Name: Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende la macrodisección de tejidos FFPE para mejorar el contenido tumoral y la precisión del análisis genómico. Este método permite aislar material tumoral y reducir la contaminación de tejido no tumoral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo cuenta con el apoyo de AIDS and Cancer Specimen Resource (<a href="https://www.acsr1.com/">ACSR</a>, UM1 CA181255-2) financiado por los NIH en el marco de su programa de ciencia de bioespecímenes. El video fue filmado y la edición de postproducción fue realizada por Mayo Clinic Media Services.

Todas las muestras se recolectaron y utilizaron de conformidad con los protocolos IRB aprobados de Mayo Clinic (PR16-000507 y PR2207-02).
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Encienda el baño de agua de flotación de tejidos. Ajuste la temperatura a 39 °C y deje que el agua llegue a la temperatura. Remoje los palos de recolección de madera en el baño de agua.</li>
	<li>Identifique y recupere los bloques de tejido FFPE que se van a seccionar.</li>
	<li>Portaobjetos de microscopio pre-etiqueta utilizando un marcador permanente de grado histológico que puede soportar lavados con solvente.</li>
	<li>Utilice un microtomo para seccionar los bloques FFPE. Cortar al menos 2 secciones de cara completa a un espesor de 4-5 μm por sección para cada bloque (Figura 1A).</li>
	<li>Transfiera la cinta recién cortada de las secciones de tejido al baño de flotación de tejido precalentado para el montaje de la diapositiva (Figura 1B, C). NOTA: El agua tibia ayuda a "planchar" las arrugas en las secciones (Figura 1C).</li>
	<li>Al manejar cada sección secuencialmente, use fórceps para separar una sola sección de la cinta de opciones (Figura 1D).</li>
	<li>Recoja la sección única en un portaobjetos de microscopio preetiquetado.<ol>
<li>Sumerja el portaobjetos del microscopio en un ángulo debajo de la sección, colocando el portaobjetos de tal manera que el borde de la sección de tejido toque el portaobjetos (Figura 1E).</li>
		<li>Una vez en contacto con la sección de tejido, saque el portaobjetos del baño de flotación lentamente para permitir que la sección de tejido se enderece al ras contra el portaobjetos a medida que emerge del agua (Figura 1F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte 1 sección de tejido por diapositiva y repita hasta que se hayan recogido todas las secciones.</li>
	<li>Permita que las secciones de tejido montadas en deslizamiento se sequen completamente a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Revisión patológica
<ol><li>Realice tinciones de H&E en una sección de tejido representativa para cada bloque9.</li>
	<li>Envíe el H&Es recién teñido para su revisión patológica por un patólogo certificado por la junta. NOTA: Durante la revisión, el patólogo determina y registra el porcentaje de contenido tumoral en cada tejido y rodea el área del tumor en cada diapositiva de H&E (consulte la Figura 2 y la Figura 3, Fila 1). La Tabla 1 describe el porcentaje de contenido tumoral por celularidad determinado durante la revisión patológica del H&Es para las muestras A-E que se muestran en la Figura 3, Fila 1. Las secciones con <60% de contenido tumoral requieren macrodisección7. El número de secciones necesarias para la extracción de ácidos nucleicos depende del tamaño del área tumoral en círculo. Si se cortaron secciones insuficientes en la sección 1 del protocolo y es posible realizar más cortes, es posible que sea necesario cortar secciones adicionales.</li>
</ol>3. Desparafinación
<ol><li>En una campana extractora, rellene previamente dos platos de tinción de vidrio con d-limoneno de grado histológico sin diluir o un disolvente a base de d-limoneno y 1 plato de tinción de vidrio con etanol de grado molecular sin diluir a prueba de 200. PRECAUCIÓN: Evite el contacto del d-limoneno con la piel y los ojos, evite la inhalación de vapor o niebla y manténgase alejado de las fuentes de ignición. Mantenga el etanol alejado del calor, las chispas y las llamas abiertas, evite derrames y contacto con la piel o los ojos, ventile bien y evite respirar vapores. NOTA: Llene los platos lo suficiente como para sumergir los toboganes en estanterías (Figura 4A); Se requieren 250 ml para llenar los platos de tinción de 20 diapositivas que se muestran. Reemplace los lavados de d-limoneno y etanol después de cada 40 diapositivas. El D-limoneno (C10H16) es un agente desparafinante alternativo, igualmente efectivo y menos tóxico al xileno que se está volviendo más común en las metodologías histológicas y produce ácido nucleico de buena calidad después de la extracción 10,11,12,13,14. Aunque este protocolo puede realizarse utilizando alternativas más biopáticas15, aún no se han determinado sus efectos, si los hay, sobre la calidad de los ácidos nucleicos extraídos.</li>
	<li>Rack de los deslizadores montados en tejido FFPE sin teñir en los bastidores deslizantes coplin de vidrio (Figura 4A, recuadro).</li>
	<li>Sumergir los toboganes trasiegados en d-Limonene lavar 1 durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. NOTA: Para minimizar el arrastre entre lavados, al retirar el estante de toboganes de un lavado, permita que el estante escurra brevemente antes de frotar suavemente el fondo del estante en papel de seda para eliminar el exceso de lavado.</li>
	<li>Sumergir los portaobjetos en racked en D-Limonene wash 2 sin diluir durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire, escurra y vuelva a frotar la rejilla.</li>
	<li>Sumergir los portaobjetos en el lavado de etanol durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire la rejilla y colóquela sobre un tejido absorbente para drenar. Deje que los toboganes se sequen al aire durante al menos 10 minutos, pero no más de 2 h.</li>
</ol>3. Macrodisección
<ol><li>En el banco, llene previamente un frasco de vidrio Coplin con 50 ml de glicerol al 3% en agua libre de DNasa / RNasa NOTA: Reemplace el lavado de glicerol después de cada 40 diapositivas.</li>
	<li>Pre-etiquetar y precargar microtubos de 1,5 ml con 160 μL de tampón de digestión tisular por microtubo. NOTA: Las extracciones de ácido nucleico realizadas después de la macrodisección utilizaron un kit de extracción de ADN/ARN FFPE (Tabla de Materiales). Por lo tanto, el tampón de digestión tisular utilizado en este protocolo comprendía 10 μL de proteinasa K y 150 μL de tampón PKD.</li>
	<li>Rastree las marcas patológicas en el H&E en la parte posterior de los portaobjetos de tejido desparafinado. NOTA: En comparación con los tejidos no desparafinados (Figura 3, Fila 2 y Figura 4B), los tejidos desparafinados son blancos y altamente visibles (Figura 3, Fila 3 y Figura 4C). Es esta mayor visibilidad y discernibilidad de las características del tejido desparafinado lo que permite la macrodisección. Coloque el H&E boca abajo en el banco y coloque la parte delantera del tobogán desparafinado contra la parte posterior del patólogo emparejado revisado H&E (Figura 4D). Alinear el tejido desparafinado con el tejido H&E (Figura 4E). El rastreo de las marcas del patólogo es un paso crítico en el proceso de macrodisección, y se debe tener cuidado de reproducir estas marcas con la mayor precisión posible. Esto puede ser particularmente difícil para tejidos pequeños y/o desconectados, como las muestras B, D y E (Figura 3, Figura 4E y Figura 4E recuadro i). Para ayudar al rastreo, se debe usar un marcador de tinta fina o ultrafina (Figura 4E, recuadro ii) para rastrear las marcas dibujadas por el patólogo. Las toallitas de etanol pueden ser útiles para eliminar errores y permitir el rastreo si es necesario.</li>
	<li>Gire el tejido deslizante ahora marcado desparafinado boca arriba y trace la línea del marcador con la esquina de una cuchilla de afeitar limpia para cortar previamente los bordes del área del tumor.</li>
	<li>Manejando cada diapositiva secuencialmente, sumerja las diapositivas desparafinadas en la solución de glicerol al 3%. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido antes de retirar el portaobjetos lentamente (Figura 4F). NOTA: El propósito de la inmersión de glicerol es humedecer el tejido para ayudar a la recolección de tejido, pero también para reducir la acumulación de carga estática que puede causar repulsión entre el tejido y el microtubo de plástico en el que se debe colocar el tejido recolectado.</li>
	<li>Limpie suavemente la parte posterior de la diapositiva con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de solución de glicerol y coloque la diapositiva en el banco, limpiada de lado hacia abajo. Deje que los tejidos se aireen brevemente durante 1-2 min. NOTA: La transferencia del exceso de glicerol en el proceso de extracción puede afectar negativamente el rendimiento y la calidad de las extracciones de ácidos nucleicos. Los tejidos deben estar ligeramente húmedos pero no visiblemente húmedos cuando se recogen.</li>
	<li>Dependiendo de dónde se encuentre el área de interés del tumor en el portaobjetos, use el borde plano de la hoja de afeitar para (a) recolectar directamente el tejido tumoral, usando la maquinilla de afeitar para raspar / recolectar el tejido de interés del portaobjetos, o (b) extraer y desechar el tejido no tumoral primero antes de recolectar el tejido tumoral de interés (Figura 3). NOTA: El tejido recolectado tiende a acumularse o enrollarse en la parte inferior de la cuchilla (Figura 4G)</li>
	<li>Use un palo de madera para extraer el tejido recolectado de la cuchilla (Figura 4H y recuadro) y transfiéralo al microtubo preetiquetado y precargado apropiado (Figura 4I). NOTA: El tampón de digestión sirve para "tirar" del tejido de la púa de madera hacia el líquido.</li>
	<li>Proceder a la extracción de ácido nucleico. NOTA: Las extracciones de ácido nucleico se completaron utilizando el kit de extracción de ADN / ARN FFPE según las instrucciones del fabricante, y los ácidos nucleicos resultantes se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro UV-vis. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90 basado en perfiles de expresión génica digital16.</li>
</ol>

<ol><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
<li>Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lymphoma+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).</li>
<li>Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+next+generation+sequencing+in+oncology%3A+A+guide+for+oncologists%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).</li>
<li>Haile, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high+throughput+nucleic+acid+purification+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples+for+next+generation+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis.</a> PLoS One. 12 (6), 0178706(2017).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+accuracy+of+whole-exome+sequencing+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples.</a> PLoS One. 10 (12), 0144162(2015).</li>
<li>Holley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+clonal+profiling+of+formalin+fixed+paraffin+embedded+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples.</a> PLoS One. 7 (11), 50586(2012).</li>
<li>Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers">https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers</a> (2021).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cold+into+hot%3A+Firing+up+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment.</a> Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+and+risk+assessment+of+d-Limonene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health+Part+B%3A+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).</li>
<li>Foti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+contact+dermatitis+to+a+limonene-based+solvent+in+a+histopathology+technician%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician.</a> Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).</li>
<li>Meuse, C. W., Barker, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+infrared+spectroscopy+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+specimens%3A+paraffin+wax+removal+with+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).</li>
<li>Schmeller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+out+the+frame+conditions+for+feasible+use+of+FFPE+derived+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+-+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA.</a> Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).</li>
<li>Prema, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofriendly+substitutes+for+xylene+in+deparaffinization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).</li>
<li>Ennishi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-hit+gene+expression+signature+defines+a+distinct+subgroup+of+germinal+center+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).</li>
<li>Alizadeh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+identified+by+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling.</a> Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).</li>
<li>Rosenwald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+molecular+profiling+to+predict+survival+after+chemotherapy+for+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+B-cell+lymphoma+with+MYC+and+BCL2+and%2For+BCL6+rearrangements+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology.</a> Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+cell-of-origin+subtypes+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+using+gene+expression+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).</li>
<li>Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+complexity+and+heterogeneity+of+pancreatic+tumor%3A+3D+in+vitro+to+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).</li>
<li>Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).</li>
<li>Geiersbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+guided+microdissection+aids+somatic+mutation+detection+in+difficult+to+dissect+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors.</a> Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).</li>
<li>de Bruin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrodissection+versus+microdissection+of+rectal+carcinoma%3A+minor+influence+of+stroma+cells+to+tumor+cell+gene+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles.</a> BMC Genomics. 6, 142(2005).</li>
<li>Ramsower, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+validation+of+the+MCL35+assay+for+molecular+risk+stratification+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematopathology%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma.</a> Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).</li>
<li>Maguire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+DNA+repair+and+genomic+stability+identify+a+novel+HIV-related+diffuse+large+B-cell+lymphoma+signature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature.</a> International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).</li>
<li>Rosenwald, A., Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).</li>
<li>Wright, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+classification+tool+for+genetic+subtypes+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications.</a> Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).</li>
<li>Hilton, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-hit+signature+identifies+double-hit+diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+genetic+events+cryptic+to+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH.</a> Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los tejidos FFPE son con frecuencia mezclas heterogéneas de tejidos tumorales y no tumorales. Las pruebas genómicas de alta sensibilidad son cada vez más frecuentes tanto en entornos clínicos como de investigación, pero pueden confundirse por la presencia de tejido no tumoral contaminante. De hecho, con frecuencia se recomienda un contenido mínimo de tumores del 60% para los estudios genómicos. El porcentaje de tumor se puede determinar por el área de tejido ocupada por el material tumoral o por la proporción de células tumorales dentro del tejido. Aunque el tumor por área es una métrica comúnmente utilizada para la pureza del tumor, no siempre retrata una descripción precisa del tejido. Considere dos tejidos, ambos con 1000 células, de las cuales 500 son células tumorales. En el tejido A, las 500 células no tumorales son células estromales con volúmenes similares a los de la célula tumoral. En este tejido, el porcentaje de tumor puede considerarse 50% tanto por celularidad como por área. En el tejido B, las 500 células no tumorales son células grasas con volúmenes que son 4 veces mayores que los de la célula tumoral. En este tejido, el porcentaje tumoral sigue siendo del 50% por celularidad pero del 20% por área. Un tercer tejido, el tejido C, está compuesto por 500 células tumorales más 400 células grasas y 800 células estromales con volúmenes que son 4x y 0,5x el de las células tumorales, respectivamente. Dado que 100 células grasas equivalen al volumen de 800 células estromales, el porcentaje de tumor de tejido C es del 29% por celularidad (500/1700), pero aún así del 20% por área. El tejido D también se compone del tumor, la grasa y las células del estroma con proporciones de volumen de 1x, 4x y 0.1x. Sin embargo, el número de células es 400, 10 y 720, respectivamente. Así, el porcentaje tumoral de tejido D es del 35% por celularidad (400/1130) pero del 78% por área. Estos ejemplos son demasiado simplistas y no reflejan composiciones de tejidos del mundo real, pero transmiten claramente la importancia de la composición de tejidos y la diferencia entre el contenido tumoral por área y por celularidad. Es importante destacar que, cuando se trata de enriquecer el contenido tumoral para la extracción de ácido nucleico aguas abajo, la celularidad tumoral es el atributo más importante debido al mayor potencial de confusión de la extracción de material genómico de más células no tumorales que las células tumorales. Esto no solo subraya la necesidad de evaluar el contenido tumoral de los tejidos en términos de porcentaje de celularidad, sino también la necesidad de extirpar el tejido no deseado para minimizar cualquier posible efecto negativo del tejido no tumoral. Hay varios métodos disponibles para el enriquecimiento de tejidos, siendo los principales la macrodisección y la microdisección.
La macrodisección, el método descrito en este protocolo, es relativamente rápido, simple y no requiere equipo costoso o especializado. Aunque la macrodisección puede mejorar en gran medida el contenido tumoral, es importante comprender que no elimina completamente el material no tumoral. El propósito de la macrodisección es enriquecer suficientemente el tejido de interés a través de la exclusión de tejido no deseado para reducir el "ruido" derivado del tejido no deseado, lo que a su vez puede mejorar la señal de interés del tejido de interés. Por lo tanto, el enriquecimiento tumoral mediado por macrodisección es una forma de mejorar la relación señal-ruido para detectar mejor los marcadores de interés, particularmente los marcadores moleculares específicos del tumor con baja abundancia o mala expresión. Sin embargo, la macrodisección tiene limitaciones debido a la falta de precisión que ofrecen las herramientas gruesas como las cuchillas de afeitar y es susceptible a problemas de precisión derivados del grosor de la línea del marcador del patólogo, así como a posibles errores al rastrear las demarcaciones de H&E de los patólogos. Como se mencionó anteriormente, no es posible lograr una pureza tumoral del 100% debido a la presencia de elementos estromales inherentes e inductores de tumores (es decir, tejido conectivo, fibroblastos estromales, vasos sanguíneos, linfocitos reactivos benignos, macrófagos) incrustados dentro del propio tumor. De hecho, muchas neoplasias malignas invasivas o de infiltración difusa inducen una respuesta estroma desmoplástica robusta, lo que resulta en grupos de células tumorales que están íntimamente mezcladas con fibroblastos estromales y otros tipos de células no neoplásicas; donde los tumores asociados con este patrón de reacción estromal, como los tejidos de cáncer de páncreas21, pueden beneficiarse más de la microdisección guiada digitalmente que de la macrodisección manual. 
La microdisección manual se realiza bajo un microscopio para ayudar a la identificación, disección y aislamiento de células o poblaciones específicas de tejidos utilizando una aguja o bisturí y tiene la ventaja de una mayor precisión sobre la macrodisección22. Sin embargo, la microdisección manual es un proceso laborioso que carece de la delicadeza necesaria para tejidos complejos con bajo contenido tumoral o características intrincadas que son incompatibles con la disección manual. Dichos tejidos se pueden diseccionar utilizando métodos automatizados de alta precisión como la microdisección de captura láser. De hecho, se ha demostrado que la microdisección guiada digitalmente produce un mayor porcentaje de contenido tumoral en comparación con la macrodisección manual en los tejidos de cáncer de páncreas23. Sin embargo, los inconvenientes de estos métodos automatizados de alta precisión, como la necesidad de equipos especializados y costosos y personas altamente capacitadas, han obstaculizado su incorporación en los flujos de trabajo. Un estudio realizado por de Bruin et al. comparando los efectos de la macrodisección y la microdisección de captura láser (LCM) en el perfil de expresión génica encontró que las muestras de LCM tenían bajos rendimientos totales de ARN (promedio de 30 ng) y requerían dos rondas de amplificación de ARNm para cumplir con el umbral de entrada de preparación de la biblioteca de ADNc24. Los autores encontraron que los perfiles de expresión génica LCM resultantes se vieron afectados por las rondas de amplificación de ARNm más que los perfiles macrodiseccionados se vieron afectados por las contribuciones estromales no tumorales y concluyeron que la macrodisección podría usarse adecuadamente para generar datos confiables de expresión génica24. 
Una ventaja significativa del perfil de expresión génica digital nanoString, particularmente cuando se trabaja con ARN derivado de FFPE altamente degradado, es que no requiere procesos dependientes enzimáticos como la amplificación de ARN o la preparación de bibliotecas de ADNc. Sin embargo, los ensayos suelen estar optimizados para entradas entre 50-300 ng de ARN total25,26, que, según los hallazgos de De Bruin et al.24, pueden no ser compatibles con tejidos microdisecados sin aumentar la entrada tisular; una demanda desfavorable en una era en la que las muestras de tejido se recogen cada vez más como biopsias pequeñas en lugar de resecciones quirúrgicas. Las entradas de ARN utilizadas para el ensayo DLBCL90 variaron de 68.5-300 ng tanto para los tejidos macrodiseccionados como para los no disecados. Los resultados muestran que la macrodisección dio lugar a cambios de llamada en el 60% de las muestras examinadas y que estos cambios se observaron independientemente de la entrada de ARN de las muestras macrodiseccionadas. Sin embargo, la probabilidad de COO para la baja entrada de ARN invadió el umbral de llamada de probabilidad COO GCB / UNC, donde los umbrales son de 0 a <0.1 para GCB, 0.1-0.9 para UNC y >0.9 a 1.0 para llamadas ABC20. Los principales subtipos de COO de DLBCL son GCB y ABC, que representan el 41% y el 44% de todos los casos de DLBCL, con UNC representando un grupo intermedio de los dos y ABC siendo elmás agresivo 20,27. Por lo tanto, mientras que el cambio de llamada de COO a la macrodisección de la muestra C no causó un cambio franco en el subtipo de COO de GCB a ABC, el cambio de GCB a UNC puede sugerir un cambio hacia una enfermedad más agresiva. Además, estudios recientes indican que el subtipo UNC no es simplemente un subtipo intermedio y que potencialmente puede poseer atributos terapéuticamente explotables específicos del subtipo28. Del mismo modo, la macrodisección de las muestras A y E no causó cambios francos en las llamadas de DHITsig de DH negativo a DH positivo, o viceversa. Sin embargo, los movimientos de una muestra de GCB (muestra A) de NEG a UNCLASS y una muestra abc (muestra E) de UNCLASS a NEG en macrodisección son biológicamente apropiados, ya que se informa que las translocaciones de doble impacto que involucran BCL2 son un fenómeno exclusivamente GCB19. Aunque las translocaciones son detectadas tradicional y ubicuamente por FISH en entornos clínicos, existe un impulso creciente para identificar un método alternativo menos involucrado y lento para su detección. El ensayo DLBCL90 es una herramienta importante que aborda esta necesidad, donde la justificación de su uso se ve reforzada por el hallazgo de que este ensayo es capaz de detectar translocaciones crípticas a sondas FISH utilizadas en diagnósticos clínicos29.
El protocolo de macrodisección descrito anteriormente describe un método simple que permite a los investigadores aumentar el contenido tumoral de muestras de tejido que normalmente caerían por debajo de los umbrales de los criterios de inclusión de estudios comúnmente utilizados. La inclusión de la macrodisección en el flujo de trabajo de un estudio permite a los investigadores rescatar tejidos pobremente densos en tumores de la exclusión del estudio al aumentar su contenido tumoral. A su vez, esto permite una mayor confianza en que los eluidos de ARN y ADN resultantes representan el tumor bajo investigación genómica. Aunque existen otros métodos más precisos para la disección de tejidos, para los tumores que crecen de una manera más expansiva, no infiltrativa, similar a una lámina o sólida, la macrodisección es probablemente suficiente. Los resultados presentados aquí resaltan la importancia de la pureza tumoral en los ensayos genómicos y la macrodisección como una herramienta confiable para lograrlo.

Los tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE), recolectados como parte del proceso de diagnóstico clínico normal y retenidos en repositorios de tejidos clínicos, representan un vasto recurso para la investigación en humanos, incluida la investigación del cáncer1. A medida que nuestra comprensión de la enfermedad humana se profundiza, se está volviendo cada vez más claro que las enfermedades, que anteriormente se pensaba que eran entidades únicas basadas en características morfológicas e inmunofenotípicas, de hecho se componen de distintos subtipos moleculares que requieren ensayos de subtipificación molecular. En consecuencia, los ensayos genómicos de alta sensibilidad capaces de discernir estos subtipos se han vuelto cada vez más importantes2. Aunque los tejidos FFPE son conocidos por ser poco compatibles con las técnicas genómicas debido a problemas relacionados con la fijación, a medida que la tecnología y los protocolos evolucionan, estas técnicas son cada vez más compatibles con este formato de tejido clínicamente ubicuo 3,4,5. Sin embargo, los tejidos FFPE son a menudo mezclas de materiales tisulares tumorales y no tumorales, donde la presencia de material no tumoral es a menudo no deseada y puede, si está presente en una proporción alta, socavar e impactar significativamente los resultados de los análisis genómicos6. De hecho, se utiliza con frecuencia un contenido tumoral mínimo del 60% para tales análisis, donde se pueden excluir los tejidos que no alcanzan este umbral, a pesar de cumplir con los criterios del estudio7. Esto puede ser particularmente problemático en entornos de enfermedades raras, donde los tejidos de los pacientes son preciosos y difíciles de recolectar en grandes cantidades.
La macrodisección es un método que minimiza los efectos del bajo contenido tumoral al reducir la cantidad de tejido normal3. La eliminación de dicho material no tumoral confuso antes de la extracción de ácido nucleico puede aumentar significativamente el contenido porcentual del tumor y, por lo tanto, la pureza tumoral de los ácidos nucleicos extraídos. La resección tisular se basa críticamente en la revisión patológica de expertos, en la que la región del tumor se identifica y se rodea en una sección de tejido teñido de hematoxilina y eosina (H&E) recién generada por un patólogo certificado por la junta8. El H&E con círculos se utiliza para guiar la eliminación y la recolección de tejidos no deseados y objetivo, respectivamente. Este protocolo describe los pasos de la macrodisección desde la revisión patológica hasta la recolección de tejidos como se realiza en el Laboratorio Técnico Básico del Recurso de Muestras de SIDA y Cáncer (ACSR) en la Clínica Mayo.

<table><tbody><tr><td>Etanol de 200 grados</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep Kit de ADN/ARN FFPE</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Kit de extracción de ADN/ARN FFPE</td></tr><tr><td>Macetas Coplin</td><td>Varios</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>DLBCL90 sondas</td><td>NanoString</td><td>Varios</td><td>Perfil digital de expresión génica basado en DLBCL90 ensayo</td></tr><tr><td>d-Limoneno</td><td>VWR</td><td>89376-092</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Varios</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de micrcopio de vidrio</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kits maestros</td><td>NanoString</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>Espectrofotómetro ND-ONE-W</td><td>para la calidad de ADN, ARN y proteínas</td></tr><tr><td>nCounter</td><td>NanoString</td><td>x</td><td>Plataforma digital de perfiles de expresión génica utilizada para ejecutar el ensayo de DLBCL90</td></tr><tr><td>Marcador permanente</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>72109-12</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de hojas de afeitar</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>71985-10</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Microscopio Electrib Ciencias</td><td>71985-23</td><td></td></tr><tr><td>Tampón para digestión de tejidos</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>VWR</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr>Triángulo de<td>baño de agua</td><td>Ciencias Biomédicas</td><td>TFB-120</td><td></td></tr><tr><td>Palo de madera</td><td>FisherBrand</td><td>22363158</td><td></td></tr></tbody></table>

mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection

La presencia de tejidos no tumorales contaminantes en tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE) puede socavar en gran medida los estudios genómicos. Aquí describimos la macrodisección, un método diseñado para aumentar el porcentaje de contenido tumoral de una muestra de tejido mediante la eliminación y eliminación de tejido no deseado antes de realizar extracciones de ácido nucleico aguas abajo. Los bloques de tejido FFPE se seccionaron para producir secciones de tejido montadas en diapositivas de 4-5 μm. Se presentó una sección representativa para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y posteriormente fue revisada por un patólogo certificado por la junta. Durante la revisión, el patólogo identificó y marcó las regiones de tejido tumoral en el H&E. Una vez completado, el H&E demarcado se utilizó para guiar la resección de las secciones no teñidas en serie del mismo bloque de tejido. Para demostrar los efectos de la macrodisección, el ARN extraído de linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) macrodiseccionados y no disecados emparejados se ejecutó en un ensayo de expresión génica digital capaz de determinar el subtipo DLBCL y el estado de translocación BCL2. Los resultados mostraron que la macrodisección cambió el subtipo o las llamadas de estado de translocación BCL2 en el 60% de las muestras examinadas. En conclusión, la macrodisección es un método simple y efectivo para realizar el enriquecimiento tumoral antes de las extracciones de ácido nucleico, cuyo producto se puede utilizar con confianza en estudios genómicos posteriores.

Se seccionaron un total de 5 bloques de tejido FFPE de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), y las secciones resultantes se macrodiseccionaron o no antes de la extracción de ácido nucleico. El ARN extraído se ejecutó en el ensayo DLBCL9016. Las muestras macrodiseccionadas se ejecutaron dos veces, una vez utilizando 5 μL de concentración de stock de ARN pero no más de 300 ng de entrada total de ARN y una vez usando 5 μL de stock de ARN diluido para que coincida con las entradas de ARN de sus respectivas contrapartes no diseccionadas. Los resultados de DLBCL90 se describen en la Tabla 2.
DLBCL está compuesto por 3 subtipos distintos de células de origen (COO) con diferente capacidad de respuesta terapéutica, a saber, GCB, ABC y un grupo intermedio conocido como no clasificado o UNC17,18. Las translocaciones que involucran MYC, BCL2 y/o BCL6 solo o en combinación (doble o triple golpe) también se observan con frecuencia en DLBCL, particularmente en el subtipoGCB 19. El ensayo DLBCL90 es una expansión de su predecesor, el ensayo clínico Lymph2Cx, y por lo tanto es capaz de determinar el subtipo DLBCL COO, pero se desarrolló principalmente para identificar muestras que albergan translocaciones de doble golpe (DH) que involucran BCL2 utilizando la expresión génica digital como alternativa a la hibridación fluorescente in situ (FISH)16,20. Los resultados de la Tabla 2 muestran que la macrodisección cambió el COO o el estado de DHITsig requiere el 60% (3/5) de las muestras examinadas.
La macrodisección de la muestra A no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig de NEG a UNCLASS, y este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada y con puntuaciones de probabilidad similares (0,224, 0,254). Por el contrario, la macrodisección de la muestra C no tuvo ningún efecto en la llamada de DHITsig, pero cambió la llamada de COO de GCB a UNC. Una vez más, este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada. Sin embargo, en 0.117, la probabilidad de llamada de COO estaba más cerca del umbral de llamada de 0.1 para la muestra macrodiseccionada con entrada de ARN reducida. Al igual que la muestra A, la macrodisección de la muestra E no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig. Sin embargo, para la muestra E, la llamada cambió de UNCLASS a NEG y lo hizo independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada con llamadas de probabilidad razonablemente similares (0.849, 0.833). En particular, este cambio de llamada a DHITsig NEG tiene sentido biológico dado que la muestra E se encontró a ABC-DLBCL, y se ha informado que las translocaciones de doble golpe que involucran BCL2 se observan exclusivamente en GCB-DLBCL19.
<img alt="Proceso de seccionamiento de micrótomos y preparación de portaobjetos, destacando el procesamiento de tejidos en la configuración del laboratorio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Generación de secciones de tejido montadas en diapositivas utilizando un microtomo. (A) Bloque de tejido FFPE sostenido en su lugar por el mandril del microtomo y cortado para producir una cinta de secciones secuenciales de tejido FFPE. (B) Usando palos de madera pre-empapados, la cinta se recoge del microtomo y se transfiere a un baño de agua tibia. (C) El calor del agua ayuda a planchar los pliegues en la cinta de tejido. (D) Las secciones individuales de tejido FFPE se eliminan de la cinta de tejido colocando pinzas cerradas en la unión de dos secciones y abriendo suavemente las pinzas, lo que separa las secciones entre sí. (E) Las secciones se recogen del agua sumergiendo un portaobjetos de vidrio en ángulo y moviendo suavemente el lado hacia la sección de tejido hasta que el borde de la sección toque el portaobjetos de vidrio. (F) Una vez que la diapositiva y la sección estén tocando, retire lentamente la diapositiva del agua, permitiendo que la sección de tejido caiga al ras contra la diapositiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Proceso de microscopía; preparación de portaobjetos de tejido; inspección óptica; configuración experimental; análisis biológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Revisión patológica e histológica de una sección teñida de hematoxilina y eosina (H&amp;E). (A, B) La sección de tejido de H&amp;E es sometida a revisión microscópica por un patólogo certificado por la junta. (C,D) Una vez que el patólogo ha visto todo el tejido y ha encontrado que no es 100% tejido tumoral, el patólogo utilizará un marcador para rodear el área tumoral del tejido. (E,F) Mantener el H&amp;E marcado contra el bloque de tejido FFPE original muestra que no todo el tejido es material tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultado de la cromatografía que muestra la separación de colores entre las muestras; El diagrama muestra el método de análisis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Muestras de tejido. Esta imagen muestra los H&amp;Es patológicamente revisados y marcados con tumores (Fila 1), secciones de tejido FFPE montadas en diapositivas no procesadas (Fila 2), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas (Fila 3), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas con marcas de patología trazadas en la parte posterior de la diapositiva (Fila 4), secciones de tejido FFPE desparafinadas y macrodiseccionadas montadas en diapositivas (Fila 5) para las 5 muestras (A-E) utilizadas para demostrar este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Preparación y corte de muestras de tejido para análisis histológico; serie de imágenes que detallan los procesos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Desparafinación y macrodisección de secciones de tejido FFPE: (A) En una campana de humos, los tejidos FFPE montados en un estante deslizante se lavan en dos lavados d-limoneno y un lavado de etanol. (B,C) Después del lavado, se ha eliminado toda la parafina y solo queda el tejido en el portaobjetos, que ahora es blanco y altamente visible en comparación con su contraparte prelavada. (D) La sección de tejido desparafinada montada en un portaobjetos se coloca boca abajo en la parte posterior de su marca H&amp;E. (E) Las marcas del área tumoral en el H&amp;E se trazan en la parte posterior del portaobjetos desparafinado utilizando un marcador permanente fino o ultrafino (F) La sección de tejido marcada con deslizamiento desparafinado se sumerge en un lavado de glicerol para humedecer la sección de tejido para la recolección. El portaobjetos se retira lentamente del glicerol, y la parte posterior del portaobjetos se limpia con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de glicerol antes de colocar el tejido del portaobjetos boca arriba en el banco. (G) Usando el lado plano de una cuchilla de afeitar limpia, el tejido se macrodisecciona y el tejido no deseado fuera de las marcas del patólogo se descarta antes de recolectar el tejido de interés, que se reúne a lo largo del borde de la cuchilla. (H) Se utiliza un palo de madera para extraer el tejido recogido del borde de la cuchilla. (I) El tejido se transfiere a un tampón de digestión de tejido precargado de microtubos preetiquetado y está listo para la extracción de ácido nucleico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">ID de muestra</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Tejido entero (a)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Área de tejido con círculos (b)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Contenido tumoral general de tejido entero (c)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Aumento del pliegue en el contenido tumoral por macrodisección (d)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">No macrodiseccionado (e)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Macrodiseccionado (f)</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">% Tumor viable</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Otros</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Tumor viable</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Otros</td>
			<td style="min-width: 80px;"># de diapositivas de 5 μm extraídas</td>
			<td style="min-width: 80px;">CONC de ARN (ng/μL)</td>
			<td style="min-width: 80px;"># de diapositivas de 5 μm extraídas</td>
			<td style="min-width: 80px;">CONC de ARN (ng/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Ejemplo A</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">75</td>
			<td style="min-width: 80px;">25</td>
			<td style="min-width: 80px;">45</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">19.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">4</td>
			<td style="min-width: 80px;">58.3</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Ejemplo B</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">39</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">34.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Ejemplo C</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">26</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.5</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">13.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">46.2</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Ejemplo D</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">90</td>
			<td style="min-width: 80px;">10</td>
			<td style="min-width: 80px;">32</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.9</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">57.3</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 80px;">Ejemplo E</td>
			<td style="min-width: 80px;">20</td>
			<td style="min-width: 80px;">80</td>
			<td style="min-width: 80px;">30</td>
			<td style="min-width: 80px;">70</td>
			<td style="min-width: 80px;">6</td>
			<td style="min-width: 80px;">5.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">25.2</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">44.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Datos de revisión patológica. La tabla muestra (a) el porcentaje de tumor viable en toda la sección de tejido por área, (b) el porcentaje de tumor viable en el área rodeada / marcada por el patólogo durante la revisión por celularidad, (c) la celularidad tumoral global estimada de todo el tejido (a x b), (d) el aumento estimado del pliegue en la celularidad tumoral logrado con macrodisección, e y f) el número de secciones de tejido ffPE no teñidas de 5 μm sin teñir extraídas y las concentraciones de ARN resultantes para muestras no macrodiseccionadas y macrodiseccionadas compatibles. % Otro se refiere a todos los demás tejidos presentes en una muestra dada que no es tejido tumoral y puede incluir tejido conectivo, fibroblastos estromales, vasos sanguíneos y otros elementos estromales inherentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%201-62961R3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">ID de muestra</td>
			<td>Entrada de ARN (ng)</td>
			<td>Llamada de COO de DLBCL90</td>
			<td>Probabilidad de llamada DLBCL90</td>
			<td>Llamada de DHITsig</td>
			<td>Probabilidad de DHITsig pos</td>
			<td>DHITsig neg probabilidad</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">No macrodiseccionado</td>
			<td>Ejemplo A</td>
			<td>95.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.135</td>
			<td>0.865</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo B</td>
			<td>170.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.032</td>
			<td>0.968</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo C</td>
			<td>68.5</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.028</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.033</td>
			<td>0.967</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo D</td>
			<td>286.5</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.998</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo E</td>
			<td>126.0</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.989</td>
			<td>UNCLASS</td>
			<td>0.212</td>
			<td>0.788</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Macrodiseccionado</td>
			<td>Ejemplo A_M</td>
			<td>291.7</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>UNCLASS</td>
			<td>0.224</td>
			<td>0.776</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo B_M</td>
			<td>300.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.016</td>
			<td>0.984</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo C_M</td>
			<td>231.2</td>
			<td>UNCLASS</td>
			<td>0.210</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0.985</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo D_M</td>
			<td>300.0</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.999</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo E_M</td>
			<td>223.2</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.987</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.151</td>
			<td>0.849</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Macrodiseccionado y ARN diluido</td>
			<td>Ejemplo A_M</td>
			<td>95.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>UNCLASS</td>
			<td>0.254</td>
			<td>0.746</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo B_M</td>
			<td>170.0</td>
			<td>Gcb</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.023</td>
			<td>0.977</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo C_M</td>
			<td>68.5</td>
			<td>UNCLASS</td>
			<td>0.117</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.027</td>
			<td>0.973</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo D_M</td>
			<td>286.5</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.999</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.002</td>
			<td>0.998</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ejemplo E_M</td>
			<td>126.0</td>
			<td>Abecedario</td>
			<td>0.995</td>
			<td>Neg</td>
			<td>0.167</td>
			<td>0.833</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Resultados del ensayo de expresión génica digital DLBCL90. Cinco muestras (A-E) no fueron macrodiseccionadas o macrodiseccionadas antes de que se realizaran extracciones con ácido nucleico. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90, para el cual el volumen máximo de entrada de ARN es de 5 μL. Las muestras no macrodiseccionadas se ejecutaron utilizando 5 μL de ARN madre. Cada muestra macrodiseccionada se ejecutó dos veces utilizando (a) 5 μL de ARN de stock a menos que fueran posibles alícuotas de 60 ng/μL y (b) 5 μL de ARN stock diluido para igualar las concentraciones/entrada de sus contrapartes no macrodiseccionadas. El sufijo _M denota que esa muestra fue macrodiseccionada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%202-62961R3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este protocolo presenta un método para aumentar el porcentaje de contenido tumoral de las muestras de tejido incrustadas en parafina fijadas en formalina.

Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we ...

Los tejidos incrustados en parafina fijada en formalina o FFPE son a menudo mezclas de materiales tumorales y no tumorales, donde la presencia de material no tumoral es a menudo no deseada y puede, si está presente en una proporción alta, afectar significativamente los resultados del análisis genómico, por lo que la principal ventaja de la macrodisección en comparación con el trabajo con tejidos no resecados es que las secciones de tejido resecado desparafinadas resultantes se pueden recolectar para la extracción de ARN y ADN. que luego se puede utilizar con confianza en el análisis genómico posterior. Saber que los materiales extraídos se derivan de tejidos con contenido tumoral mejorado con contribuciones mínimas de tejidos no tumorales contaminantes. El flujo de trabajo de varios pasos de este proceso será demostrado por el Sr. Lee Wisner, el Dr. Brandon Larsen y yo En preparación para la seccionamiento de tejidos, preabsorber los bloques de parafina en agua helada durante 10 a 15 minutos.Enfriar los bloques endurece la cera mientras que el agua humedece el tejido, lo que en conjunto facilita el corte del tejido. Mientras los bloques están en hielo, etiquete los portaobjetos del microscopio apropiadamente. Llene y caliente el baño de agua a 39 grados centígrados y ajuste el microtomo al grosor de corte deseado.Cargue con cuidado la cuchilla en el microtomo. Bloquee la cuchilla en su lugar y coloque el protector de seguridad hasta que esté listo para comenzar a seccionar los bloques. Mientras el protector de seguridad está en su lugar, inserte el bloque FFPE en el mandril del microtomo.Para comenzar, secciona el bloque lentamente hasta obtener una sección de cara completa. Esto se conoce como enfrentar el bloque. Una vez conseguido esto, el bloque puede estar en sección más rápido para obtener una cinta de secciones.Una vez cortada, transfiera la cinta de secciones de tejido al baño de agua tibia. Use fórceps para separar una sola sección de tejido de la cinta. Para hacerlo, coloque la parte posterior de las pinzas curvas cerradas en la unión entre las dos secciones y permita que las pinzas se abran suavemente para separar las secciones.Recoja la sección de tejido aislado en un portaobjetos de microscopio. Para evitar atrapar burbujas, inserte el portaobjetos del microscopio en el agua en ángulo. Agite suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua antes de colocarlo en la rejilla para que se seque al aire.Una vez seco, seleccione al menos una de las secciones de tejido recién cortadas para la tinción de hematoxilina y eosina, también conocida como H y E.Una vez teñida, envíe la diapositiva H y E para la revisión de patología. Durante la revisión de la patología, un patólogo experto revisa los portaobjetos de tinción H y E para determinar dónde se encuentra el tejido de interés en cada tejido. El patólogo primero revisa todo el tejido para determinar dónde residen los tejidos de interés dentro del tejido.Una vez que se completa la revisión histología y morfológica inicial, el patólogo utiliza un bolígrafo de marcado de diapositivas para anotar cada diapositiva teñida de H y E. Usando el marcador, el patólogo dibuja un círculo alrededor del tejido de interés, excluyendo el tejido que no es de interés. Este proceso de revisión se repite para todas las diapositivas teñidas de H y E en el proyecto.Configure el espacio de trabajo del banco de macrodisección que permita que cada muestra se maneje de forma secuencial y eficiente. Para cada muestra, deben estar a mano las secciones de tejido montadas en portaobjetos no teñidas patológicamente revisadas, así como los microtubos preetiquetados que contienen el tampón de digestión para la recolección de tejidos. Cargue las correderas sin manchas en un bastidor y proceda a la campana de humos para la desparafinización.Desparafinar los portaobjetos sumergiendo los portaobjetos en dos lavados secuenciales de D-limoneno sin diluir o CitriSolv seguidos de un lavado final en 100% etanol durante dos minutos por lavado. Al comienzo de cada lavado, agite suavemente el lavado durante unos cinco a 10 segundos. Para minimizar el arrastre entre lavados, permita que los toboganes se escurran brevemente y aplique la rejilla en la toalla de papel.Después de los tres lavados, los tejidos ahora son altamente visibles en los portaobjetos del microscopio. Deje que los toboganes se sequen al aire durante 10 minutos. Una vez secos, el H y el E se colocan boca abajo en el banco y el tejido desparafinado se coloca en la parte superior, también boca abajo, alineando el tejido desparafinado con el H y E.Una vez correctamente alineados, el área tumoral marcada por el patólogo en el H y E se traza en la parte posterior del portaobjetos de la sección de tejido desparafinado.Las diapositivas ahora marcadas sin teñir se sumergen en una solución de glicerol al 3% para minimizar la estática y ayudar a la recolección de tejidos. Retire los portaobjetos sumergidos lentamente para minimizar la cantidad de solución de glicerol que se adhiere al portaobjetos sumergido. Una vez retirado, limpie la parte posterior del portaobjetos y cualquier área libre de tejido en la parte frontal del portaobjetos para eliminar el exceso de glicerol.A continuación, utilizando una cuchilla limpia, traza las marcas de patología con la cuchilla para romper la conexión entre el tejido de interés y el resto del tejido. Teniendo en cuenta que este paso se puede hacer antes de la inmersión en glicerol, especialmente si las marcas patológicas son complejas, ya que cortar el tejido seco puede ser más fácil y también puede minimizar el riesgo de arrastre de tejido. El tejido fuera de las marcas de patología no es de interés.Estos se eliminan utilizando el borde plano de la cuchilla, asegurándose de que la esquina de la cuchilla enganche el exterior de las marcas de patología. Una vez que se elimina el tejido no deseado, se utiliza una nueva cuchilla para recoger el tejido de interés. El tejido recolectado se extrae de la cuchilla utilizando el extremo plano de un palo de madera y luego se transfiere a un microtubo premarcado con tampón de digestión, completando así el enriquecimiento de tejido tumoral mediado por macrodisección, que ahora está listo para la extracción de ácido nucleico.Para demostrar cómo la macrodisección puede afectar el análisis genómico posterior, las secciones de tejido de cinco linfomas difusos de células B grandes, o DLBCL, con diferentes contenidos tumorales se macrodisecaron o no se macrodisecaron. Se realizaron extracciones de ácido nucleico en los tejidos recolectados y se examinó el ARN resultante utilizando el ensayo de perfil de expresión génica digital DLBCL90, que también se conoce como el ensayo de firma de doble golpe. DLBCL se compone de tres subtipos moleculares distintos, a saber, GCB, ABC y su subtipo intermedio denotado no clasificado, que se puede determinar utilizando el ensayo DLBCL90.Este ensayo también es capaz de identificar tumores DLBCL que albergan translocaciones de doble impacto que involucran el gen BCL2. Los resultados de DLBCL 90 se muestran en esta tabla. Las muestras macrodisecadas se ejecutaron dos veces.Una vez usando su concentración de stock de ARN y una vez usando el stock de ARN diluido para que coincida con la concentración de sus respectivas contrapartes no macrodisecadas. Los resultados muestran que la macrodisección dio lugar a cambios de subtipo o llamada de doble golpe en tres de las cinco muestras. La macrodisección de la muestra A no tuvo ningún efecto en la llamada del subtipo, pero cambió la llamada de doble golpe de negativa a no clasificada, y este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección.Por el contrario, la macrodisección de la muestra C no tuvo ningún efecto en la llamada de doble golpe, pero cambió la llamada de subtipo de GCB a no clasificada, que también se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección. Al igual que en la muestra A, la macrodisección de la muestra E no tuvo ningún efecto en la llamada de subtipo, pero cambió la llamada de doble golpe. Sin embargo, para la muestra E, la llamada cambió de no clasificada a negativa, y nuevamente, lo hizo independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección.En particular, esta llamada cambiada a negativo de doble golpe tiene sentido biológico dado que se encontró que la muestra E era ABC y se ha informado que las translocaciones de doble golpe que involucran BCL2 se observan exclusivamente en tumores GCB. Juntos, estos resultados resaltan la importancia de la pureza tumoral y los ensayos genómicos y la macrodisección como una herramienta confiable para lograr esto. Después de ver este video, debe comprender mejor qué es la macrodisección, la importancia de la revisión patológica y los beneficios del estudio obtenidos al incluir la macrodisección en su flujo de trabajo de manejo de tejidos.

enhancing-tumor-content-through-tumor-macrodissection

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El video describe la disección láser del modelo de cocultivo organotípico 3D con precisión a nivel de micras. En los modelos organotípicos 3D, los constituyentes del estroma, como los fibroblastos, se cocultivan tridimensionalmente con células epiteliales cancerosas. El modelo 3D sirve como una herramienta experimental que permite estudiar la invasión y las interacciones cáncer-estroma en condiciones casi fisiológicas.

Microdisección láser: una técnica para aislar células invasoras de cáncer colorrectal a partir de un modelo de cultivo organotípico en 3D

Este video describe un método para la macrodisección manual de tejido canceroso a partir de muestras de tejido sin teñir para obtener un tejido canceroso específico. La sección de tejido se puede procesar aún más para obtener ADN para estudios de todo el genoma en cánceres gastrointestinales.

Macrodisección de tejido tumoral FFPE: una técnica para obtener tejido tumoral específico a partir de muestras sin teñir

Este video ilustra las pruebas de terapia adyuvante o adicional en un modelo de ratón con tumores subcutáneos resecados incompletamente. El ratón parcialmente resecado del tumor se trata con un anticuerpo dirigido a la proteína anticitotóxica de las células T reguladoras, lo que podría reducir el recrecimiento del tumor y sugerir una terapia adyuvante eficaz.

Terapia adyuvante en un modelo de ratón con un tumor subcutáneo resecado de forma incompleta

Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Los fibroblastos

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Aquí se describe un método para separar y enriquecer los componentes del microambiente tumoral inmune y no inmune en tumores subcutáneos establecidos. Esta técnica permite el análisis separado de infiltrado inmune tumor y fracciones de tumor no inmune que pueden permitir una caracterización completa del microambiente tumoral inmune.

Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.

Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral

Este protocolo describe un flujo de trabajo de alto rendimiento para la segmentación impulsada por inteligencia artificial de regiones de interés confirmadas por patología a partir de imágenes de sección de tejido delgado teñidas para el enriquecimiento de poblaciones celulares resueltas por histología utilizando microdisección láser. Esta estrategia incluye un algoritmo novedoso que permite la transferencia de demarcaciones que denotan poblaciones celulares de interés directamente a los...

Microdisección láser industrializada guiada por inteligencia artificial para el análisis proteómico a microescala del microambiente tumoral

Se propone un método novedoso para la exploración 3D y el mapeo virtual de las resecciones de cáncer con el objetivo de mejorar la comunicación entre el equipo multidisciplinario de atención oncológica.

Comunicación mejorada de los márgenes tumorales mediante escaneo y mapeo 3D

Aprende la macrodisección de tejidos FFPE para mejorar el contenido tumoral y la precisión del análisis genómico. Este método permite aislar material tumoral y reducir la contaminación de tejido no tumoral.

Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

Explorar más videos