Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios
25 de julio de 2022
Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.
Este protocolo nos permite cultivar microglia en condiciones que imitan de cerca las características in vivo. Utilizando la tecnología de clasificación celular magnética, nuestro protocolo nos permite estimular la microglía solo dos días in vitro, sin usar ningún suero en el medio de cultivo. Para empezar, utiliza tijeras pequeñas para cortar la piel desde el cuello hasta la nariz, siguiendo la sutura sagital de 15 a 20 milímetros.
Inserte las puntas con el foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado hasta los ojos. Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza.
Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue cuidadosamente el cráneo. Con una cuchilla de afeitar, retire el cerebelo y el bulbo olfativo, y corte el cerebro en dos pedazos. Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 40 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio.
Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con esta tabla. Transfiera 12 piezas cerebrales a un tubo C para un peso total de 1,2 gramos por tubo de disociación. Luego coloque tubos C en el disociador con calefacción.
Inicie el programa NTDK optimizado en el disociador. Centrifugar durante 20 segundos. Completa la disociación mecánica pipeteando tres veces.
Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mililitros con filtros conectados. Enjuague los coladores con 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio. Centrifugar durante 10 minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mililitros.
Agregue cuidadosamente 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio, y vuelva a suspender el pellet. Nuevamente, centrifugar y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.
Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego agregue 200 microlitros de solución de microperlas CD11b e incube los tubos durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.
Repita la centrifugación y vuelva a suspender el pellet con ocho mililitros de tampón de clasificación. A continuación, siga el programa Possel en el separador para preparar ocho columnas. Pase las células a través de la columna agregando un mililitro de suspensión celular a la vez.
Con un mililitro de tampón de clasificación, eluya las células CD11b positivas en una placa de elución estéril. Agrupe las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar y volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio microglia frío.
Contar las células CD11b positivas. Vuelva a suspender las células en medio microglial frío para obtener una concentración final de 650, 000 a 700, 000 células por mililitro. Dispensar la suspensión en placas de cultivo celular.
Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio microglial precalentado y repita la incubación durante la noche. Estimular las células antes de este paso, y realizar un ensayo fagocítico durante las últimas tres horas de la estimulación.
Calcule el número de cuentas de acuerdo con esta tabla en una proporción de 50 cuentas por celda. Preparar la mezcla de cuentas. Incubar el tubo durante una hora en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Vórtice cada 10 minutos. A cada pozo, agregue el volumen calculado de la solución de perlas e incube durante tres horas. Usando este enfoque, la actividad fagocítica de la microglía se evaluó después de la estimulación por factores proinflamatorios, como la interleucina-1 beta, más interferón gamma o lipopolisacáridos.
Después de la estimulación durante seis a 24 horas, las perlas fluorescentes de microglía Cy3 se analizaron con microscopio confocal. Después de seis horas, la microglía comienza a las perlas de fagocitos Cy3 solo bajo la condición de interleucina-1 beta más interferón gamma. Después de 24 horas, hubo un aumento de la fluorescencia Cy3 para ambos tipos de estimulación, destacando el aumento de la actividad fagocítica.
La pureza del cultivo microglial se elevó mediante citometría de flujo, que mostró un aumento en la viabilidad celular después de la clasificación. Utilizando citometría de flujo y marcadores de población de células RT-qPCR se analizaron antes y después de clasificar las células CD11b positivas de cerebros de ratones en el día ocho postnatal. Estos análisis distinguieron varias poblaciones de células cerebrales, como CX3CR135 para microglia, O4 u OLIG2 para oligodendrocitos, NeuN o sinaptofisina, para neuronas, y ACSA-2, o GFAP para astrocitos.
Después de la clasificación celular utilizando el anticuerpo CD11b, solo se obtuvieron microglías. Es importante pipetear muy suavemente mientras se agrega la suspensión a la columna para evitar obstrucciones y evitar la muerte celular mecánica. Después de este método, se puede realizar proteómica transcriptómica, como la sangre occidental o Luminex, e incluso inmunoquímica para ver el efecto de la estimulación microglial.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo reproducible para aislar microglía primaria de ratones neonatos, utilizando tecnología de clasificación magnética. La metodología permite el cultivo de microglía en condiciones que replican de cerca las características in vivo, proporcionando información sobre su actividad fagocítica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación sobre Microglía
Antecedentes
- Las microglías desempeñan funciones cruciales en el sistema nervioso central.
- Comprender las respuestas microgliales a estímulos es importante para la investigación de la neuroinflamación.
- La clasificación magnética de células proporciona una estrategia viable para aislar microglías.
- Los protocolos anteriores pueden carecer de reproducibilidad o relevancia respecto a las condiciones in vivo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para el aislamiento y cultivo eficiente de microglía primaria.
- Permitir la evaluación de las respuestas de la microglía a estímulos inflamatorios.
- Evaluar la pureza y viabilidad de la microglía aislada.
Métodos Utilizados
- Método de cultivo celular que utiliza clasificación magnética para aislar microglía de ratones neonatos.
- El modelo biológico implica microglía cortical de crías neonatas.
- Se emplearon inmunoquímica y citometría de flujo para evaluar la pureza celular.
- Los pasos clave incluyen disección, disociación enzimática y clasificación utilizando microesferas de CD11b.
- Los ensayos de fagocitosis evaluaron la actividad microglial en respuesta a factores proinflamatorios.
Resultados principales
- Las microglías mostraron una actividad fagocítica aumentada en respuesta a condiciones inflamatorias específicas.
- Se confirmó un aumento en la viabilidad y pureza celular mediante citometría de flujo tras el ordenamiento.
- La microscopía confocal resaltó diferencias notorias en la actividad fagocítica según la duración de la estimulación.
- El método aclaró las distinciones entre diferentes poblaciones de células cerebrales.
Conclusiones
- Este estudio establece un método confiable para aislar microglía de ratón para experimentación in vitro.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de las funciones de la microglía y sus respuestas a la inflamación.
- Este protocolo sirve como base para investigaciones futuras sobre procesos neuroinflamatorios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo proporciona un método reproducible para aislar microglía primaria de ratones neonatos, lo que permite modelos in vitro fisiológicamente relevantes para la investigación de la neuroinflamación. Al alcanzar una alta pureza y viabilidad mediante clasificación magnética basada en CD11b, este enfoque apoya la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para trastornos del sistema nervioso central. El método mejora la confianza predictiva en el cribado preclínico al mantener la funcionalidad y los estados de activación de la microglía que imitan estrechamente las condiciones in vivo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los fenotipos de activación de los microglías y las respuestas proinflamatorias relacionadas con hipótesis sobre enfermedades neurodesarrolladoras y neurodegenerativas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema de cultivo estandarizado y libre de suero que reduce la variabilidad biológica y favorece estudios consistentes de interacción con dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados fagocíticos y transcripcionales cuantitativamente evaluable para la selección de compuestos moduladores en vías inflamatorias.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo de aislamiento escalable y reproducible, compatible con placas de múltiples pocillos y ensayos de estimulación a lo largo del tiempo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización relacionada con enfermedades al preservar marcadores de identidad de microglía (por ejemplo, CX3CR1) y respuestas funcionales a estímulos como IL-1β/IFN-γ y LPS.
- Valor operativo: Facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la purificación estandarizada y la validación funcional a través de citometría de flujo y microscopía confocal.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, proporcionando células primarias validadas para la comprobación de hipótesis, preparación de ensayos y generación de datos que orientan la identificación de compuestos prometedores y la evaluación de riesgos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la desactivación mecanicista mediante el aislamiento de microglía para aclarar la participación de vías en procesos neuroinflamatorios.
- Selección: Proporciona células listas para ensayos con lecturas fagocíticas y de ARNm cuantificables para estudios de cribado de compuestos y modulación de dianas.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, incluida la actividad fagocítica (incorporación de microesferas Cy3) y la expresión génica (RT-qPCR), para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la fidelidad fenotípica y la expresión de marcadores, facilitando la alineación de biomarcadores y la continuidad en la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable aplicable a múltiples proyectos que estudian la función de la microglía en modelos de enfermedades del SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista mediante modelos de microglía fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante clasificación magnética y condiciones de cultivo definidas, minimizando la variabilidad entre lotes.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos preclínicos confiables sobre la modulación del blanco y los perfiles de respuesta inflamatoria.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos del SNC basada en datos validados de participación de la microglía y resultados funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos neonatales, disociación enzimática y técnicas de separación magnética de células.
- Depende del acceso a ordenadores de células (por ejemplo, MACS), centrífugas e infraestructura estéril para cultivo de tejidos.
- Necesita una preparación estandarizada de reactivos y tiempos de incubación para garantizar un rendimiento y viabilidad consistentes de células positivas para CD11b.
- La adaptación a otros sistemas modelo o etapas de desarrollo puede requerir la optimización de los parámetros de disociación y clasificación.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad mecánica durante el paso por la columna, lo que exige pipeteo suave para evitar obstrucciones y daño celular.
