Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Un ensayo robusto de lector de placas como el nuestro es muy útil para la detección inicial de posibles inhibidores de la metiltransferasa. La capacidad de recopilar datos en tiempo real es una gran ventaja del ensayo continuo acoplado a endonucleasas. Comience preparando 600 microlitros de las condiciones de ensayo que contienen 20 compuestos micromolares y 50 micromolares por separado en los tubos de microcentrífuga sobre hielo.

Para hacerlo, agregue agua destilada doble y tampón de metilación 5X a cada tubo para lograr una concentración final de tampón de metilación 1X. A continuación, agregue 3.15 microlitros de 20 miligramos por mililitro de albúmina de suero bovino, o BSA, a cada muestra. Luego, agregue dos microlitros de sustrato de ADN de horquilla micromolar de 3.15 y 1.33 microlitros de S-adenosilmetionina micromolar de 4.75 micromolares, o SAM, a cada muestra.

Agregue un inhibidor a las muestras apropiadas para lograr una concentración final de 21 micromolares o 52.5 micromolares y una cantidad equivalente de dimetilsulfóxido, o DMSO, a una muestra de control antes de mezclar las soluciones mediante vórtice a 3, 000 rotaciones por minuto durante tres segundos. Luego, gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa a 1, 200 veces G para asegurarse de que la solución se recolecte en el fondo del tubo. Alícuota 95 microlitros de cada solución de ensayo en seis pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos.

Prepare 75 microlitros de solución enzimática Gla I o DNMT1 más Gla I en los tubos de microcentrífuga como se describió anteriormente a una concentración final de tampón de una sola vez. A continuación, agregue 1.2 microlitros de 10 unidades por microlitro Gla I a cada solución para lograr una concentración final de 0.16 unidades por microlitro. Agregue 0,6 microlitros de cinco micromolares que carecen de DNMT1 a la solución DNMT1 más Gla I para una concentración final de 40 nanomolares.

Después de una mezcla suave, gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa a 1, 200 G para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo. Luego, alícuota 12 microlitros de cada solución enzimática en seis pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo cónico. Para el ensayo de metilación de la muestra de ADN, precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados.

A continuación, inserte la placa negra que contiene las soluciones de ensayo en el lector de placas. Después de agitar la placa a 425 CPM, mida la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 528 nanómetros. Luego, incubar el plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Retire la placa de ensayo del lector de placas y agregue cinco microlitros de la solución enzimática a cada pocillo, seguido de mezclar la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Inserte la placa en el lector de placas y agite la placa antes de registrar la fluorescencia cada 53 segundos durante 30 minutos. Obtenga la fluorescencia promedio de los ensayos de control de Gla I triplicados para cada condición y reste las bandejas de reacción de control promedio que contienen Gla I de las trazas triplicadas obtenidas en presencia de DNMT1 que carece de RFTS.

Luego, determine el error promedio y estándar de la media para las réplicas corregidas. Trazar la traza de reacción corregida promedio y ajustar la porción lineal inicial a una línea para determinar la velocidad inicial. Determine el porcentaje de actividad dividiendo la velocidad observada en presencia de un compuesto por la velocidad observada en el DMSO que contiene la reacción de control y multiplicando por 100.

Los resultados de un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasas mostraron que el ADN del producto completamente metilado está protegido de la escisión, lo que confirma que DNMT1 que carece de RFTS es activo y capaz de metilar el ADN del sustrato hemimetilado. En el ensayo basado en fluorescencia, en ausencia de Gla I, la adición de DNMT1 o tampón solo no afectó la fluorescencia de fondo. La adición posterior de Gla I a todos los ensayos dio como resultado la generación de fluorescencia solo en ensayos que contenían DNMT1.

La adición simultánea de DNMT1 y Gla I que carecen de RFTS a tres ensayos dio como resultado una generación de fluorescencia robusta. La adición de Gla I sola no produjo fluorescencia. Para detectar posibles inhibidores, se examinó la actividad de metilación del ADN de DNMT1 que carece de RFTS en presencia de DMSO, compuesto uno, compuesto dos o compuesto tres a concentraciones micromolares de 20 y 50.

Los compuestos que reducen la generación de fluorescencia en este ensayo acoplado deben validarse aún más. Asegurarse de que los compuestos no inhiben la enzima de acoplamiento es un siguiente paso importante.