Name: Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a identificar poblaciones inmunes pulmonares en ratones mediante citometría de flujo de 9 colores. Este protocolo estandarizado permite distinguir hasta 12 tipos celulares diferentes para estudios de inmunología respiratoria.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA238263 y R01CA229784 (VAB).

Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo pautas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Beth Israel Deaconess. Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis a diez semanas de edad de ambos sexos para desarrollar este protocolo.
1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos
<ol><li>Eutanasiar al ratón inyectando intraperitonealmente 1 ml de tribromoetanol (preparado según protocolo estándar; Tabla de Materiales). NOTA: La asfixia por CO2 debe evitarse en los estudios pulmonares, ya que podría causar lesiones pulmonares y alterar las características y propiedades de las células inmunes pulmonares. La dislocación cervical también debe evitarse, ya que podría causar lesiones mecánicas del pulmón.</li>
	<li>Transfiera el mouse a un área limpia y dedicada para la operación quirúrgica.</li>
	<li>Estabilice el lado dorsal del ratón hacia abajo mediante el uso de agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades. Use etanol al 70% para desinfectar la piel del área ventral.</li>
	<li>Realice una incisión en la piel, desde el cuello hasta el abdomen. Retire con cuidado la piel del área torácica.</li>
	<li>Retire con cuidado el esternón y las costillas.</li>
	<li>Enjuague los pulmones inyectando 10 ml de PBS frío directamente en el ventrículo derecho, usando una aguja de 18-21 G, hasta que los pulmones se vuelvan completamente blancos.</li>
	<li>Retire con cuidado el timo y el corazón sin tocar los pulmones.</li>
	<li>Separe suavemente los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo con tampón BSA frío (Tabla 1). NOTA: Se debe hacer un esfuerzo para eliminar toda la grasa adyacente de los pulmones antes de preparar aún más la suspensión unicelular, ya que esto podría sesgar las lecturas.</li>
</ol>2. Preparación de la suspensión unicelular
<ol><li>Transfiera los pulmones a una placa de Petri vacía y pica con dos bisturíes finos. Transfiera todas las piezas del pulmón picado a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Use 5 ml de tampón de digestión para lavar la placa y agréguela al tubo de 50 ml que contiene el pulmón picado (Tabla 1). NOTA: El tampón de digestión debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Utilizar 5 mg/ml de colagenasa28. La combinación de 1 o 5 mg de colagenasa con tampón de BSA o PBS libre de proteínas no mejoró los resultados (Figura suplementaria S1).</li>
	<li>Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rpm a 37 °C. Detenga la reacción agregando 10 ml de tampón BSA frío.</li>
	<li>Después de la digestión, use una aguja de 18 G para mezclar y disolver las piezas pulmonares. Coloque un filtro de 70 μm en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml. NOTA: El uso de un filtro de micras más pequeño podría resultar en la pérdida de las principales poblaciones mieloides.</li>
	<li>Transfiera lentamente la mezcla pulmonar digerida directamente sobre el colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 ml para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro. Lave el material procesado en el filtro con tampón BSA.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión monocelular a 350 × g durante 8 min a 4 °C.</li>
	<li>Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de tampón de lisis ACK. Mezclar bien con una pipeta de 1 ml, e incubar durante 90 s a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 10 ml de tampón BSA frío para detener la reacción y centrífuga a 350 × g durante 7 min a 4 ° C.Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en Staining Buffer para contar las células con un hemocitómetro.</li>
	<li>Resuspend las células a una concentración de 5 × 106 células/ml y utilizarlas para la tinción superficial (ver sección 3). NOTA: Para este propósito, coloque las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos seguida de tinción y lavado de anticuerpos. Si no hay disponible una centrífuga de placas, use tubos de flujo en lugar de placas. Con este protocolo, se pueden obtener ~ 15-20 × 106 células por pulmón de un ratón C57BL / 6 de 6-10 semanas de edad de tamaño promedio.</li>
</ol>3. Tinción de anticuerpos de superficie
<ol><li>Transfiera 1 × 106 células en 200 μL por pozo en una placa de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 350 × g durante 7 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo fc diluyendo el anticuerpo anti-16/32 (1:100) en tampón de tinción (Tabla 1).</li>
	<li>Resuspend las células en 50 μL de la solución de bloqueo de Fc preparada previamente (Tabla de Materiales) e incubar durante 15-20 min a 4 °C o en hielo.</li>
	<li>Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugar la placa a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie (1:100; Tabla 2) en tampón de tinción. NOTA: (i) El anticuerpo anti-16/32 para el bloqueo de Fc se puede usar con los anticuerpos de superficie en la misma mezcla. ii) Si se utiliza un colorante de viabilidad fijable, agréguelo al cóctel de anticuerpos de superficie a una dilución de 1:1.000.</li>
	<li>Resuspend las células en 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie pre-preparado e incubar durante 30-40 min a 4 °C en la oscuridad. Lave las células con tampón de tinción dos veces. NOTA: Si no se requiere tinción intracelular, resuspender las células en 200 μL de tampón de tinción y proceder directamente a la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Alternativamente, las células pueden fijarse y almacenarse a 4 °C para su adquisición posterior. Recomendamos usar las células para la citometría de flujo dentro de las 24 h.</li>
</ol>4. Fijación celular y tinción intracelular
<ol><li>Prepare el búfer de fijación/permeabilización (Fix/Perm Buffer) mezclando tres partes de concentrado de fijación/permeabilización y 1 parte del diluyente de fijación/permeabilización del FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Tabla 1).</li>
	<li>Resuspendir las células en 50 μL del Fix/Perm Buffer pre-preparado por pocillo de la placa de 96 pocillos, donde las células fueron chapadas como se describe en la sección 3, e incubarlas durante 20-25 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Diluya el tampón de permeabilización 10x como 1: 10 en agua desionizada purificada para preparar 1x tampón de permeabilización.</li>
	<li>Lave las células una vez con 1x tampón de permeabilización. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos intracelulares diluyendo los anticuerpos intracelulares (1:100) en 1 ml de tampón de permeabilización.</li>
	<li>Resuspend las células usando 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie pre-preparado por célula de la placa de 96 pocillos e incubar durante 40 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Lave las células una vez con tampón de permeabilización y una vez con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción. NOTA: Si no hay ningún citómetro de flujo con lector de placas disponible, transfiera las células a tubos de citometría de flujo.</li>
	<li>Adquirir un mínimo de 1,5 × 106 células por muestra en el citómetro de flujo. NOTA: Para colores individuales y muestras de control no teñidas, 0.5-1 × 106 celdas por muestra serán suficientes. Se recomienda titular los anticuerpos individuales utilizados para lograr una tinción óptima y reducir los costos. El protocolo actual se ha optimizado utilizando Fix/Perm Buffer preparado utilizando el conjunto de búferes de tinción FoxP3. Debido a que CD68 es un citoplasmático y no un marcador nuclear, otras soluciones de permeabilización, como una baja concentración de paraformaldehído o kits de citofijo / citopermo de varios proveedores podrían ser suficientes.</li>
</ol>

<ol><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
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<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve-associated%2C+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).</li>
<li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li>
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<li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1%2FM2+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li>
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<li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li>
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<li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li>
<li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li>
<li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).</li>
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</ol>

V.A.B. tiene patentes sobre la vía PD-1 licenciadas por Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis y Dako. Los autores no declaran otros intereses financieros contrapuestos.

La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en el espacio alveo...

El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206+ pueblan el área peribronquial y perivascular, mientras que los IM CD206- se encuentran en el intersticio alveolar3. Recientemente se han propuesto algunas subclasificaciones de IM3,4,5,6. Aunque los IM están menos estudiados que los AM, la evidencia reciente apoya su papel crucial en la regulación del sistema inmune del pulmón7. Además, CD206 también se expresa en AMs8 activado alternativamente.
Las células dendríticas pulmonares (CD) son otro grupo heterogéneo de células inmunes pulmonares con respecto a sus propiedades funcionales, ubicación y origen. Se han descrito cuatro subcategorías de DC en el pulmón: DC CD103+ convencionales (también conocidos como cDC1), CD CD11b+ convencionales (también conocidos como cDC2), DC derivados de monocitos (MoDC) y DC plasmocitoides9,10,11,12,13. Las tres primeras subclases se pueden definir como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Los DC plasmocitoides expresan MHC II y son intermediamente positivos para CD11c, pero expresan altos niveles de B220 y PDCA-19,13,16. En los pulmones murinos naïve, los CD CD103 y cd11b se localizan en el intersticio de las vías respiratorias, mientras que los CD plasmocitoides se localizan en el intersticio alveolar17.
Dos poblaciones principales de monocitos residen en el pulmón durante el estado estacionario: monocitos clásicos y monocitos no clásicos. Los monocitos clásicos son Ly6C+ y son críticos para la respuesta inflamatoria inicial. Por el contrario, los monocitos no clásicos son Ly6C- y han sido ampliamente vistos como células antiinflamatorias3,16,18. Recientemente, se describió una población adicional de monocitos CD64+CD16.2+, que se originan a partir de monocitos Ly6C- y dan lugar a IM CD206+3.
Los eosinófilos aparecen principalmente en los pulmones durante la infección por helmintos o afecciones alérgicas. Sin embargo, hay un pequeño número de eosinófilos en el parénquima pulmonar durante el estado estacionario, conocidos como eosinófilos residentes. A diferencia de los eosinófilos residentes, los eosinófilos inflamatorios se encuentran en el intersticio pulmonar y el lavado broncoalveolar (BAL). En modelos de ratón de ácaros del polvo doméstico (HDM), los eosinófilos inflamatorios se reclutan en el pulmón después de la estimulación mediada por antígenos. Se ha propuesto que los eosinófilos residentes podrían tener un papel regulador en la alergia al inhibir la sensibilización del T helper 2 (Th2) a HDM19.
A diferencia del resto de células mieloides pulmonares, los neutrófilos expresan Ly6G pero no CD68 y se caracterizan por una firma del inmunofenotipo CD68-Ly6G+16,20,21. Los estudios de visualización han demostrado que durante el estado estacionario, el pulmón reserva un grupo de neutrófilos en el compartimento intravascular y alberga un número considerable de neutrófilos extravasculares22. Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos no se encuentran en BAL en estado estacionario; sin embargo, varias formas de estimulación inmune, como el desafío LPS, el asma o la neumonía, conducen a los neutrófilos a la luz alveolar, lo que resulta en su presencia en BAL21,22,23.
Un número sustancial de células CD45+ del pulmón representan un asesino natural (NK), células T y células B y son negativas para la mayoría de los marcadores mieloides24. En los pulmones de ratones ingenuos, estos tres tipos de células se pueden identificar en función de la expresión de CD11b y MHC II18. Alrededor del 25% de las células CD45+ pulmonares son células B, mientras que el porcentaje de células NK es mayor en el pulmón que en otros tejidos linfoides y no linfoides24,25,26. Entre las células T pulmonares, una fracción considerable es CD4-CD8- y juega un papel importante en las infecciones respiratorias26.
Debido a que el pulmón alberga un sistema inmune muy complejo y único, se han desarrollado y reportado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares16,18,20,27. La estrategia de cierre descrita en este documento proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones diferentes de inmunitarias mieloides pulmonares y no mieloides utilizando 9 marcadores. Se han utilizado marcadores adicionales para validar los resultados. Además, se proporciona un método detallado para la preparación de una suspensión unicelular que minimiza la muerte celular y permite la identificación del perfil más completo del compartimiento de células inmunes del pulmón. Cabe destacar que la identificación de células no inmunes del pulmón, como las células epiteliales (CD45-CD326+CD31-), las células endoteliales (CD45-CD326-CD31+) y los fibroblastos requiere un abordaje diferente28,29. La identificación de tales poblaciones no está incluida en el protocolo y método descritos aquí.

<table><tbody><tr><td>Émbolo de jeringa de 10 mL</td><td>EXELINT</td><td>26265</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 18 G</td><td>Aguja BD Precision Glide</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 21 g</td><td>Aguja BD Precision Glide</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células</td><td>ThermoFisher 22363548</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Falcon/corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisado</td><td>ThermoFisher</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101215</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>anti-ratón CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117339 / 117337</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>anti-ratón CD45</td><td>Biolegend</td><td>103115</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>anti-ratón CD64</td><td>Biolegend</td><td>139319</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>anti-ratón CD68</td><td>Biolegend</td><td>137009</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>anti-ratón GR-1</td><td>Biolegend</td><td>108433</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>Siglec F</td><td>Biolegend</td><td>155503</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>AVERTIN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>Biolegend</td><td>103228</td><td>Para más detalles, véase la Tabla 2</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Biolegend</td><td>121405 / 121419</td><td>Para más detalles, véase la Tabla 2</td></tr><tr><td>CD24</td><td>Biolegend</td><td>138503</td><td>Para más detalles, véase la Tabla 2</td></tr><tr><td>CD3</td><td>Biolegend</td><td>100205</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr>: <tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Colagenasa Tipo 1</td>, <td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1</td><td>Biolegend</td><td>149005</td><td>Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2</td></tr>: <tr><td>DNasa I</td>, <td>Millipore Sigma 10104159001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123133</td><td>Para más detalles, véase la Tabla 2</td></tr><tr><td>FcBlock (CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101301</td><td>Para más detalles, véase la Tabla 2</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas dentadas finas</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Juego de tampones de tinción con factor de transcripción</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Futura Safety Scalpel Merit</td><td>Medical Systems</td><td>SMS210</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L34973</td><td>Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>MERTK</td><td>Biolegend</td><td>151505</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>MHC-II</td><td>Biolegend</td><td>107621</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>Biolegend</td><td>108705</td><td>Para obtener más información, consulte la Tabla 2</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>Modelo 200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa refrigerada</td><td>SORVAL ST 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tijera curva pequeña</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.

Estrategia de cierre El primer paso de nuestra estrategia de cierre es la exclusión de los escombros y dobletes (Figura 1A). La exclusión cuidadosa de los dobletes es fundamental para evitar poblaciones falsamente positivas (Figura suplementaria S2). Luego, las células inmunes se identifican utilizando CD45+, un marcador para las células hematopoyéticas (Figura 1B). La mancha de muerto vivo se puede agregar para ex...

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Debido a que el pulmón alberga un sistema inmunológico muy complejo y único, se han desarrollado e informado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares. La existencia de varios enfoques diferentes dificulta la comparación de los resultados generados por diferentes laboratorios. Nuestra estrategia de cierre proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones inmunes mieloides pulmonares y no mieloides diferentes utilizando nueve marcadores.El presente protocolo describe la caracterización e identificación de poblaciones inmunes pulmonares en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo se puede emplear para identificar cambios de estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad, donde puede ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad del panorama inmune pulmonar. Los investigadores que realizan esta técnica por primera vez deben prestar atención a las condiciones de digestión y los reactivos, ya que marcan una gran diferencia en la liberación de células inmunes del tejido pulmonar.Comience por preparar al animal sacrificado para la cirugía. Estabilice el ratón dorsalmente usando agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades, luego use etanol al 70% para desinfectar la piel del área ventral. Haga una incisión desde el cuello hasta el abdomen.Retire la piel del área torácica, junto con las costillas y el esternón. Enjuague los pulmones inyectando 10 mililitros de PBS frío en el ventrículo derecho con una aguja de calibre 18 a 21 hasta que se vuelvan completamente blancos. Luego, retire el timo y el corazón sin tocar los pulmones.Separe los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo que contenga tampón BSA frío. Transfiera el pulmón a una placa de Petri, pica con dos bisturíes finos y luego colóquelo en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón de digestión para lavar el plato.Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados. Detenga la reacción agregando 10 mililitros de tampón BSA frío. Después de la digestión, mezcle y disuelva las piezas pulmonares con una aguja de calibre 18.Coloque un filtro de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y transfiera la mezcla pulmonar digerida al colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 mililitros para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro y lavarlo con tampón BSA. Centrifugar la suspensión unicelular a 350 G durante ocho minutos a siete grados centígrados.Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de tampón de lisis ACK. Mezclar la suspensión con una pipeta de un mililitro e incubarla durante 90 segundos a temperatura ambiente. Agregue 10 mililitros de tampón BSA frío a la mezcla de reacción y centrífuga a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en tampón de tinción y cuente las células con un hemocitómetro. Resuspend las células a una concentración de 5 millones de células por mililitro para la tinción superficial. Transfiera 1 millón de células en 200 microlitros por pozo a una placa de 96 pocillos y centrífuga la placa a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.Prepare una solución de bloque de citometría de flujo diluyendo el anticuerpo anti-1632 en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de bloque de citometría de flujo. Incubar la suspensión durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados o en hielo.Luego, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a la placa y centrífuga 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Prepare la solución de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos de superficie e incubar la placa a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Luego, lave las células dos veces con tampón de tinción. Prepare el tampón de fijación y permeabilización mezclando tres partes de diluyente de fijación y permeabilización y una parte de tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros del tampón prepreparado por pozo de la placa de 96 pocillos e incube durante 20 a 25 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Diluya el tampón de permeabilización con agua desionizada purificada para preparar una vez el tampón de permeabilización y úselo para lavar las células. Prepare una solución de anticuerpos intracelulares diluyendo con un mililitro de tampón de permeabilización. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos intracelulares diluidos por pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Lave las células con tampón de permeabilización, luego con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción. Adquirir un mínimo de 1,5 millones de células por muestra en el citómetro de flujo.Después de una cirugía exitosa y un procedimiento postoperatorio apropiado, los desechos y los dobletes se excluyeron a través de una estrategia de cierre. Las células inmunes se identificaron utilizando el marcador hematopoyético CD45+ a través de citometría de flujo. Las células se distinguían como vivas o muertas.Las células pulmonares inmunes se clasificaron en tres grupos utilizando anticuerpos anti-GR-1 y anti-CD68. Los neutrófilos fueron identificados y verificados usando Ly6G como un marcador único. La población CD45 + también contiene células asesinas naturales, células T y células B.Estas células fueron teñidas y verificadas por anticuerpos asesinos naturales 1.1, CD3 y B220. El lavado broncoalveolar identificó eosinófilos que fueron positivos para el marcador CD11b, y macrófagos alveolares que no expresaron altos niveles de CD11b. Se encontraron células dendríticas CD45 + y se confirmaron mediante la expresión de CD24.Estas células mostraron una respuesta positiva o negativa hacia los marcadores CD103 y CD11b. Las células CD103 negativas se clasificaron como células dendríticas convencionales y derivadas de monocitos en función de la expresión de CD64. las células dendríticas derivadas de monocitos fueron bajas positivas para el marcador dendrítico CD24 y positivas para el marcador panmacrófago CD64.Los macrófagos intersticiales con monocitos clásicos y no clásicos se distinguieron en función de la expresión de CD64 y GR-1. Estas células mostraron una expresión positiva para el receptor de quimiocina CX3C uno. Los pasos más importantes en este procedimiento son la recolección adecuada de tejidos, la digestión y la preparación de la suspensión unicelular, y la apertura de células vivas y singletes.Además de caracterizar las células inmunes del pulmón mediante citometría de flujo, se pueden realizar cultivos celulares y ensayos funcionales en poblaciones celulares aisladas. Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas en enfermedades del pulmón, como infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Este video demuestra el uso de la citometría de flujo para identificar y contar varias células inmunitarias en el líquido de lavado broncoalveolar. Inicialmente, las células inmunitarias individuales se identifican utilizando un colorante de viabilidad, seguido de la tinción diferencial de las proteínas marcadoras de superficie, lo que permite la enumeración precisa de cada tipo de célula.

Identificación y enumeración de células inmunitarias en líquido de lavado broncoalveolar mediante citometría de flujo

Este video muestra una técnica in vitro para identificar células inmunitarias que residen en pulmones murinos. Después de aislar las células inmunitarias diana del tejido pulmonar murino, se marcan en la superficie utilizando un cóctel de anticuerpos marcados con fluoróforos contra marcadores específicos en las células inmunitarias innatas y adaptativas. Además, los monocitos, macrófagos y células dendríticas se marcan mediante un marcador intracelular. A continuación, se identifican los...

Un método in vitro para identificar células inmunitarias innatas y adaptativas que residen en pulmones murinos

Las células inmunitarias residentes en los pulmones, incluidas las células dendríticas (CD) en los seres humanos, son fundamentales para la defensa contra patógenos y alérgenos inhalados. Sin embargo, debido a la escasez de tejido pulmonar humano, los estudios son limitados. En este trabajo se presentan protocolos para el procesamiento de biopsias endobronquiales de mucosa humana para el estudio de CDs pulmonares mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo.

Las células dendríticas humanas de pulmón: distribución espacial y fenotípica de identificación en endobronquial biopsias mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo

El estado de salud de los pulmones se refleja por el tipo y número de células inmunitarias que están presentes en los bronquiolos del pulmón. Se describe una técnica de lavado broncoalveolar que permite el aislamiento y estudio de las células no adherentes y factores solubles en el tracto respiratorio inferior de los ratones.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Este protocolo describe el uso de la citometría de flujo para identificar los cambios en la composición de las células inmunitarias, el perfil de citoquinas y el perfil de quimiocinas en el entorno pulmonar después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media, un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.

Caracterización de células inmunes y mediadores proinflamatorios en el ambiente pulmonar

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.

Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Aprende a identificar poblaciones inmunes pulmonares en ratones mediante citometría de flujo de 9 colores. Este protocolo estandarizado permite distinguir hasta 12 tipos celulares diferentes para estudios de inmunología respiratoria.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

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