Name: Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a aislar microglía primaria de ratones neonatos mediante separación magnética con microesferas CD11b. Este protocolo reproduce condiciones in vivo para estudiar la actividad fagocítica y respuestas inflamatorias en neurociencia.

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Las figuras fueron creadas usando BioRender. La investigación está financiada por Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, y una subvención adicional de Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

El protocolo fue aprobado, y todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices institucionales del Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Se presenta el aislamiento magnético de la microglía del cerebro de 24 crías de ratón OF1 (tanto machos como hembras) en P8, divididas en placas de 6 pocillos, 12 pocillos o 96 pocillos. El trabajo experimental se realizó bajo una campana para mantener condiciones estériles.
1. Preparación de soluciones estériles para aislamiento y cultivo celular
<ol><li>Prepare 50 ml de 1x solución salina balanceada de Hanks (HBSS) sin Ca 2+ y Mg2+ (HBSS-/-) de la solución 10x disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con la composición proporcionada en la Tabla 1 utilizando un kit de disociación de tejidos disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Prepare 200 ml de 1x HBSS con Ca 2+ y Mg2+ (HBSS+/+) a partir de la solución 10x disponible comercialmente.</li>
	<li>Prepare 200 ml de 1x PBS + 0.5% BSA (denominado tampón de clasificación celular).</li>
	<li>Preparar microperlas CD11b de acuerdo con la Tabla 2.</li>
	<li>Preparar 500 ml de medio de cultivo libre de suero de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Hacer alícuotas de 50 ml de tubos y almacenarlos a 4 °C. Esto se conoce como el medio microglia más adelante en el texto. NOTA: Todas las soluciones de aislamiento deben prepararse recientemente en condiciones estériles el día de la experimentación y mantenerse en hielo. El medio de cultivo de células microgliales puede prepararse, alicotizarse en tubos de 50 ml y mantenerse a 4 °C para su uso futuro. La filtración no es necesaria.</li>
</ol>2. Disección cerebral
<ol><li>Decapitar la cabeza del cachorro con unas tijeras grandes sin anestesia general previa.</li>
	<li>Cortar la piel desde el cuello hasta la nariz siguiendo la sutura sagital (15-20 mm) con tijeras pequeñas (Figura 1A-C).</li>
	<li>Inserte las puntas de una tijera pequeña dentro del foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado cuidadosamente hasta los ojos (Figura 1D, E).</li>
	<li>Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza (Figura 1F).</li>
	<li>Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue el cráneo con cuidado, teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente (Figura 1G-I).</li>
	<li>Retire el cerebelo y el bulbo olfativo con una cuchilla de afeitar y corte el cerebro en dos pedazos (Figura 1J).</li>
	<li>Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 30-40 ml de HBSS-/- (Figura 1K).</li>
</ol>3. Disociación cerebral y aislamiento microglial magnético
NOTA: Todas las manipulaciones y resuspensiones celulares deben realizarse con una pipeta de 1.000 μL con gran precaución. La aplicación de una alta acción mecánica puede activar o matar las células microgliales.
<ol><li>Transfiera 12 piezas cerebrales (~ 1.2 g) por tubo de disociación que contenga una mezcla de disociación de acuerdo con la Tabla 1. Para 24 cachorros, se necesitaron cuatro tubos en C (Figura 2A-B).</li>
	<li>Coloque los tubos C en el disociador (con el modo de calentamiento). Inicie el programa NTDK optimizado en el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2D).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recoger todas las células. Completar la disociación mecánica pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL (Figura 2E).</li>
	<li>Transfiera las células a cuatro tubos de 15 ml + filtros. Enjuague los filtros con 10 ml de HBSS+/+ (Figura 2F).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2G).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 6 ml de tampón de clasificación (paso 1.4) (Figura 2H).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de solución de microperlas CD11b (paso 1.5) por tubo y resuspender cuidadosamente (Figura 2I).</li>
	<li>Incubar los tubos durante 15-20 min a 4 °C. Resuspenda cuidadosamente el pellet con 6 ml de tampón de clasificación (Figura 2I-J).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspenda cuidadosamente el pellet con 8 ml de tampón de clasificación (Figura 2K).</li>
	<li>Siga el programa POSSEL en el separador (consulte la Tabla de materiales) para preparar ocho columnas. Transfiera las células 1 mL por 1 mL en la columna. Espere a que pasen todas las células antes de agregar otro ml. Células CD11b+ de elución en placa de elución estéril con 1 ml de tampón de clasificación (Figura 2L).</li>
	<li>Agrupar células CD11b+ en un nuevo tubo de 50 ml (Figura 2M).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 10 ml de medio microglial frío (paso 1.6) (Figura 2N).</li>
	<li>Cuente las células CD11b+. En P8, uno debe obtener ~ 650,000 células por cerebro. NOTA: En el protocolo actual, las celdas se contaron utilizando un contador de celdas automatizado (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Resuspender las células en medio de microglía fría hasta una concentración final de 650.000-700.000 células/ml y dispensar en placas de cultivo celular. NOTA: Las placas de 6 pocillos son para Western Blot (2 mL por pocillo); las placas de 12 pocillos son para análisis RT-qPCR (1 ml por pocillo) y las placas de 96 pocillos son para ensayo fagocítico (250 μL por pocillo); Los tres fueron utilizados para este trabajo. Sin embargo, en este manuscrito, los resultados del análisis de Western Blot no se muestran, pero es posible realizar con este protocolo.</li>
	<li>Colocar las placas a 37 °C con un 5% deCO2 durante la noche. Cambie el medio cuidadosamente con una pipeta de 1.000 μL con medio microglial precalentado.</li>
	<li>Colocar las placas a 37 °C con 5% deCO2 durante la noche antes de la estimulación. NOTA: No se recomienda aislar la microglía de más de 36 cachorros y después de P9. Esto aumentará el riesgo de contaminación y acumulación de restos celulares para activar la microglía.</li>
</ol>4. Estimulaciones celulares
<ol><li>Prepare los reactivos de estimulación de acuerdo con la Tabla 3 utilizando los reactivos disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir el volumen adecuado en cada bien estimulado. NOTA: El volumen apropiado depende de la concentración del estímulo y del tamaño del pozo.</li>
	<li>Colocar las placas a 37 °C con un 5% deCO2hasta el final de la estimulación a las 6 h, 24 h o 48 h.</li>
	<li>Para el análisis Western Blot, aspirar el sobrenadante y añadir 50 μL de tampón de lisis proteica (ver Tabla de materiales) con una pipeta. Usando puntas, rasque la parte inferior de la placa para separar las células lisadas y transfiéralas a tubos de 1,5 ml. Conservar a -80 °C. NOTA: Las placas de cultivo pueden conservarse durante años a -80 °C si el sobrenadante se aspira correctamente.</li>
	<li>Para el análisis RT-qPCR 6,31, aspirar el sobrenadante y almacenar las placas de cultivo directamente a -80 °C hasta la extracción del ARNm (paso 5).</li>
	<li>Para el ensayo fagocítico, consulte el paso 6.</li>
</ol>5. Extracción de ARNm y análisis de RT-qPCR
<ol><li>Realice la extracción de ARN, RT-PCR y RT-qPCR siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Consulte la Tabla 4 para las secuencias de cebadores5,6,31.</li>
	<li>Realizar el análisis de RT-qPCR siguiendo el informe publicado anteriormente5.</li>
</ol>6. Ensayo fagocítico
<ol><li>Estimular las células y realizar ensayos fagocíticos durante las últimas 3 h de la estimulación. Por ejemplo, para la estimulación de 6 h, comience el ensayo fagocítico después de 3 h de estimulación; y para la estimulación de 12 h, iniciar el ensayo fagocítico 9 h después del inicio de la estimulación.</li>
	<li>Calcule el número de cuentas necesarias para preparar considerando la proporción (1 celda: 50 cuentas). Para un pocillo de la placa de 96 pocillos, se requieren 8.1 x 106 cuentas. Prepare la mezcla de perlas de acuerdo con la Tabla 5. NOTA: Cuidadosamente haga un vórtice del vial de tallas antes de agregarlo a la mezcla PBS / FBS.</li>
	<li>Incubar durante 1 h en un baño maría a 37 °C. Vórtice cada 10 min.</li>
	<li>Calcule el volumen de solución para agregar a cada pozo. Añadir la solución e incubar durante 3 h.</li>
	<li>Enjuague los pocillos tres veces con 1x PBS. Lea la emisión de fluorescencia a 550 nm (longitud de onda de emisión Cy3).</li>
</ol>7. Control de calidad de pureza
<ol><li>Evaluar la pureza del aislamiento magnético CD11b por citometría de flujo (FACS) (antes y después de la clasificación celular), y luego realizar la RT-qPCR.<ol><li>Contar las células y resuspender en tampón FACS (PBS + 2 mM de EDTA + 0,5% de albúmina sérica bovina) para obtener una dilución de 10 x 106 células/ml después de los pasos 3.5 y 3.14.</li>
		<li>Después de 15 min del Fc convencional bloqueando 32,33, incubar las células durante 15 min con sonda de viabilidad (FVS780) y anticuerpos conjugados con fluoróforos contra CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 de ratón o sus correspondientes isotipos de control32,33 a la concentración recomendada por los fabricantes (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Lave las celdas con tampón FACS, fije y permeabilice con un kit de permeabilización disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Realizar el bloqueo Fc de nuevo en las células permeabilizadas, y luego incubar con anticuerpos conjugados con fluoróforos contra NeuN (ver Tabla de materiales) o su isotipo de control durante 15 min.</li>
		<li>Realice el análisis FACS después del lavado con tampón FACS.</li>
		<li>Después de excluir los dobletes y las células muertas en función de los parámetros morfológicos y la tinción FVS780, respectivamente, seleccione la estrategia de compuerta para la expresión superficial de CX3CR1 (microglía), ACSA-2 (astrocitos), O4 (oligodendrocitos) y presencia intracelular de NeuN (neuronas) para el análisis del porcentaje de células positivas.</li>
	</ol></li>
	<li>Después del paso 5, extraiga el ARNm y realice RT-qPCR para cuantificar Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Sinaptofisina y ARNm de Gfap . Normalizar Cq usando ARNm Rpl13a como reportero, y realizar una expresión relativa al ARNm de Itgam .</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El trabajo actual presenta un cultivo primario de células microgliales utilizando células CD11b + clasificadas magnéticamente. Además de la evaluación funcional microglial (RT-qPCR y ensayos fagocíticos), también se determinó la pureza del cultivo microglial.
Los cultivos clásicos de células microgliales se generan comúnmente a partir del cerebro neonatal de roedores P1 o P2 y el cocultivo con astrocitos durante al menos 10 días. Las microglías se separan mecánicamente usando un agitador orbit...

Las microglías son las células similares a los macrófagos residentes en el sistema nervioso central derivadas de precursores eritropoyéticos del saco vitelino que migran al neuroepitelio durante el desarrollo embrionario temprano1. Además de sus funciones de inmunidad, también juegan un papel importante durante el neurodesarrollo, particularmente para la sinaptogénesis, la homeostasis neuronal y la mielinización2. En la edad adulta, la microglía desarrolla largos procesos celulares para escanear el medio ambiente continuamente. En caso de rupturas de homeostasis como lesión cerebral o enfermedad cerebral, la microglía puede cambiar su apariencia morfológica para adoptar una forma ameboide, migrar a la zona lesionada, aumentar y liberar muchos factores citoprotectores o citotóxicos. Las microglías tienen estados de activación heterogéneos dependiendo de su etapa de desarrollo y del tipo de lesión sufrida 3,4,5. En este estudio, estos estados de activación se clasifican ampliamente en tres fenotipos diferentes: proinflamatorio/fagocítico, antiinflamatorio e inmunorregulador, teniendo en cuenta que, en realidad, la situación es probable que sea más compleja6.
El estudio de la activación microglial in vivo y la detección de estrategias neuroprotectoras en las primeras etapas del desarrollo cerebral puede ser un desafío debido a (1) la fragilidad de los animales antes del destete y (2) el bajo número de células microgliales. Por lo tanto, los estudios in vitro sobre la microglía son ampliamente utilizados para la toxicidad 7,8,9, las estrategias neuroprotectoras5,10,11,12,13,14 y los cocultivos 15,16,17,18,19,20,21 . Los estudios in vitro pueden utilizar líneas celulares microgliales, microglía derivada de células madre o cultivo primario de microglia. Todos estos enfoques tienen ventajas y desventajas, y la elección depende de la pregunta biológica inicial. Los beneficios del uso de cultivos primarios de microglia son los antecedentes genéticos homogéneos, la historia libre de patógenos y el control del momento en que la microglía es estimulada después de la muerte animal22.
A lo largo de los años, se desarrollaron diferentes métodos (citometría de flujo, agitación o marcado magnético) para cultivar microglia primaria de roedores, tanto neonatos como adultos 23,24,25,26,27,28,29. En el presente trabajo, el aislamiento de microglia de crías neonatales de ratón se realiza utilizando la tecnología de clasificación celular activada magnéticamente previamente descrita utilizando CD11b de ratón anti-ratón recubierto de microperlas25,27,29. CD11b es un receptor de integrina expresado en la superficie de las células mieloides, incluida la microglía. Cuando no hay un desafío inflamatorio dentro del cerebro, casi todas las células CD11b + son microglia30. En comparación con otros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, el presente protocolo equilibra los análisis de activación microglial ex vivo inmediato y el cultivo microglial primario in vitro común. Por lo tanto, las microglías son (1) aisladas en el día postnatal (P)8 sin eliminación de mielina, (2) cultivadas sin suero, y (3) expuestas a siRNA, miRNA, compuesto farmacológico y/o estímulos inflamatorios solo 48 h después del aislamiento cerebral. Cada uno de estos tres aspectos hace que el protocolo actual sea relevante y rápido. En primer lugar, el uso de la microglía pediátrica permite obtener células viables dinámicas y reactivas en cultivo sin requerir un paso adicional de desmielinización que podría modificar potencialmente la reactividad microglial in vitro. El presente protocolo tiene como objetivo acercarse lo más posible al entorno fisiológico de la microglía. De hecho, la microglía nunca encuentra suero, y este protocolo tampoco requiere el uso de suero. Además, la exposición de la microglía tan pronto como 48 h después del cultivo evita que pierdan sus facultades fisiológicas.

<table><tbody><tr><td>Anti ratón ACSA-2 PE Vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón CD11b BV421</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1106255</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón CD45 BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1115690</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón CX3CR1 PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1345075</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón NeuN PE</td><td>Milli-Mark</td><td>FCMAB317PE</td><td></td></tr><tr><td>anti ratón O4 Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-016</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Kit de permeabilización Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglía) MicroBeads, h, m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placa de cultivo celular de 12 pocillos, fondo plano + tapa</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placa de cultivo celular de 96 pocillos, fondo plano + tapa</td><td>Tubos Dutscher</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo Fc (Ratón CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Nikon ECLIPSE TE300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos (4 x 25 tubos)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Disociador con Calentadores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks +CaCl2 +MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14065049</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185045</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1725006CUST</td><td></td></tr><tr><td>Iscript c-DNA synthesis</td><td>Bio-rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de látex, poliestireno modificado con aminas, rojo fluorescente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2776-1mL</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos (LPS) de&nbsp; Escherichia coli&nbsp; O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Macrófago-SFM medio libre de suero</td><td>Thermo Scientific</td><td>12065074</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solución madre</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; m), 4 x 25 piezas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG1 PE</td><td>Millipore</td><td>MABC002H</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG2a PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2601265</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL1 beta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-684</td><td></td></tr><tr><td>Multi-24 Bloques de Columna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-691</td><td></td></tr><tr><td>MultiMACS Cell24 Separador</td><td>Miltenyi </td> Kit de Disociación de Tejido Neural Biotec <td></td><td></td></tr><tr><td>- Papain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Nucleocounter NC-200</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA Plus XS</td><td>Macherey Nagel</td><td>740990.5</td><td></td></tr><tr><td>Nun EZFlip Top Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>OPTILUX Placa de Petri - 100 x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>P&eacute; estreptomicina nicilina (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2b, k BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2b, k BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2603230</td><td></td></tr><tr><td>control de REA (S) PE vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-616</td><td></td></tr><tr><td>control de REA (S) Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-445</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IFN-gamma recombinante de ratón</td><td>R& D System</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante IL-10 Proteína</td><td>R& D System</td><td>417-ML</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante IL-4 Proteína</td><td>R& D System</td><td>404-ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de viabilidad (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

La microglía, como macrófagos residentes en el cerebro, es fundamental para varias funciones, incluida la respuesta al estrés ambiental y la homeostasis cerebral. La microglía puede adoptar un amplio espectro de fenotipos de activación. Además, la microglía que respalda el fenotipo proinflamatorio se asocia con trastornos del desarrollo neurológico y neurodegenerativos. Los estudios in vitro son ampliamente utilizados en la investigación para evaluar posibles estrategias terapéuticas en tipos específicos de células. En este contexto, el estudio de la activación microglial y la neuroinflamación in vitro utilizando cultivos microgliales primarios es más relevante que las líneas celulares microgliales o la microglía derivada de células madre. Sin embargo, el uso de algunos cultivos primarios puede adolecer de una falta de reproducibilidad. Este protocolo propone un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos. Aquí se demuestra la activación microglial utilizando varios estímulos después de 4 h y 24 h mediante la cuantificación de la expresión de ARNm y un ensayo fagocítico de perlas Cy3. Se espera que el trabajo actual proporcione una técnica fácilmente reproducible para aislar microglía fisiológicamente relevante de las etapas de desarrollo juvenil.

La microglía es el macrófago residente en el SNC que se activa cuando se expone a desafíos ambientales (trauma, moléculas tóxicas, inflamación)4,5,6,34 (Figura 3A). Los estudios in vitro sobre la microglía se utilizan comúnmente para evaluar los mecanismos autónomos celulares relacionados con esos desafíos ambientales y caracterizar el estado de activación...

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Este protocolo nos permite cultivar microglia en condiciones que imitan de cerca las características in vivo. Utilizando la tecnología de clasificación celular magnética, nuestro protocolo nos permite estimular la microglía solo dos días in vitro, sin usar ningún suero en el medio de cultivo. Para empezar, utiliza tijeras pequeñas para cortar la piel desde el cuello hasta la nariz, siguiendo la sutura sagital de 15 a 20 milímetros.Inserte las puntas con el foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado hasta los ojos. Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza.Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue cuidadosamente el cráneo. Con una cuchilla de afeitar, retire el cerebelo y el bulbo olfativo, y corte el cerebro en dos pedazos. Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 40 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio.Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con esta tabla. Transfiera 12 piezas cerebrales a un tubo C para un peso total de 1,2 gramos por tubo de disociación. Luego coloque tubos C en el disociador con calefacción.Inicie el programa NTDK optimizado en el disociador. Centrifugar durante 20 segundos. Completa la disociación mecánica pipeteando tres veces.Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mililitros con filtros conectados. Enjuague los coladores con 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio. Centrifugar durante 10 minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mililitros.Agregue cuidadosamente 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio, y vuelva a suspender el pellet. Nuevamente, centrifugar y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego agregue 200 microlitros de solución de microperlas CD11b e incube los tubos durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.Repita la centrifugación y vuelva a suspender el pellet con ocho mililitros de tampón de clasificación. A continuación, siga el programa Possel en el separador para preparar ocho columnas. Pase las células a través de la columna agregando un mililitro de suspensión celular a la vez.Con un mililitro de tampón de clasificación, eluya las células CD11b positivas en una placa de elución estéril. Agrupe las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar y volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio microglia frío.Contar las células CD11b positivas. Vuelva a suspender las células en medio microglial frío para obtener una concentración final de 650, 000 a 700, 000 células por mililitro. Dispensar la suspensión en placas de cultivo celular.Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio microglial precalentado y repita la incubación durante la noche. Estimular las células antes de este paso, y realizar un ensayo fagocítico durante las últimas tres horas de la estimulación.Calcule el número de cuentas de acuerdo con esta tabla en una proporción de 50 cuentas por celda. Preparar la mezcla de cuentas. Incubar el tubo durante una hora en un baño de agua a 37 grados centígrados.Vórtice cada 10 minutos. A cada pozo, agregue el volumen calculado de la solución de perlas e incube durante tres horas. Usando este enfoque, la actividad fagocítica de la microglía se evaluó después de la estimulación por factores proinflamatorios, como la interleucina-1 beta, más interferón gamma o lipopolisacáridos.Después de la estimulación durante seis a 24 horas, las perlas fluorescentes de microglía Cy3 se analizaron con microscopio confocal. Después de seis horas, la microglía comienza a las perlas de fagocitos Cy3 solo bajo la condición de interleucina-1 beta más interferón gamma. Después de 24 horas, hubo un aumento de la fluorescencia Cy3 para ambos tipos de estimulación, destacando el aumento de la actividad fagocítica.La pureza del cultivo microglial se elevó mediante citometría de flujo, que mostró un aumento en la viabilidad celular después de la clasificación. Utilizando citometría de flujo y marcadores de población de células RT-qPCR se analizaron antes y después de clasificar las células CD11b positivas de cerebros de ratones en el día ocho postnatal. Estos análisis distinguieron varias poblaciones de células cerebrales, como CX3CR135 para microglia, O4 u OLIG2 para oligodendrocitos, NeuN o sinaptofisina, para neuronas, y ACSA-2, o GFAP para astrocitos.Después de la clasificación celular utilizando el anticuerpo CD11b, solo se obtuvieron microglías. Es importante pipetear muy suavemente mientras se agrega la suspensión a la columna para evitar obstrucciones y evitar la muerte celular mecánica. Después de este método, se puede realizar proteómica transcriptómica, como la sangre occidental o Luminex, e incluso inmunoquímica para ver el efecto de la estimulación microglial.

magnetic-isolation-microglial-cells-from-neonate-mouse-for-primary

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

El video demostró el método de aislar y cultivar células del cerebro de un ratón neonatal. Implicó la disociación enzimática y mecánica del cerebro, seguida de cultivo en medios de crecimiento carentes de factor de crecimiento neuronal para obtener una población glial mixta.

Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Aprenda a aislar microglía primaria de ratones neonatos mediante separación magnética con microesferas CD11b. Este protocolo reproduce condiciones in vivo para estudiar la actividad fagocítica y respuestas inflamatorias en neurociencia.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

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