Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3
27 de agosto de 2021
La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.
La visualización de fagos no solo nos ayuda a investigar las características de unión de enzimas clínicamente importantes, sino que también desarrolla moduladores para esas enzimas y las enfermedades correspondientes. La pantalla de fagos se puede utilizar para desarrollar nuevos aglutinantes para una amplia gama de proteínas objetivo y también es más fácil de realizar que otros métodos de visualización convencionales. Este procedimiento implicó una gran cantidad de acciones repetitivas, por lo que la clave es no piloto automático y permanecer enfocado en todo momento.
Comience inoculando 30 mililitros de caldo de tetraciclina 2YT con 200 microlitros del cultivo de semillas. Incubarlo durante aproximadamente tres horas a 37 grados centígrados con agitación orbital de 200 RPM hasta que las bacterias estén en la fase de registro medio. Deseche la solución de recubrimiento de la placa en un fregadero.
Sécalo suavemente con toallas de papel. Luego agregue 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto. Deseche el tampón de PB del plato y séquelo en toallas de papel.
Agregue otros 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto de la placa. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM. Descongele la biblioteca de fagos en hielo, luego diluya a 100 veces la diversidad de la biblioteca en PBS.
Agregue la solución de cloruro de sodio de polietilenglicol a una quinta parte del volumen de la biblioteca diluida e incube la solución en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugue la solución a 11, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y centrímelo durante otros dos minutos para tirar del sobrenadante restante y concentrar el gránulo de fago.
Resusped suavemente el pellet de fago en un mililitro de tampón PBT por proteína objetivo a analizar, típicamente cuatro en total. Agregue 100 microlitros de biblioteca de fagos a cada pozo recubierto en la placa de control. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.
Deseche el tampón de PB de la placa objetivo en el fregadero y séquelo en toallas de papel. Transfiera los 100 microlitros de la biblioteca de fagos en la placa de control a cada pozo recubierto de la placa objetivo. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.
A continuación, retire la biblioteca de fagos de la placa y lave los pozos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y toque una toalla de papel para quitar las últimas gotas de tampón. Agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico molar 0.1 a cada pozo recubierto para eludir el fago.
Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos con agitación orbital de 300 RPM. Después de eso, neutralice el pH agregando 12.5 microlitros de pH 11 un triclorhidrato molar a cada pozo recubierto. Transfiera el fago eluido de los ocho pocillos a un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para hacer soluciones homogéneas y aspirar todo el líquido de los pozos. Agregue 10% BSA al fago eluido para hacer la concentración final 1% Almacene el tubo de la microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Esta es la salida redonda.
Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección inoculando cinco mililitros de cultivo de semillas de tetraciclina 2YT con una colonia aislada de E. coli de una placa de agar. Incubarlo durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Diluya la proteína objetivo en las rondas dos y tres tubos con una cantidad adecuada de PBS.
Tome la mitad del contenido de las rondas dos y tres tubos y cubra cuatro pocillos por proteína objetivo en una placa de unión de 96 pocillos para la siguiente ronda. A continuación, use la mitad de la salida redonda para inocular tres mililitros de células de fase logarítmica media. Incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos con un temblor orbital de 200 RPM.
Agregue el fago auxiliar M13KO7 a una concentración final de 10 mil millones de PFU por mililitro. Incubarlo de nuevo a 37 grados centígrados durante una hora con un temblor orbital de 200 RPM. Después de una hora, transfiera los tres mililitros completos de cultivo a 30 mililitros de solución de kanamicina de carbenicilina 2YT.
Crece durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Los resultados representativos para una selección de variantes de ubiquitina contra UBE4B se muestran aquí. Los UBV se ordenaron de mayor a menor frecuencia.
Las secuencias representan la región diversificada de ubiquitina en el UBV con todos los residuos aleatorios. La afinidad de unión relativa de los aglutinantes a la proteína diana de tipo salvaje, la proteína diana mutada, así como las proteínas fuera del objetivo se mide mediante ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas o ELISA. Todas las absorbancias de ELISA se normalizaron contra 96 puntajes promedio de BSA ELISA y 96 puntajes promedio de GST ELISA.
El verde más oscuro representa la unión relativa más fuerte. Gst se incluyó como un control para la unión inespecífica porque la proteína objetivo está marcada con GST. Los resultados de ELISA se presentan gráficamente aquí.
El eje x representa las UBV y el eje y representa la absorbancia normalizada correspondiente. Al intentar este procedimiento, es importante que no deseche la solución en la placa después de agregar el ácido clorhídrico. Los fagos ahora están suspendidos en solución y desea conservarlos para que pueda realizar análisis finales de enriquecimiento posteriores o ambos.
Después de este procedimiento, se debe realizar la secuenciación para determinar las frecuencias de UBV. Los ensayos ELISA e IC50 se pueden realizar para determinar las eficacias de unión y las eficacias inhibitorias, respectivamente, y también para ayudar a determinar qué UBV caracterizar más a fondo.
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Visión general
Este artículo discute el uso de la presentación de fagos para aislar variantes de ubiquitina novedosas que pueden modular las E3 ligasas involucradas en la ubiquitinación. La ubiquitinación es una modificación postraduccional crucial vinculada a varias enfermedades humanas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Ingeniería de proteínas
Antecedentes
- La ubiquitinación es esencial para regular la degradación de proteínas y los procesos celulares.
- La desregulación de la ubiquitinación está asociada con numerosas enfermedades.
- La presentación de fagos es una técnica poderosa para descubrir interacciones de proteínas.
- Este método permite el desarrollo de moduladores específicos para enzimas.
Propósito del estudio
- Aislar variantes de ubiquitina novedosas usando presentación de fagos.
- Entender cómo estas variantes pueden influir en la actividad de la E3 ligasa.
- Explorar las implicaciones de la modulación de ubiquitina en contextos de enfermedad.
Métodos utilizados
- Inoculación de cultivos bacterianos en caldo 2YT con tetraciclina.
- Incubación a 37 grados Celsius con agitación orbital.
- Utilización de técnicas de presentación de fagos para ensayos de unión.
- Aislamiento y caracterización de variantes de ubiquitina.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de variantes de ubiquitina novedosas.
- Características de unión demostradas a E3 ligasas.
- Potencial de estas variantes para modular los patrones de ubiquitinación.
- Perspectivas sobre el papel de la ubiquitinación en los mecanismos de enfermedades.
Conclusiones
- La presentación de fagos es un método efectivo para descubrir variantes de ubiquitina.
- Modular la actividad de la E3 ligasa podría tener implicaciones terapéuticas.
- Se necesita más investigación para explorar las aplicaciones clínicas de estos hallazgos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
