Name: Imágenes vasculares profundas en el ojo con ultrasonido con flujo mejorado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a realizar imágenes vasculares oculares en 3D con ultrasonido con flujo mejorado, una técnica no invasiva sin agentes de contraste. Este método permite visualizar estructuras profundas detrás de la retina pigmentada en peces dorados y otros vertebrados con eritrocitos nucleados.

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Este trabajo ha recibido financiación de la Fundación Carlsberg (CF17-0778; CF18-0658), la Fundación Lundbeck (R324-2019-1470; R346-2020-1210), las Fundaciones Velux (00022458), la Fundación A.P. Møller para el Avance de la Ciencia Médica, el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie (No. 754513) y la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus.

El siguiente protocolo se realizó con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentación Animal dentro del Ministerio Danés de Alimentación, Agricultura y Pesca, Administración Danesa de Veterinaria y Alimentos (número de permiso 2016-15-0201-00835).
1. Anestesia y medio de ultrasonido
<ol><li>Anestesiar al animal de investigación. NOTA: El tipo y la dosis de anestesia apropiada son altamente dependientes de la especie. En general, los anestésicos a base de inmersión como MS-222 (ácido metanosulfónico de etilo 3-aminobenzoato), benzocaína (4-aminobenzoato de etilo) y propofol (2,6-diisopropil fenol) son útiles en peces y anfibios que absorben fácilmente el anestésico sobre las branquias o la piel (por ejemplo, 0,05 mg · Benzocaína L-1 en trucha arco iris). Una gama de compuestos disueltos que se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal está disponible para los amniotas, al igual que los anestésicos a base de gas. Alfaxalon administrado por vía intramuscular es útil en reptiles (por ejemplo, 30 mg·kg-1 en lagartos), e isoflurano administrado como gas es útil en aves (por ejemplo, 2% en aire para palomas). Consulte la literatura publicada30,31,32 para obtener una visión general completa de los anestésicos disponibles en todas las especies.</li>
	<li>Pruebe los reflejos en el animal para confirmar un nivel óptimo de anestesia. Asegúrese de que el animal esté completamente inmóvil durante el procedimiento, ya que el procedimiento de ultrasonido con flujo mejorado es sensible al ruido de movimiento.<ol>
<li>La anestesia demasiado profunda puede alterar los patrones de flujo sanguíneo, así que realice una titulación de la dosis en la fase inicial de un experimento.</li>
		<li>Aumente la dosis de anestesia en pasos y observe el flujo sanguíneo en el ojo con la ayuda de ultrasonido en modo de brillo simple (modo B). NOTA: Se obtiene un nivel óptimo de anestesia cuando el animal está inmóvil (excepto la respiración) con flujo sanguíneo ocular visible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si el tipo/dosis de anestésico no es permisivo para los movimientos respiratorios, asegúrese de una ventilación adecuada del animal, por ejemplo, utilizando una bomba de aire para oxigenar el agua para las especies acuáticas o un ventilador para las especies que respiran aire.</li>
	<li>Coloque al animal en una postura que permita el acceso directo desde arriba al ojo. NOTA: Dependiendo de la especie, esto puede ser en posición supina o lateral. Puede ser útil construir un dispositivo de sujeción simple utilizando una pequeña pieza de metal no reactivo (por ejemplo, acero inoxidable) y bandas elásticas sueltas (ver Figura 1).</li>
	<li>Coloque el medio de ultrasonido apropiado en el ojo del animal. Si los párpados escamosos (impermeables al ultrasonido) cubren el ojo, desplace estos suavemente con un hisopo de algodón. NOTA: Para las especies acuáticas, el mejor medio de ultrasonido es el agua limpia del tanque en el que generalmente vive el animal. Para las especies terrestres, una cantidad generosa de gel de ultrasonido garantiza movimientos libres e imágenes del transductor de ultrasonido (es decir, sonda de matriz lineal) en toda la superficie del ojo. Se requiere ungüento veterinario en el ojo contralateral para las especies terrestres.</li>
</ol>2. Adquisición de imágenes de ultrasonido ocular 2D y 3D
<ol><li>Coloque el transductor de ultrasonido medial al ojo en una orientación dorsal / ventral o rostral / caudal dependiendo de la orientación de la imagen deseada.</li>
	<li>En el modo B, con una profundidad de campo máxima, tome una imagen de la parte medial y más profunda del ojo y asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen. NOTA: En algunas especies, el cristalino ocupa una proporción comparativamente grande del humor vítreo, que puede absorber el ultrasonido, especialmente a frecuencias más altas.</li>
	<li>Traduzca lentamente el transductor a cada lado mientras inspecciona las imágenes en tiempo real. Asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen; de lo contrario, cambie a un transductor con una frecuencia más baja y una mayor profundidad de campo. NOTA: Las siguientes frecuencias centrales permiten la siguiente profundidad máxima de campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (véase la Tabla 1). Sin embargo, estos valores máximos de profundidad de campo pueden ser marcadamente más bajos si el ojo contiene estructuras calcificadas u otras estructuras impermeables al ultrasonido.</li>
	<li>Ajuste la profundidad de la imagen, el desplazamiento de profundidad (distancia desde la parte superior de la imagen hasta la estructura de interés), el ancho de la imagen, así como el número y la posición de las zonas focales para cubrir la región de interés deseada en las tres dimensiones espaciales (por ejemplo, profundidad de imagen de 1 cm, desplazamiento de profundidad de 2 mm, ancho de imagen de 1 cm, una zona focal). NOTA: Aunque la nomenclatura específica de los botones que ajustan estos parámetros puede variar entre los sistemas de ultrasonido, la mayoría de los sistemas tendrán botones con nombres lógicos para estos ajustes. Estos ajustes de parámetros de imagen generalmente afectan el rango de posibles resoluciones temporales de la adquisición de ultrasonido.</li>
	<li>Establezca la velocidad de fotogramas en el rango de 50-120 fotogramas·s-1. NOTA: La resolución temporal (es decir, el intervalo de tiempo entre las sucesivas exploraciones B) debe ser adecuada para mostrar una gran variabilidad de la intensidad de píxeles en los vasos sanguíneos fotografiados, es decir, la resolución temporal no debe ser demasiado alta. Por otro lado, para completar una grabación 3D completa del ojo en un tiempo razonable, la resolución temporal no puede ser demasiado baja. Una resolución temporal que oscila entre 50-120 fotogramas·s-1 suele ser adecuada para el procedimiento de flujo mejorado en la mayoría de las especies. En algunos sistemas de ultrasonido, esta resolución temporal deseada se puede obtener cambiando entre los modos de "imagen general" (alta resolución espacial / baja resolución temporal) y "cardiología" (baja resolución espacial / alta resolución temporal).</li>
	<li>Ajuste la ganancia 2D a un nivel (~ 5 dB), de modo que las estructuras anatómicas solo sean visibles en la adquisición del modo B para aumentar la relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.</li>
	<li>Para adquirir una imagen mejorada con flujo 2D en una sola posición de corte, traduzca el transductor a esta posición y continúe en el paso 3.1.</li>
	<li>Para adquirir una grabación 3D de toda una región de interés, por ejemplo, la retina, traduzca el transductor a un extremo de la región de interés.<ol>
<li>Para determinar la posición exacta del extremo de la región de interés, aumente brevemente la ganancia 2D.</li>
		<li>Una vez completada la colocación correcta del transductor, reduzca la ganancia 2D antes de grabar para garantizar la máxima relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada paso (slice) en la grabación 3D, adquiera ≥100 fotogramas (óptimamente ≥1000 fotogramas).</li>
	<li>Usando un micromanipulador o un motor de transductor incorporado, traduzca el transductor a través de toda la región de interés en pasos de, por ejemplo, 25 μm o 50 μm (recuerde anotar el tamaño del paso) y repita la adquisición de ≥100 cuadros para cada paso.</li>
	<li>Sacrificar al animal de investigación de acuerdo con las pautas de cuidado animal de la institución.</li>
</ol>3. Reconstrucción de imagen mejorada por flujo
<ol><li>Exporte las grabaciones al formato de archivo de imágenes digitales y comunicaciones en medicina (DICOM) (little-endian).</li>
	<li>Para producir una sola imagen mejorada de flujo basada en una grabación de cine de ≥100 fotogramas (T), calcule la desviación estándar en el nivel de píxeles (STD(x,y)) utilizando la fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62986/62986eq01.jpg"> Donde It(x,y) es la intensidad del píxel en la coordenada del píxel (x,y) en el tiempo t, e Īt(x,y) es el valor medio aritmético de I a lo largo del tiempo.</li>
	<li>Repita el paso 3.2 para cada segmento de la grabación 3D.</li>
	<li>Para automatizar el proceso de cálculo de ETS y reconstrucción de imágenes para múltiples segmentos en una grabación 3D, realice esta operación en modo por lotes utilizando, por ejemplo, ImageJ y el script de macro suplementario (Archivo suplementario 1).</li>
	<li>Combine todos los sectores reconstruidos en una pila de imágenes (comando Images to Stack en ImageJ).</li>
	<li>Especifique el grosor del segmento a partir del tamaño de paso utilizado durante la adquisición (comando Properties en ImageJ).</li>
	<li>Guarde la pila de imágenes como un archivo TIF 3D. NOTA: Los registros tridimensionales ponderados por flujo de los vasos sanguíneos oculares se pueden utilizar posteriormente para crear representaciones de volumen y construir modelos anatómicos digitales y físicos de las estructuras vasculares del ojo. Estas opciones de procesamiento de imágenes están fuera del alcance de este protocolo; consulte los artículos publicados anteriormente para obtener más detalles33,34,35.</li>
</ol>

<ol><li>Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+the+vertebrate+retina+from+the+Cambrian+to+the+Tertiary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary.</a> Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 175-208 (2001).</li>
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<li>Damsgaard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+oxygen+supply+shaped+the+functional+evolution+of+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Retinal oxygen supply shaped the functional evolution of the vertebrate eye.</a> Elife. , 8(2019).</li>
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<li>Damsgaard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+evolution+of+oxygen+secreting+mechanism+in+the+fisheye%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840(2021).</li>
<li>Damsgaard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+acidification+mechanism+for+greatly+enhanced+oxygen+supply+to+the+fish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+II.+Distribution+and+relation+to+the+pseudobranch+and+to+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+I.+Oxygen+secretion+and+structure%3A+comparison+with+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).</li>
<li>Berenbrink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+reconstructions+of+evolving+physiological+complexity%3A+O2+secretion+in+the+eye+and+swimbladder+of+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes.</a> Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).</li>
<li>Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+oxygen+secretion+in+fishes+and+the+emergence+of+a+complex+physiological+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system.</a> Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).</li>
<li>Keane, P. A., Sadda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+imaging+in+the+twenty-first+century%3A+State+of+the+art+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal imaging in the twenty-first century: State of the art and future directions.</a> Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).</li>
<li>Yung, M., Klufas, M. A., Sarraf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+fundus+autofluorescence+in+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of fundus autofluorescence in retinal disease.</a> International Journal of Retina and Vitreous. 2 (1), 12(2016).</li>
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<li>Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhanced+plane-wave+ultrasound+imaging+of+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye.</a> Experimental Eye Research. 193, 107986(2020).</li>
<li>Walls, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+GL+%22The+vertebrate+eye+and+its+adaptive+radiation%22">The vertebrate eye and its adaptive radiation</a>. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen intereses completos.

Las imágenes vasculares que utilizan ultrasonido de flujo mejorado proporcionan un nuevo método para la obtención de imágenes no invasivas de la vasculatura del ojo que ofrece varias ventajas sobre las técnicas actuales, pero tiene sus limitaciones intrínsecas. La principal ventaja del ultrasonido con flujo mejorado es la capacidad de generar angiografías oculares con una profundidad de campo que excede el epitelio pigmentario de la retina, lo que limita la profundidad de campo en las técnicas ópticas. En las imágenes de...

El alto metabolismo en la retina de los vertebrados impone una compensación intrínseca entre dos necesidades contrastantes; altas tasas de flujo sanguíneo y un camino ligero desprovisto de vasos sanguíneos. Para evitar la alteración visual de la perfusión de los glóbulos rojos, la retina de todos los vertebrados recibe oxígeno y nutrientes a través de una lámina de capilares detrás de los fotorreceptores, los coriocapilaris1,2,3. Sin embargo, esta única fuente de nutrientes y oxígeno impone una limitación de difusión al grosor de la retina4,5, por lo que muchas especies visualmente activas poseen una variedad de elaboradas redes vasculares para proporcionar un suministro de sangre adicional a este órgano metabólicamente activo6. Estos lechos vasculares incluyen vasos sanguíneos que perfunden las capas internas de la retina en mamíferos y algunos peces4,7,8,9,10, vasos sanguíneos en el lado interno (orientado a la luz) de la retina que se encuentran en muchos peces, reptiles y aves4,11,12,13, y arreglos vasculares contracorrientes de la coroides de pescado, la coroides. mirabile, que permite la generación de presiones parciales de oxígeno sobrefosférico14,15,16,17,18,19,20. A pesar de que estas vías no coroideas adicionales para el suministro de nutrientes de la retina juegan un papel esencial en el fomento de los requisitos metabólicos de la visión superior4, la anatomía tridimensional de estas estructuras vasculares es poco conocida, lo que limita nuestra comprensión de la evolución morfológica del ojo vertebrado.
Tradicionalmente, el suministro de sangre retiniana se ha estudiado utilizando técnicas ópticas, como la oftalmoscopia del fondo de ojo. Esta categoría de técnicas proporciona información no destructiva de alto rendimiento sobre la anatomía no coroidea de los vasos sanguíneos en alta resolución21 y, por lo tanto, se utiliza fácilmente en el diagnóstico clínico de anomalías en la estructura de los vasos retinianos22. Sin embargo, el epitelio pigmentario de la retina absorbe la luz transmitida y limita la profundidad de visión en estas técnicas ópticas, proporcionando información reducida sobre la estructura y función coroidea sin el uso de agente de contraste21. Se experimentan limitaciones de profundidad similares en la tomografía de coherencia óptica (OCT). Esta técnica puede generar angiografías de fondo de ojo de alta resolución utilizando ondas de luz a expensas técnicas de la penetración de profundidad23, mientras que la OCT de imagen de profundidad mejorada puede visualizar la coroides a expensas de la calidad de la imagen de la retina24. La resonancia magnética supera las limitaciones ópticas de la oftalmoscopia y la OCT y puede mapear las capas vasculares de la retina, aunque a baja resolución25. La histología y la tomografía microinformática (μCT) mantienen la alta resolución de las técnicas ópticas y proporcionan información sobre la morfología vascular de todo el ojo4, pero ambas técnicas requieren muestreo ocular y, por lo tanto, no son posibles en la clínica o en especies raras o en peligro de extinción. Para superar algunas de las limitaciones de estas técnicas de imagen retiniana establecidas, el estudio presenta aquí un protocolo de ultrasonido en animales anestesiados, donde el movimiento de la sangre se mapea in silico en una serie de ecografías bidimensionales igualmente espaciadas que abarcan todo un ojo mediante la aplicación de una técnica comparable a la descrita anteriormente para la imagen embrionaria y cardiovascular26,27, 28 y en angiografía OCT29. Este enfoque permite la generación de angiografías oculares profundas tridimensionales no invasivas sin usar un agente de contraste y abre nuevas vías para mapear la distribución del flujo sanguíneo dentro del ojo a través de las especies.

<table><tbody><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma</td><td>E-1501</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>B Braun</td><td> 12260470_0320</td><td></td></tr><tr><td>Alfaxalon</td><td>Jurox</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Zoetis</td><td>50019100</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de ultrasonido</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes vasculares profundas en el ojo con ultrasonido con flujo mejorado

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

La retina dentro del ojo es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo y, por lo tanto, requiere altas tasas de suministro de oxígeno de un rico suministro de sangre. La lámina capilar de la coroides recubre la superficie externa de la retina y es la fuente dominante de oxígeno en la mayoría de las retinas de los vertebrados. Sin embargo, este lecho vascular es difícil de visualizar con técnicas ópticas tradicionales debido a su posición detrás de la retina altamente absorbente de luz. Aquí describimos una técnica de ultrasonido de alta frecuencia con posterior mejora del flujo para obtener imágenes de lechos vasculares profundos (0,5-3 cm) del ojo con una alta resolución espaciotemporal. Este método no invasivo funciona bien en especies con glóbulos rojos nucleados (modelos animales no mamíferos y fetales). Permite la generación de angiografías tridimensionales no invasivas sin el uso de agentes de contraste, y es independiente de los ángulos de flujo sanguíneo con una sensibilidad más alta que las técnicas de imágenes de ultrasonido basadas en Doppler.

La técnica de ultrasonido de flujo mejorado para obtener imágenes de los lechos vasculares del ojo se puede aplicar en una variedad de especies y actualmente se ha utilizado en 46 especies diferentes de vertebrados (Figura 1, Tabla 1). La presencia de glóbulos rojos nucleados en vertebrados de mamíferos no adultos proporciona un contraste positivo de la sangre que fluye en comparación con el tejido estático en las grabaciones de cine (Archivo complementario 2</strong...

Presentamos una técnica ecográfica no invasiva para generar angiografías tridimensionales en el ojo sin el uso de agentes de contraste.

Imágenes vasculares profundas en el ojo con ultrasonido con flujo mejorado

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

La técnica Flow-Enhanced Ultrasound nos permite obtener imágenes de la vasculatura del ojo en tres dimensiones, sin el uso de agentes de contraste. La principal ventaja de esta técnica es su estabilidad para obtener imágenes de la vestura, detrás de la retina pigmentada, lo que es un desafío con varias técnicas de imagen óptica. Demostramos esta técnica en peces de colores, pero se puede aplicar a todas las especies con glóbulos rojos nucleados, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la evolución funcional de los ojos.Esta técnica puede ser aplicada por investigadores con formación básica en ecografía y manejo de animales. Después de confirmar un nivel óptimo de anestesia, coloque al animal en una postura que permita el acceso directo desde arriba al ojo. Coloque un medio de ultrasonido adecuado en el ojo del animal.Si los párpados escamosos cubren el ojo, entonces, desplace estos suavemente con un hisopo de algodón. Para los animales acuáticos, el agua funciona bien como un medio de ultrasonido, A continuación, coloque el transductor de ultrasonido, medial al ojo, ya sea en una orientación caudal dorsal ventral o rostral, dependiendo de la orientación de la imagen deseada. En el modo B, con una profundidad de campo máxima, imagine la parte medial y más profunda del ojo, para asegurarse de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen.Traduzca lentamente el transductor a cada lado, mientras inspecciona las imágenes en tiempo real. Asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen. De lo contrario, cambie a un transductor con una frecuencia más baja y una mayor profundidad de campo.Ajuste la profundidad de la imagen, el desplazamiento de profundidad, el ancho de la imagen y el número de posiciones de las zonas focales para cubrir la región de interés deseada en las tres dimensiones espaciales. A continuación, establezca la velocidad de fotogramas en el rango de 50 a 120 fotogramas por segundo. A continuación, ajuste la ganancia 2D a un nivel, de modo que las estructuras anatómicas solo sean visibles en la adquisición del modo B para aumentar la relación señal/ruido en la posterior reconstrucción mejorada por el flujo.Para adquirir una imagen mejorada con flujo 2D en una sola posición de corte, traduzca el transductor a esta posición y proceda a la reconstrucción de imagen mejorada por flujo. Para adquirir una grabación 3D de toda una región de interés, traduzca el transductor a un extremo de la región de interés. Para determinar la posición exacta del extremo extremo, aumente la ganancia 2D, brevemente.Después de colocar correctamente el transductor, reduzca la ganancia 2D antes de grabar, para garantizar la máxima relación señal/ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo. Por cada paso o slice en la grabación 3D, adquiere más de 100 fotogramas. Luego, utilizando un micromanipulador o un motor de transductor incorporado, traduzca el transductor en toda la región de interés, en pasos de 25 o 50 micrómetros, y repita la adquisición de más de 100 cuadros para cada paso.Para la construcción de imágenes mejoradas por flujo, exporte las grabaciones al formato de archivo DICOM. Para producir una sola imagen mejorada de flujo basada en una grabación de escena superior a 100 fotogramas, calcule la desviación estándar en un nivel de píxel utilizando esta fórmula y repita el cálculo para cada segmento en la grabación 3D. Para automatizar el cálculo de la desviación estándar y el proceso de reconstrucción de imágenes para múltiples segmentos en una grabación 3D, realice esta operación en modo por lotes utilizando ImageJ y el script de macros, proporcionado en el manuscrito de texto.Combine todas las imágenes reconstruidas en una pila de imágenes mediante el comando Imágenes para apilar en ImageJ. A continuación, mediante el comando Propiedades, especifica el grosor de la división a partir del tamaño de paso utilizado durante la adquisición y guarda la pila de imágenes como un archivo TIFF 3D. La presencia de glóbulos rojos nucleados en vertebrados mamíferos adultos no ad proporciona un contraste positivo de la sangre que fluye, en comparación con el tejido estático en las grabaciones de escenas.Sin embargo, cuando ahora se analiza fotograma a fotograma, la clara distinción entre la sangre y el tejido circundante es menos obvia. Este procedimiento de mejora del flujo sanguíneo, esencialmente, compila un registro de puntos de tiempo múltiples en el espacio 2D, en una sola imagen, donde en la fluctuación inherente del valor de la señal en píxeles, posicionados en la sangre que fluye, obtienen una desviación estándar más alta que el tejido estático circundante, produciendo un contraste positivo. En las adquisiciones 3D, se pueden combinar múltiples segmentos paralelos con espaciado conocido en datos de imágenes 3D.Se puede utilizar para la representación de volúmenes tridimensionales y el modelado anatómico. Sin embargo, las imágenes de ultrasonido basadas en Doppler también brindan la opción de obtener imágenes específicas del flujo sanguíneo con menos sensibilidad que este método. Este procedimiento de ultrasonido de flujo mejorado permite imágenes de flujo sanguíneo en una variedad de especies con glóbulos rojos nucleados.Los lechos vasculares oculares profundos, como la coroides rete mirabile en algunos peces, se pueden visualizar si están presentes en la especie. El método está limitado por la ausencia de glóbulos rojos nucleados en mamíferos, en los que el procedimiento de mejora del flujo produce cierto grado de contraste del flujo sanguíneo, pero no tan distinto como en las especies con glóbulos rojos nucleados. El ultrasonido de flujo mejorado es sensible al ruido de movimiento.Los movimientos respiratorios pueden causar desenfoque de la imagen y artefactos, como la mejora del borde del tejido. La apertura prospectiva o retrospectiva se puede utilizar para ajustar el ruido de movimiento. Tanto para las adquisiciones 2D como para las 3D, es crucial limitar los artefactos de movimiento causados por el movimiento del animal, debido a la anestesia inadecuada en la configuración inestable del transductor.El desarrollo de esta técnica, allanó el camino para el examen in vivo no invasivo de las redes vasculares profundas en el ojo de la gran mayoría de los vertebrados, que poseen eritrocitos nucleados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende a realizar imágenes vasculares oculares en 3D con ultrasonido con flujo mejorado, una técnica no invasiva sin agentes de contraste. Este método permite visualizar estructuras profundas detrás de la retina pigmentada en peces dorados y otros vertebrados con eritrocitos nucleados.

Imágenes vasculares profundas en el ojo con ultrasonido con flujo mejorado

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