Producción de nanopartículas lipídicas cargadas de siRNA utilizando un dispositivo microfluídico
22 de marzo de 2022
Los métodos de producción de nanopartículas lipídicas (LNP) basados en microfluídicas han atraído la atención en los sistemas de administración de fármacos (DDS), incluida la administración de ARN. Este protocolo describe la fabricación, la producción de LNP (LNP cargado de siRNA) y los procesos de evaluación de LNP utilizando nuestro dispositivo microfluídico original llamado iLiNP.
El tamaño de las nanopartículas lipídicas afecta la biodistribución, el efecto antitumoral y el rendimiento de silenciamiento génico. Por lo tanto, el método de control de tamaño LNP es una técnica efectiva para producir nano medicamentos, incluidos los sistemas de administración de ARN. Este dispositivo microfluídico original, llamado dispositivo iLiNP, fue capaz de controlar el tamaño de LNP que oscila entre 20 y 100 nanómetros a intervalos de 10 nanómetros.
El dispositivo iLiNP puede producir no solo LNPs cargados con siRNA, sino también LNPS cargados con ARNm y LNPs cargados con ribonucleoproteína. Para comenzar, tome las soluciones de etanol lipídico y produzca los LNPs cargados de siRNA mezclando soluciones DOTAP, DSPC, colesterol y DMG-PEG2k en una proporción molar de 50 a 10 a 38.5 a 1.5. Ajuste la concentración total de lípidos a ocho milimolares.
Luego tome las soluciones acuosas de solución salina milimolar 154 y tampón de acetato milimolar 25 a pH 4 y filtre a través de filtros de membrana de 0,2 micrómetros o filtros de jeringa. Prepare la solución tampón de siRNA disolviendo 70 microgramos de siGL4 en un mililitro de tampón de acetato milimolar de 25 milimolares. Llene las jeringas de vidrio de un mililitro con soluciones lipídicas y acuosas, respectivamente.
Conecte las jeringas de vidrio al pico capilar utilizando conectores de jeringa, luego ajuste el caudal de las soluciones lipídicas y acuosas e introduzca las soluciones lipídicas y acuosas por separado en el dispositivo iLiNP utilizando bombas de jeringa. Recoja las suspensiones LNP en un microtubo de la salida del dispositivo iLiNP. Dializar la suspensión de LNP utilizando una membrana de diálisis de 12 a 14 kiloDalton de picos de peso molecular a cuatro grados es Celsius durante la noche contra solución salina o DPBS para LNPs POPC y LNPs cargados de siRNA, respectivamente.
Recoja las suspensiones LNP dializadas en microtubos y luego pipetee de 20 a 30 microlitros de la suspensión LNP a una celda de micro cuarzo. Finalmente, mida el tamaño de LNP, la distribución de tamaño de LNP y el índice de poli dispersidad por dispersión dinámica de luz. La distribución del tamaño de POPC LNP producida en diferentes condiciones de flujo, como el caudal total y las relaciones de caudal se muestran aquí.
Los tamaños precisos de LNP que van de 20 a 100 nanómetros se pueden controlar utilizando este dispositivo iLiNP. Los LNP de tamaño pequeño se forman en condiciones de alto caudal total. Además, los tamaños de LNP que se forman en el FRR 5 son más pequeños que los del FRR 3, independientemente del caudal total.
La distribución del tamaño de los LNPs cargados con siRNA se muestra aquí. Los siRNAs se encapsulan en los LNPs por interacción electrostática entre el lípido catiónico DOTAP y los siRNAs cargados negativamente. El dispositivo iLiNP produjo LNP catiónicos cargados con siRNA de 90 nanómetros con una distribución estrecha.
La eficiencia de encapsulación de siRNA fue del 95% debido a la interacción electrostática entre el lípido catiónico y los siRNAs cargados negativamente. Se evaluó la citotoxicidad y la actividad de silenciamiento génico de los LNPs cargados de siRNA de 19 nanómetros. Los LNPs cargados de siRNA mostraron citotoxicidad a una dosis de 10 a 100 siRNA nanomolares.
El nivel de expresión de luciferasa disminuyó dependiendo de la concentración de siRNA. Los LNP cargados de siRNA suprimieron la expresión de luciferasa al 80% a una dosis de 100 siRNA nanomolar. Las optimizaciones de las condiciones de flujo son los pasos más importantes en el protocolo para obtener los LNPs de tamaño deseado.
El método de producción de LNP basado en microfluídica, incluido el dispositivo iLiNP, no requiere ningún procedimiento complicado y se espera que se emplee como el método de producción de LNP estándar.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la producción de nanopartículas lipídicas (LNPs) cargadas con siRNA utilizando un dispositivo microfluídico denominado iLiNP. El método permite un control preciso sobre el tamaño de las LNPs, lo cual es crucial para sistemas eficaces de administración de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Sistemas de administración de fármacos
- Nanopartículas lipídicas
- Microfluídica
Antecedentes
- El tamaño de las nanopartículas lipídicas influye en la biodistribución y la eficacia terapéutica.
- El control del tamaño de las nanopartículas lipídicas es esencial para optimizar la entrega de ARN.
- El dispositivo iLiNP permite el control del tamaño desde 20 hasta 100 nanómetros.
- Las interacciones electrostáticas facilitan la encapsulación de siARN en nanopartículas lipídicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para producir LNPs cargadas con siRNA.
- Evaluar el impacto del tamaño de las LNPs en la eficiencia de silenciamiento génico.
- Optimizar las condiciones de flujo para obtener características deseadas en las LNPs.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones lipídicas y acuosas para la producción de LNPs.
- Uso del dispositivo iLiNP para la mezcla y formación de LNPs.
- Dialización de suspensiones de LNPs para eliminar materiales en exceso.
- Dispersión dinámica de la luz para medir el tamaño y la distribución de los LNPs.
Resultados principales
- El dispositivo iLiNP produjo LNPs cargados con ARNpi de 90 nanómetros de tamaño y una eficiencia de encapsulación del 95 %.
- Se formaron LNPs pequeñas bajo condiciones de alto caudal total.
- Los LNPs cargados con ARNpi demostraron citotoxicidad y silenciamiento génico eficaz.
- Las condiciones optimizadas de flujo fueron fundamentales para lograr tamaños de LNP deseados.
Conclusiones
- El método microfluídico que utiliza el dispositivo iLiNP simplifica la producción de LNPs.
- Se espera que este enfoque estandarice la producción de LNPs en la investigación.
- Estudios futuros pueden explorar la aplicación de este método en diversos sistemas de entrega de ARN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El control preciso del tamaño de las nanopartículas lipídicas (LNP) es fundamental para optimizar la biodistribución, la eficacia terapéutica y el desempeño del silenciamiento génico en sistemas de administración de fármacos basados en ARN. El dispositivo microfluídico iLiNP permite la producción reproducible de LNP con tamaños ajustables entre 20 y 100 nanómetros, apoyando flujos de trabajo de validación temprana de objetivos e identificación de compuestos líderes. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al reducir la variabilidad en el desempeño de las nanopartículas, un factor clave para disminuir los riesgos en el avance traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la actividad biológica dependiente del tamaño para LNPs cargadas con siARN en ensayos de validación de dianas.
- Valor operativo: Proporciona formulaciones estandarizadas de LNPs para reducir el ruido en estudios de cribado fenotípico y desriesgo mecanicista.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera LNPs con siARN monodispersos con tamaño definido y eficiencia de encapsulación del 95 % para la evaluación confiable de compuestos.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante el control reproducible del tamaño de LNPs mediante el ajuste del caudal en el dispositivo iLiNP.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la correlación entre el tamaño de las nanopartículas lipídicas (LNP) y la eficiencia de silenciamiento génico y la citotoxicidad en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Permite la producción a escala de LNPs cargadas con ARNm, ARNsi y ribonucleoproteínas para la continuidad preclínica.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método microfluídico iLiNP se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos activos y el desarrollo preclínico, especialmente para terapias basadas en ARN donde la eficacia depende del tamaño de la entrega.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la variación sistemática del tamaño de las nanopartículas lipídicas (LNP) para evaluar su impacto en la captación celular y la interacción con el blanco.
- Cribado: Proporciona formulaciones de LNP listas para ensayos, con distribución de tamaño constante y alta encapsulación de siRNA, para un cribado reproductible de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de tamaño, polidispersidad y potencial zeta mediante dispersión dinámica de la luz, para fundamentar decisiones de avance o interrupción.
- Investigación Translacional: Conecta la optimización de LNP en fase de descubrimiento con la evaluación preclínica mediante nanomedicamentos estandarizados y controlados en tamaño.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la producción de diversas LNP cargadas con ARN (siRNA, ARNm, RNP) en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el blanco al vincular las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas lipídicas (LNP) con resultados funcionales como la silenciación génica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de la producción de LNP mediante la precisión de la microfluídica.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas al permitir la eliminación temprana de riesgos en el rendimiento del vehículo de entrega.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos de ARN en función de la eficiencia de entrega.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en formulación de lípidos, manipulación de microfluidos y carga de ácidos nucleicos.
- Depende de bombas de jeringa, jeringas de vidrio e infraestructura de diálisis para la purificación de LNPs.
- Necesita la estandarización de las relaciones de caudal y las condiciones totales de flujo entre equipos.
- Implica consideraciones de adaptación al cambiar las composiciones de lípidos o los tipos de carga de ARN.
- Está limitado por la necesidad de diálisis posterior a la producción y dispersión dinámica de luz para el control de calidad.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
