrónicos limitados o requieren hardware adicional para la coordinación de diferentes equipos5,6,7,8,9. Recientemente, se ha desarrollado un programa de código abierto y basado en software, titulado "Programa de integración multifuncional automática (AMFIP)", que permite imágenes multicanal y de lapso de tiempo. Basado en el lenguaje Java y la interfaz de programación de aplicaciones (API) de μManager11,12, AMFIP se desarrolló como un complemento en μManager que ejecuta scripts Java personalizados para lograr comunicaciones basadas en software de múltiples plataformas de hardware y software optoelectrónicas, incluidas, entre otras, las de Nikon. El establecimiento de AMFIP abre la posibilidad de interrogatorio programable y multifuncional de comportamientos celulares. En este documento se desarrolla un sistema experimental y computacional integrado que combina AMFIP con análisis de imágenes digitales y microscopía de fuerza de tracción celular. El sistema permite la elucidación de la mecanobiología YAP distinta en líneas celulares B2B normales humanas (Figura 1) y cáncer de pulmón PC9 (Figura 2) diseñadas por CRISPR / Cas9. El sistema proporciona a la comunidad científica una solución integral que evita la demanda de comprar dispositivos de control adicionales que pueden no estar disponibles y / o compatibles con todos los sistemas de imágenes.
Los protocolos presentados en este documento presentan cómo (1) aplicar AMFIP para realizar imágenes automáticas a largo plazo para ambas líneas celulares de ingeniería CRISPR / Cas9 que expresan YAP etiquetado con mNEonGreen2; y (2) combinar Fiji ImageJ, MATLAB y Origin para el análisis cuantitativo de la relación nuclear/citoplasma (N/C) de YAP basada en su intensidad fluorescente (Figura 3 y Figura 4), campo de desplazamiento celular (Figura 1C y Figura 2C) y campo de tracción celular (Figura 1D y Figura 2D ). Los resultados sugieren que (1) durante las primeras 10 h de propagación celular sobre los sustratos que tienen rigidez mecánica fisiológicamente relevante13,14,15,16,17,18, la relación YAP N/C de células B2B individuales muestra una variación y fluctuación dependiente del tiempo más notable en comparación con la de las células PC9 individuales (Figura 5 y Figura 6 ); y (2) las células cancerosas PC9 generan una tracción notable en sus regiones perinucleares (Figura 7). El sistema integrado y las metodologías descritas en este protocolo trascienden los tipos específicos de células y moléculas optogenéticas. Los investigadores pueden aplicar los protocolos para personalizar sus experimentos específicos de interrogación de células vivas y dilucidar la dinámica de señalización multifacética en el contexto de la fisiología y la patología celular.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Centrífuga de sobremesa</td><td>Sistema</td><td></td> confocal Thermo 75007210 <td></td></tr><tr><td>A1R</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>acéticoSigma-aldrich</td><td>695092</td><td>glacial, reactivo ACS, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Células BEAS-2B (B2B)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>células epiteliales humanas a partir de tejido pulmonar</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas con carboxilato</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador de sobremesa</td><td>Dell</td><td>2018</td><td>con sistema operativo Windows 10</td></tr><tr><td>Cámara ambiental TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína humana, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Institutos Nacionales</td><td>de Salud y el Laboratorio de Instrumentación Óptica y Computacional</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponado solución salina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidrato de hidracina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Plataforma de desarrollo</td></tr><tr><td>Java Kit de desarrollo Java</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monocromático&nbsp; Cámara</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Kit de detección de micoplasma</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Solución de metilenebisacrilamida</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de software NIS-Elements Plataforma de software Nikon</td><td></td><td>4.50</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td><td>análisis de datos y software de representación gráfica</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>células PC9</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>células de adenocarcinoma humano&nbsp; de tejido pulmonar</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td> ADN <td>polimerasa de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>Scotch Cinta adhesiva</td><td>Scotch</td><td></td></tr><tr><td>Solución de dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Super pegamento</td><td>Gorilla</td><td></td><td>Pegamento de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Ti2-E Microscopio invertido</td><td>Nikon MEA54000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Platina motorizada con codificador</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager</td><td></td><td>versión 2.0</td><td>software de microscopía gamma de código abierto (https://micro-manager.org/)</td></tr></tbody></table>

interrogatorio de mecanobiología totalmente óptica de proteína asociada a sí en cáncer humano y células normales utilizando un sistema multifuncional

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Las imágenes multifuncionales a largo plazo y el análisis de células vivas requieren una coordinación funcional y optimizada de varias plataformas de hardware y software. Sin embargo, el control manual de varios equipos producidos por diferentes fabricantes requiere mucha mano de obra y requiere mucho tiempo, lo que puede disminuir la precisión, la reproducibilidad y la calidad de los datos adquiridos. Por lo tanto, un sistema todo en uno y programable por el usuario que permita la adquisición automática, multifuncional y a largo plazo de imágenes y sea compatible con la mayoría de las plataformas de microscopía fluorescente puede beneficiar a la comunidad científica. Este documento presenta los protocolos operativos completos de la utilización de un novedoso sistema de software integrado que consiste en (1) un programa de software construido en el hogar, titulado "Programa de integración multifuncional automática (AMFIP)", que permite la adquisición automática de imágenes multicanal, y (2) un conjunto de paquetes de análisis de imágenes cuantitativas y computación de tracción celular. 
Este sistema integrado se aplica para revelar la relación previamente desconocida entre la distribución espacio-temporal de la proteína asociada al Sí (YAP) mecanosensible y la mecánica celular, incluida la propagación y tracción celular, en células normales humanas (B2B) y células de cáncer de pulmón (PC9) diseñadas por CRISPR / Cas9. Aprovechando la capacidad de control y lectura multicanal de este sistema, el resultado muestra: (1) las células normales B2B y las células cancerosas PC9 muestran una relación distinta entre la expresión de YAP, la tracción y la dinámica celular durante los procesos de propagación y migración celular; y (2) las células cancerosas PC9 aplican fuerzas perinucleares notables sobre los sustratos. En resumen, este documento presenta un protocolo paso a paso detallado sobre cómo utilizar un sistema integrado programable por el usuario que permite obtener imágenes y análisis multifuncionales automáticos para dilucidar la mecanosensibilidad de YAP. Estas herramientas abren la posibilidad de exploraciones detalladas de dinámicas de señalización multifacéticas en el contexto de la fisiología y patología celular.

Este documento presenta un protocolo detallado sobre cómo utilizar un sistema integrado multifuncional y programable por el usuario que permite la obtención automática de imágenes multicanal y el análisis mecanobiológico para dilucidar la mecanosensibilidad de la proteína asociada al Sí (YAP).

Interrogatorio de mecanobiología totalmente óptica de proteína asociada a sí en cáncer humano y células normales utilizando un sistema multifuncional

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Este método ayudará a ilustrar los mecanismos moleculares de un fenómeno biológico multifacético. Como la mecanobiología, la electrofisiología óptica y las imágenes de proteínas de ADN / ARN de superresolución utilizando técnicas automáticas de imágenes de células vivas. Este protocolo permite la corrección automática, multifuncional, de alto rendimiento, autodesvía y adquisición de imágenes a largo plazo.Es compatible con la mayoría de las plataformas microscópicas fluorescentes, como NYCOM. Cualquiera que pruebe esta técnica por primera vez debe comprender la función de cada paso, en lugar de solo seguir el protocolo estrictamente, para garantizar un experimento exitoso. Comience colocando la cámara de ambiente en la etapa motorizada del microscopio invertido.Ajuste el caudal de CO2 a 160 mililitros por minuto y ajuste la temperatura de la cámara. Luego agregue 40 mililitros de agua purificada en el baño de la cámara. Saque la placa de Petri con fondo de vidrio con células de la incubadora y colóquela en la cámara de ambiente.Encienda el controlador confocal y el microscopio invertido. Cambie la trayectoria de la luz a la derecha. Observe las celdas que se conectan mediante Micro Manager.Si se han unido suficientes células al gel, transfiera la placa de Petri a la incubadora. De lo contrario, continúe la incubación celular durante otros 30 minutos para B2B y 60 minutos para el cáncer de pulmón o las células PC-9. Corta 2 trozos pequeños de cinta adhesiva y pégalos en la cámara alrededor del orificio circular.Luego aplique un poco de pegamento adhesivo en el área de la cinta que cubrirá la placa de Petri. Saque la placa de Petri de la incubadora. Coloque lentamente la placa de Petri en la cámara y deje que el fondo de la placa haga contacto con el pegamento.Presione la tapa de la placa de Petri durante 1 minuto para permitir que el pegamento haga contacto completo con la placa de Petri y se solidifique. Empuje suavemente la placa de Petri horizontalmente para asegurarse de que el pegamento se haya solidificado y la placa de Petri no se mueva. Luego cierre la tapa de la cámara.Abra IntelliJ y establezca un parámetro T1 en la línea 93 del archivo elements_script.java. Asegúrese de que este valor es mayor que el tiempo de ejecución de la macro y los elementos utilizados para la creación de imágenes confocales de un campo de visión. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el proyecto AMFIP IntelliJ.Haga clic en el botón en vivo y de desaquisición múltiple en la interfaz principal de Micro Manager, luego cambie la trayectoria de luz del microscopio invertido a la derecha para obtener imágenes de campo brillante. Cambie al objetivo de 10 veces y abra la luz LED con la intensidad establecida en 5%Haga clic en el objetivo del microscopio de trayectoria de luz y el botón de la lámpara LED en el panel TI2 de elementos. Ajuste el joystick XY y la perilla del plano Z para encontrar la posición correcta y el plano de enfoque del gel en la placa de Petri.Utilice el objetivo de 10 veces para encontrar los campos de visión apropiados de múltiples células individuales unidas al gel. Marque la casilla XY de posiciones múltiples en la ventana de adquisición multidimensional. Haga clic en el botón editar lista de posición y observe la ventana de lista de posición del escenario que aparece.Cambie el objetivo a 40 veces, aumente la intensidad de la luz LED al 15%Reajuste la etapa motorizada XY para ubicar los campos de visión y registre las coordenadas haciendo clic en el botón de marca en la ventana de la lista de posición del escenario. Registre de 6 a 7 campos de visión deseados. Haga clic en el botón Guardar como en la ventana de la lista de posición del escenario para registrar las coordenadas y la entrada T1 como la sección de intervalo de tiempo de la adquisición de imágenes a T1 en la sección de punto de tiempo en la ventana de adquisición multidimensional.Abra los elementos, cambie la trayectoria de la luz a la derecha para obtener imágenes confocales y apague la luz LED. Luego haga clic en el botón de eliminación de enclavamiento y encienda el canal láser FITC para imágenes YAP marcando la casilla FITC. Después de ajustar la velocidad de escaneo a 1 fotograma por 2 segundos, gire la perilla del plano Z para encontrar la posición Z de las celdas adjuntas rápidamente.Registre los límites inferior y superior de la pila Z. Haga clic en macro en la cinta superior, seleccione editor de macros en el menú desplegable de macros e introduzca los límites inferior y superior de la pila Z en un archivo de macro. Encienda el canal láser DAPI para la obtención de imágenes de perlas marcando la casilla DAPI para encontrar y registrar la posición Z enfocada de las perlas.Vaya al editor de macros e introduzca los valores registrados en el archivo de macros. Para configurar la tarea de mover la etapa motorizada usando AMFIP, vaya a Micro Manager, haga clic en automatización de plug-ins para abrir la interfaz gráfica de usuario de AMFIP. Luego haga clic en los botones Agregar punto o quitar punto para adquirir el número exacto de campos de vista seleccionados.Introduzca las coordenadas registradas de los campos de visión en el panel de coordenadas. Defina el tiempo total del experimento en el campo de texto tiempo total del experimento. Haga clic en el botón de configuración de tiempo adicional y defina el intervalo de tiempo T2 de mover la etapa motorizada a cada FOV.Maximice el tamaño de la ventana de los elementos y arrastre la GUI de AMFIP al lado derecho de la pantalla para evitar que la GUI perturbe las operaciones automáticas del cursor y luego haga clic en el botón Enter. Después de que termine la primera macro. haga clic en el botón adquirir en la ventana de adquisición multidimensional.Después de finalizar la imagen a largo plazo, detenga la tarea AMFIP haciendo clic en el botón de pausa en la ventana del complemento de automatización y en el botón de detención en la ventana de adquisición multidimensional. Abra los elementos y configure las imágenes de la pila Z haciendo clic en los botones superior e inferior en la ventana de adquisición de ND. Cambie la trayectoria de la luz a la derecha y abra la luz LED.Retire lenta y cuidadosamente las tapas de la cámara y la placa de Petri mientras monitorea la vista de campo brillante para detectar cualquier deriva del campo de visión. Use una pipeta de plástico para tomar 0,5 mililitros de solución SDS. Sostenga cuidadosamente la pipeta de plástico un poco por encima del medio de cultivo en la placa de Petri y agregue de 1 a 2 gotas de la solución SDS en el medio de cultivo.Una vez que las celdas y la vista de campo brillante estén disueltas, cierre la luz LED, cambie la trayectoria de la luz hacia la izquierda, haga clic en el botón Eliminar enclavamiento. Ejecute la imagen de la pila Z y guarde la pila de imágenes como reference_N, donde N es el número de secuencia de cada campo de visión. Haga clic en el botón XY de posiciones múltiples en la ventana de adquisición multidimensional.Luego seleccione el siguiente campo de visión y haga clic en el botón de ir para mover la etapa motorizada al segundo FOV. Repita este paso para cada campo de visión. La localización nuclear es de proteína asociada al sí o YAP en elfos B2B aumentados con el aumento de la rigidez del sustrato, mientras que las células PC-9 mostraron una concentración similar de YAP en el núcleo y el citoplasma en sustratos de rigidez variable.La célula B2B aumentó monótonamente el área de propagación con el tiempo, junto con una disminución en la proporción nuclear a citoplasmática de YAP, mientras que la célula PC-9 mantuvo un área de propagación celular comparativamente inmutable, orientación y relación nuclear a citoplasmática de YAP a lo largo del proceso de propagación de 10 horas. Durante las 10 horas de duración de la propagación temprana, la célula B2B representativa deformó constitutivamente la superficie del sustrato y aplicó la tracción celular evolutiva en todo el área celular. En contraste, la célula PC-9 representativa solo desarrolló desplazamiento y tracción en los 2 extremos del cuerpo celular, y su tracción disminuyó después de 7.5 horas.La relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar de las células B2B parecían seguir dos tendencias distintas, lo que sugiere que podría haber habido dos grupos de células B2B que coexistieron en el experimento. En el primer grupo, la relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar aumentaron junto con el agrandamiento del área de propagación celular y alcanzaron sus máximos en aproximadamente 1.000 micrómetros cuadrados. En el segundo grupo, la relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar aumentaron a un ritmo más lento con el agrandamiento del área de propagación celular y mantuvieron valores casi constantes cuando el área de propagación celular continuó aumentando.Los rangos de pila Z para todos los canales láser deben determinarse cuidadosamente para superar la deriva potencial del campo de visión durante el movimiento de la etapa en imágenes a largo plazo. Esta novedosa técnica permite imágenes automáticas, no invasivas a largo plazo y multiposición, y puede ayudar a dilucidar el mecanismo de biología molecular que requiere el seguimiento temporal y espacial de células y orgánulos.

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