Name: Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Descubre la formación de condensados EWS-FLI1 en ADN mediante imágenes de molécula única con cortinas de ADN. Este método revela la dinámica de separación de fases de factores de transcripción en sarcoma de Ewing.

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<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Como los enfoques de una sola molécula son extremadamente sensibles al contenido del sistema de reacción, se debe invertir un esfuerzo adicional para garantizar la buena calidad de todos los materiales y soluciones durante los experimentos de cortinas de ADN, especialmente los lípidos preparados en las secciones 1 y 2 y los tampones utilizados en la sección 5. Se deben usar reactivos de mayor pureza para preparar tampones, y los tampones deben estar recién preparados para el ensayo de molécula única.
<p class="jove_c...

La regulación transcripcional es un paso crucial para la expresión génica precisa en las células vivas. Muchos factores, como la modificación cromosómica, los factores de transcripción (TF) y los ARN no codificantes, participan en este complicado proceso 1,2,3. Entre estos factores, los TF contribuyen a la especificidad de la regulación transcripcional al reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN conocidas como promotores o potenciadores y posteriormente reclutar otras proteínas funcionales para activar o reprimir la transcripción 4,5,6,7. La forma en que estos TF logran buscar sus sitios objetivo en el genoma humano e interactuar con el ADN recubierto con histonas y proteínas de unión al ADN no histonas ha dejado perplejos a los científicos durante décadas. En los últimos años, se han construido varios modelos clásicos para el mecanismo de búsqueda de objetivos de los TF para describir cómo se "deslizan", "saltan", "saltan" o "transfieren intersegmentos" a lo largo de la cadena de ADN 8,9,10,11. Estos modelos se centran en el comportamiento de búsqueda en el ADN de una sola molécula de TF. Sin embargo, estudios recientes muestran que algunos TF se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) ya sea solos en el núcleo o con el complejo mediador12. Las gotitas observadas de TFs están asociadas con las regiones promotoras o potenciadoras, destacando el papel de la formación de condensado biomolecular en la transcripción y el genoma tridimensional13,14,15. Estos condensados biomoleculares están vinculados a compartimentos carentes de membrana in vivo e in vitro. Se forman a través de LLPS, en el que las biomacromoléculas modulares y las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) de proteínas son dos fuerzas impulsoras principales de las interacciones multivalentes16. Así, los TF no sólo buscan ADN, sino que también funcionan sinérgicamente dentro de estos condensados 4,17,18. Hasta la fecha, la propiedad biofísica de estos condensados de transcripción en el ADN sigue sin estar clara.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo aplicar un método de molécula única, DNA Curtains, para obtener imágenes directas de la formación y dinámica de los condensados de transcripción formados por TF en ADN in vitro. DNA Curtains, una plataforma de imágenes in vitro de alto rendimiento para estudiar la interacción entre las proteínas y el ADN, se ha aplicado en la reparación del ADN 19,20,21, la búsqueda de objetivos22 y LLPS 17,23,24. La célula de flujo de las cortinas de ADN está recubierta con bicapas lipídicas biotiniladas para pasivar la superficie y permitir que las biomoléculas se difundan en la superficie. Los patrones en zigzag nanofabricados limitan el movimiento del ADN. Los sustratos de ADN lambda biotinilados pueden alinearse a lo largo de los bordes de la barrera y ser estirados por el flujo de amortiguación orientado. Las mismas secuencias inicial y final de todas las moléculas permiten el seguimiento de la proteína en el ADN y describen la distribución de la posición de los eventos de unión25,26. Además, la combinación de cortinas de ADN con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) ayuda a minimizar el ruido de fondo y detectar señales a nivel de molécula única. Por lo tanto, las cortinas de ADN podrían ser un método prometedor para investigar la dinámica de la formación de condensado de transcripción en motivos de ADN. Este artículo describe el ejemplo de una oncoproteína de fusión de la familia FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generada por translocación cromosómica. El ADN lambda que contiene 25× GGAA, la secuencia de unión de EWS-FLI127, se utilizó como sustrato de ADN en los experimentos DNA Curtains para observar cómo las moléculas EWS-FLI1 se someten a LLPS en el ADN. Este manuscrito discute el protocolo experimental y los métodos de análisis de datos en detalle.

<table><tbody><tr><td>Láser de estado sólido bombeado por diodo de 488 nm</td> Láser de estado sólido <td>Coherent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 nm con bomba de diodo</td><td>Coherent</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>El recubrimiento protector conductor</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I bovino</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Packing Extracts</td>: <td>Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Caldo</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, LACTATO DE ETILO 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOL 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Cámara CMOS Scientific</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio de sílice</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Válvula de inyección de seis vías</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Diluido con ddH2O Bomba de</td></tr><tr><td>jeringa</td><td>Harvard</td><td>Apparatus11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Yoduro (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Diluido con DMSO</td></tr></tbody></table>

imágenes de una sola molécula de condensados ews-fli1 ensamblados en adn

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Los genes de fusión resultantes de la translocación cromosómica se han encontrado en muchos tumores sólidos o leucemia. EWS-FLI1, que pertenece a la familia de oncoproteínas de fusión FUS/EWS/TAF15 (FET), es uno de los genes de fusión más frecuentemente involucrados en el sarcoma de Ewing. Estas proteínas de fusión de la familia FET típicamente albergan un dominio de baja complejidad (LCD) de proteína FET en su extremo N y un dominio de unión al ADN (DBD) en su extremo C. Se ha confirmado que EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares en sus loci de unión objetivo debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, y estos condensados pueden reclutar ARN polimerasa II para mejorar la transcripción génica. Sin embargo, no está claro cómo se ensamblan estos condensados en sus sitios de unión. Recientemente, se aplicó un método biofísico de una sola molécula, DNA Curtains, para visualizar estos procesos de ensamblaje de condensados EWS-FLI1. Aquí, se discuten el protocolo experimental detallado y los enfoques de análisis de datos para la aplicación de cortinas de ADN en el estudio de los condensados biomoleculares que se ensamblan en el ADN objetivo.

El esquema de las cortinas de ADN se muestra en la Figura 1A, Figura 1B y Figura 1D. La secuencia diana clonada que contiene 25 repeticiones ininterrumpidas de GGAA se encuentra en el promotor NORB1 en el sarcoma de Ewing. Esta secuencia objetivo es crucial para el reclutamiento de EWS-FLI128. Las moléculas EWS-FLI1 se visualizaron detectando las señales EWS-FLI1 marcadas con mCherry obtenidas con un...

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Proporcionamos un ensayo de molécula única para observar la separación de fases de los factores de transcripción en el ADN Esta técnica permite la realización en tiempo real del proceso dinámico de los factores de transcripción que se ensamblan como una gota líquida en el ADN. EWS-FL1 es uno de los genes de fusión más frecuentemente implicados en la tumorigénesis del sarcoma de Ewing. Nuestra investigación podría identificar la relación entre el número de motivos de ADN y la formación de condensado EWS-FL1 que se asocia con una transcripción genética estéril en las células tumorales, y tal vez útil para el pronóstico.Este método podría aplicarse para estudiar cualquier condensado o complejo de transcripción in vitro, como P53 y MED1. Para preparar una celda de flujo con barreras nanofabricadas en zigzag para un experimento de cortina de ADN, conecte los tubos de entrada y salida en la dirección correcta. Luego lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón lipídico usando dos jeringas de tres mililitros, asegurándose de que no haya burbujas en la celda de flujo.Retire la jeringa de la salida e inyecte un mililitro de la solución liposómica tres veces con una incubación de cinco minutos entre cada inyección. Para la curación, vuelva a lavar la celda de flujo con 2,5 mililitros de tampón lipídico lentamente e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Durante la incubación, prepare el tampón BSA como se menciona en el texto manuscrito.Luego, después de 30 minutos de curación, lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón BSA desde el lado de salida. A continuación, inyecte 800 microlitros de tampón de estreptavidina en la celda de flujo desde el lado de entrada en dos pasos con una incubación de 10 minutos después de cada paso. Luego lave la celda de flujo con 2.5 mililitros de tampón BSA para eliminar todas las moléculas de estreptavidina libres.A continuación, diluya el ADN lambda de biotina con motivos clonados utilizando tampón BSA e inyecte cuatro veces lentamente a intervalos de cinco minutos. Durante la inyección, encienda el microscopio en el sistema semiconductor de óxido metálico complementario científico. Luego lave el tubo con 10 mililitros de agua destilada doble y enjuague el prisma y el conector del tubo con agua, limpiador de cubeta líquido al 2% y etanol al 99%.A continuación, extraiga al menos 20 mililitros del tampón de imágenes en una jeringa de 30 mililitros. Configure la celda de flujo en la etapa del microscopio y conéctela al sistema microfluídico. Usando un caudal de 0,03 mililitros por minuto, enjuague las moléculas de ADN a la barrera durante 10 minutos.Luego apague el sistema microfluídico e incube durante 30 minutos. con el flujo detenido, permitiendo que el ADN se difunda lateralmente. Para obtener imágenes de la formación de condensación EWS-FLI1 en cortinas de ADN, abra el software de imágenes y encuentre y marque las posiciones de los nueve patrones en zigzag bajo campo claro.Luego encienda el flujo a 0.2 mililitros por minuto para teñir el ADN con tinte de ADN de doble cadena durante 10 minutos. A continuación, diluya la proteína mCherry EWS-FLI1 con el tampón de imágenes a una concentración de 100 nanomoles en 100 microlitros. Luego cargue la muestra de proteína a través de la válvula con una jeringa de vidrio de 100 microlitros y cambie el caudal a 0.4 mililitros por minuto.Después de encender el láser de 488 nanómetros, escanee previamente cada región para verificar el estado de distribución del ADN y seleccionar la región en la que las moléculas de ADN se distribuyen uniformemente. Luego ajuste la potencia del láser al 10% para el láser de 488 nanómetros y al 20% para el láser de 561 nanómetros. Y usando el medidor de potencia, mida la potencia real del láser cerca del prisma.Comience a adquirir imágenes a intervalos de dos segundos con láseres de 488 y 561 nanómetros simultáneamente. Luego, cambie la válvula del modo manual al modo de inyección para permitir que el tampón de imágenes enjuague la muestra de proteína en la celda de flujo después de 60 segundos. Para eliminar el EWS-FLI1 libre, siga lavando la celda de flujo con el tampón de imágenes durante cinco minutos con solo el láser de 561 nanómetros encendido.Luego detenga el flujo e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos, encienda el flujo a 0,4 mililitros por minuto para permitir que el ADN se extienda y adquiera imágenes a intervalos de dos segundos entre diferentes fotogramas para obtener datos de alto rendimiento de la formación de condensado EWS-FLI1. Las moléculas EWS-FLI1 se visualizaron detectando las señales EWS-FLI1 marcadas con mCherry obtenidas con un láser de 561 nanómetros.La formación in vitro de condensado EWS-FLI1 en el sitio de las 25 repeticiones GGAA en el sustrato de ADN podría visualizarse directamente. La especificidad del mCherry EWS-FLI1 utilizado en cortinas de ADN se confirmó mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética utilizando una plantilla de ADN con y sin las 25 repeticiones GGAA por separado. Cuando la concentración de EWS-FLI1 se tituló de 20 a 500 nanomoles, la intensidad de EWS-FLI1 aumentó drásticamente.Mientras que el cambio en la intensidad de FLI una DBD fue insignificante cuando las proteínas se saturaron para cubrir las repeticiones GGAA, lo que sugiere que EWS-FLI1 formó condensados en el ADN. La inyección debe ser muy lenta y suave para que el liposoma y el ADN puedan distribuirse uniformemente en la célula de flujo. Es importante realizar MSA para confirmar que un factor de transcripción purificado se une específicamente con la secuencia objetivo in vitro.Esta técnica permite a las personas explorar si el condensado facilitará la búsqueda objetivo de los factores de transcripción y su efecto sobre la transcripción.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Descubre la formación de condensados EWS-FLI1 en ADN mediante imágenes de molécula única con cortinas de ADN. Este método revela la dinámica de separación de fases de factores de transcripción en sarcoma de Ewing.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

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