Name: Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a disociar tejido neural del hipocampo de ratón C57BL/6J mediante digestión enzimática y disociación mecánica automatizada. Este protocolo genera suspensiones celulares viables para análisis de poblaciones neuronales.

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Agradecemos a Aimee Rogers por proporcionar capacitación práctica y soporte continuo del producto. Agradecemos a la Dra. Amanda Burke por la solución de problemas en curso y las discusiones aclaratorias. Agradecemos a Meredith Joheim y al Grupo de Comunicación Científica de la UAMS por la edición gramatical y el formato de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH R25GM083247 y NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en UAMS. Se compraron ratones hembra C57Bl6 / J de 6 meses de edad y se alojaron en grupo (4 ratones por jaula) bajo un ciclo constante de luz / oscuridad de 12 h.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Prepare una solución reparable de material de manchas vivas / muertas. Reconstituir la tinción fluorescente con 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
	<li>Envuelva el vial en papel de aluminio, etiquételo como "Reconstituido" y guárdelo a -20 °C durante un máximo de seis meses.</li>
	<li>Prepare una solución salina al 0,9% con heparina. Diluir el contenido de un vial de heparina sódica (10.000 unidades USP por 10 ml) en 1 L de agua doble destilada (ddH2O).</li>
	<li>Prepare lo suficiente para aproximadamente 45 ml por animal y guárdelo a 4 ° C durante un máximo de una semana.</li>
	<li>Haga 1% de paraformaldehído (PFA).<ol>
<li>En una campana extractora de humos, caliente una placa caliente a 50 °C. En un microondas, caliente 100 ml de ddH2O en un vaso de precipitados de vidrio a aproximadamente 60 °C. Agregue una barra de agitación magnética y transfiérala a la placa caliente.</li>
		<li>En la campana de humos, pesar 1 g de PFA y añadir al vaso de precipitados de ddH2O. Añadir 0,1125 g de cristales de NaOH y mezclar hasta que se disuelva (5-10 min).</li>
		<li>Añadir 0,4 g de NaPO4- monobásica y mezclar hasta disolver (2-5 min). Filtre al vacío la solución y ajuste el pH a 7.4 con HCl y NaOH.</li>
		<li>Enfríe sobre hielo o a 4°C durante 30 min antes de almacenar. NOTA: Las alícuotas de 1,5 ml se pueden almacenar a -20 °C durante un año. Evite los ciclos de congelación-descongelación. Si, después de la descongelación, la solución se vuelve turbia o se ha formado un precipitado, no se debe usar la solución. PRECAUCIÓN: Tóxico, inflamable. Siempre trabaje con PFA debajo de una capucha ventilada usando el equipo de protección personal adecuado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend enzima liofilizada A con 1 mL de tampón A. No vórtice la solución. NOTA: La enzima A y el tampón A, así como los tampones A, Y y Z son reactivos en el kit comercial de disociación cerebral para adultos17.</li>
	<li>Divida la enzima P en alícuotas de 50 μL y resuspenda la enzima A en alícuotas de 10 μL. Según las instrucciones del kit, conservar a -20 °C durante un máximo de seis meses. Evite los ciclos de congelación-descongelación.</li>
</ol>2. Día del experimento
<ol><li>Enfríe la centrífuga de mesa a 4 °C.</li>
	<li>Coloque la(s) alícuota(s) de PFA en el refrigerador para descongelar gradualmente.</li>
	<li>Coloque la mancha viva/muerta reconstituida en la oscuridad (por ejemplo, un cajón) para descongelarla a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar el tampón de albúmina sérica bovina (BSA). Añadir 0,5 g de BSA a 100 ml de 1 solución tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS), pH 7,2.</li>
	<li>Agregue una barra de agitación y mezcle en un plato de agitación durante 30 minutos. Transferir a tubos cónicos de 50 ml y conservar a 4 °C. NOTA: Utilice siempre un búfer BSA recién preparado.</li>
	<li>Prepare la dilución de trabajo de manchas vivas / muertas. Añadir 1 μL de la solución reconstituida de material de tinción viva/muerta a 360 μL de D-PBS y almacenarla en la oscuridad (por ejemplo, un cajón o una caja) a temperatura ambiente. Preparar 50 μL de la dilución de trabajo por muestra.</li>
</ol>3. Perfusión
<ol><li>Coloque la solución salina con heparina sobre hielo.</li>
	<li>Encienda el oxígeno, ajuste la bola indicadora del medidor de flujo en el sistema de vaporizador de anestesia de animales pequeños a 1 L / min. Asegúrese de que haya una presión de oxígeno e isoflurano adecuadas.</li>
	<li>Ajuste el dial del vaporizador al 3,5% (para inducción y mantenimiento).</li>
	<li>Imprima las líneas de la bomba de perfusión con la solución salina/heparina. Ajuste la velocidad a 6 ml/min.</li>
	<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción, encienda el respirador y espere varios minutos hasta que el ratón no responda. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia a través de la ausencia de retirada del pedal a pellizco nocivo.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre su espalda en la bandeja de disección con la nariz en el cono de la nariz. Realizar una confirmación secundaria de anestesia completa a través de la ausencia de retirada del pedal a pellizco nocivo. Fije las cuatro patas a la bandeja.</li>
	<li>Rocíe el abdomen del animal con etanol al 20%.</li>
	<li>Usando fórceps, pellizque la parte inferior del abdomen y levante la piel. Use tijeras para cortar a través de la piel y la piel hasta la parte inferior de la caja torácica.</li>
	<li>Haga dos incisiones diagonales desde debajo de la caja torácica hacia cada hombro.</li>
	<li>Reseque cuidadosamente el diafragma (evitando los pulmones y el corazón). Reseque la caja torácica para exponer el corazón.</li>
	<li>Corte cuidadosamente cualquier tejido conectivo alrededor del corazón. NOTA: Los pasos 3.10-3.11 son críticos; realizar con competencia y destreza.</li>
	<li>Use las tijeras para sujetar la aurícula derecha (lóbulo oscuro en la parte superior izquierda del corazón). Apague el flujo de isoflurano al respirador.</li>
	<li>Mantenga el corazón firme con fórceps. Con el bisel de la aguja de mariposa hacia arriba, perfore el ventrículo izquierdo mientras mantiene la aguja nivelada y paralela al animal.</li>
	<li>Mantenga la aguja en su lugar, encienda la bomba y perfunda al menos 30 ml de la solución salina/heparina hasta que el líquido que sale del corazón sea opaco y el hígado y los pulmones de color pálido. NOTA: Los pasos 3.13-3.14 son críticos; realizar con competencia y destreza.</li>
	<li>Apague la bomba, retire la aguja y transfiera el ratón al área de disección.</li>
</ol>4. Disección
<ol><li>Usando tijeras quirúrgicas grandes, decapita la cabeza.</li>
	<li>Corta el pelaje desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos. Pelar la piel hacia atrás para exponer el cráneo.</li>
	<li>Recorta el cráneo entre los ojos. Haga dos cortes en la parte posterior del cráneo, en las posiciones de las 10 y las 2 en punto, luego haga un corte largo (mantenga las puntas altas para evitar dañar el cerebro) a lo largo de la línea media sagital del cráneo hasta el corte original entre los ojos.</li>
	<li>Use fórceps para pelar las dos mitades del cráneo hacia los lados. Use una espátula para extraer el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de vidrio de 60 mm sobre hielo lleno de D-PBS frío (Figura 1).</li>
	<li>Use un bisturí o una maquinilla de afeitar para separar cada hemisferio. Luego retire los bulbos olfativos y el cerebelo.</li>
	<li>Use fórceps para extraer el mesencéfalo hasta que el hipocampo esté expuesto.</li>
	<li>Asegure el cerebro con fórceps. Usando un segundo juego de fórceps, saque suavemente el hipocampo de cada hemisferio y transfiera ambos hipocampos a un tubo etiquetado de 1.5 ml que contenga D-PBS frío.</li>
	<li>Coloque el tubo de muestra que contiene los dos hipocampos del ratón sobre hielo.</li>
</ol>5. Prepare la mezcla de enzimas 1 y 2 para cada muestra
NOTA: Para volúmenes superiores a 2 ml, utilice una pipeta serológica de 10 ml; para volúmenes, 200 μL-2 mL, use una pipeta de 1000 μL; para volúmenes, 21-199 μL, use una pipeta de 200 μL; para volúmenes, 2-20 μL, use una pipeta de 20 μL; para volúmenes inferiores a 2 μL, utilice una pipeta de 0-2 μL.
<ol><li>Para cada muestra, descongele una alícuota de cada una de las enzimas P y A a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para la mezcla de enzimas 1, combine 50 μL de enzima P y 1900 μL de tampón Z en un tubo C etiquetado (Tabla de materiales).</li>
	<li>Para la mezcla de enzimas 2, agregue 20 μL de tampón Y a la alícuota descongelada de 10 μL de la enzima A.</li>
</ol>6. Protocolo de disociación cerebral en adultos17
NOTA: Cuando se trabaja con muestras, los tubos deben colocarse en un bastidor de tubos a temperatura ambiente mientras BSA y D-PBS permanecen en hielo a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>Encienda el disociador.</li>
	<li>Use fórceps para transferir las piezas de tejido del hipocampo al tubo C.</li>
	<li>Transfiera 30 μL de la mezcla de enzimas 2 en el tubo C. Gire la tapa hasta que se sienta la tensión, luego apriete hasta que haga clic.</li>
	<li>Coloque el tubo C boca abajo en una posición del disociador; a la muestra se le asignará el estado Seleccionado (Figura 2). Asegure el calentador sobre el tubo C.</li>
	<li>Presione el icono de carpeta, seleccione la carpeta Favoritos , desplácese y seleccione el 37C_ABDK_02 programa. Haga clic en Aceptar para aplicar el programa a todos los tubos C seleccionados, luego toque Inicio (Figura 2).</li>
	<li>Etiquete un tubo cónico de 50 ml por muestra.</li>
	<li>Coloque un colador celular de 70 μm en cada tubo cónico de 50 ml y humedezca con 2 ml de tampón BSA.</li>
	<li>Al finalizar el programa, retire el calentador y el tubo C del disociador.</li>
	<li>Agregue 4 ml de tampón BSA a la muestra y aplique la mezcla al colador celular en el tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 10 ml de D-PBS al tubo C, ciérrelo y agite la solución suavemente. Aplíquelo al colador celular en el tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Deseche el colador celular y el tubo C. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Luego, aspira y descarta el sobrenadante.</li>
</ol>7. Eliminación de escombros
<ol><li>Resuspender el pellet con 1550 μL de D-PBS frío y transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 ml marcado.</li>
	<li>Agregue 450 μL de solución de eliminación de escombros en frío y pipete hacia arriba y hacia abajo (no vórtice). NOTA: Debris Removal Solution es un reactivo en el comercial Adult Brian Dissociation Kit17.</li>
	<li>Superponga suavemente 1 ml de D-PBS frío sobre la suspensión celular, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita hasta que la superposición total sea de 2 ml. NOTA: Este paso es crítico; realizar con competencia y destreza.</li>
	<li>Centrífuga a 3000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo. NOTA: Si las fases no están claramente separadas, repita los pasos 7.2-7.3. Centrifugar una última vez a 1000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>La suspensión ahora debe consistir en tres capas distintas (Figura 3). Aspira la capa superior. Barre la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa media blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin perturbar la capa inferior. NOTA: Este paso es crítico; realizar con competencia y destreza.</li>
	<li>Agregue 2 ml de D-PBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.</li>
	<li>Centrífuga a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 1 ml de tampón BSA. NOTA: Las células se pueden resuspendir en el búfer apropiado y luego etiquetarse magnéticamente y aislarse en preparación para la secuenciación de una sola célula en este punto.</li>
</ol>8. Recuento de células
<ol><li>Realice el conteo de celdas según el protocolo del fabricante del contador de celdas disponible (una opción se indica en la Tabla de materiales)</li>
</ol>9. Mancha viva/muerta
<ol><li>Centrifuga los 900 μL restantes (desde 7,7) a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo.</li>
	<li>Mientras la muestra está girando, etiquete un tubo de flujo por muestra y envuélvalo en papel de aluminio para limitar la exposición a la luz.</li>
	<li>Aspirar y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspendir el pellet en 50 μL de tinción viva/muerta diluida (previamente preparada). NOTA: Este paso debe realizarse en un entorno con poca luz. Apague las luces superiores de la habitación para lograr esto.</li>
	<li>Transfiera cada muestra al tubo de flujo etiquetado correspondiente e incube a temperatura ambiente durante 8-10 minutos en la oscuridad (por ejemplo, un cajón o caja).</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón BSA y centrífuga a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo.</li>
	<li>Aspirar y desechar el sobrenadante. NOTA: El pellet puede no ser visible; deje una pequeña cantidad de tampón para no aspirar involuntariamente el pellet. Las células pueden ser resuspendidas en el tampón apropiado, bloqueadas y teñidas con anticuerpos específicos de la célula en este punto. Consulte el archivo complementario 1 para ver el protocolo deejemplo 18.</li>
</ol>10. Fijación (opcional)
<ol><li>Resuspendir el pellet en 200 μL de PFA al 1% (previamente preparado). Incubar durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar añadiendo 500 μL de D-PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante. NOTA: El pellet puede no ser visible; deje una pequeña cantidad de tampón para no aspirar involuntariamente el pellet.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de D-PBS y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 días.</li>
</ol>11. Citometría de flujo
<ol><li>Etiquete las tapas del filtro en los tubos nuevos.</li>
	<li>Usando una pipeta de 1 ml, pipetee cada muestra en la tapa del filtro.</li>
	<li>Centrifugar brevemente a 200 x g a 4 °C, solo permitiendo que la centrífuga alcance los 200 x g antes de detener la carrera.</li>
	<li>Proceda al núcleo de citometría de flujo para el análisis aguas abajo.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varios pasos en este protocolo de disociación neuronal requieren una técnica competente y destreza: perfusión, aspiración sobrenadante y eliminación de mielina. Durante todo el proceso de perfusión, los órganos internos deben permanecer intactos (aparte de extirpar el diafragma y recortar el corazón); esto incluye evitar las cámaras superiores del corazón con la aguja de mariposa. Si bien la cantidad de solución salina con heparina necesaria varía, el líquido transparente que fluye desde el corazón indica que el proceso ...

El hipocampo fue descrito por primera vez por un anatomista boloñés, Giulio Cesare Aranzio, en la década de 15001. Al nombrar esta nueva estructura, Aranzio probablemente se inspiró en su extraño parecido con el caballito de mar del género Hippocampus1. El hipocampo está involucrado en las respuestas al estrés, pero es ampliamente conocido por su papel en el aprendizaje y la memoria. Más específicamente, el hipocampo es responsable de la codificación y recuperación de la memoria declarativa y espacial1.
El hipocampo, o hipocampo propiamente dicho, se divide en los subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 y CA31. En comparación con el resto del sistema nervioso, el hipocampo tiene varias características definitorias únicas, incluida su plasticidad y potencial para la neurogénesis en curso2. La neurogénesis es el proceso de proliferación y diferenciación de las células madre neurales, seguido de su integración en la red neuronal preexistente. La neurogénesis se restringe a la zona subgranular del giro dentado y a la zona subventricular de los ventrículos laterales (y los bulbos olfativos)3. Si bien la neurogénesis es abundante en la embriogénesis, es un proceso de por vida 3,4. Como tal, esta discusión se centrará en la neurogénesis adulta en el hipocampo.
Las zonas subventricular y subgranular son nichos neurogénicos que contienen células ependimarias y vasculares, así como linajes inmaduros y maduros de células madre neurales5. La microglía contribuye a estos nichos como células inmunes para regular la neurogénesis6. Las células progenitoras neurales son progenies de células no madre de células madre neurales7. Tres tipos de progenitores neurales están presentes en la zona subventricular: células tipo B similares a la glía radial, progenitores amplificadores de tránsito tipo C y neuroblastos tipo A 3,8. Las células progenitoras neurales tipo B que se dividen lentamente en la zona subventricular pueden diferenciarse en células tipo C que se dividen rápidamente8. Posteriormente, las células de tipo C se diferencian en células de tipo A8. Estos neuroblastos migran a través de la corriente migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio antes de diferenciarse en interneuronas u oligodendrocitos9. Estas interneuronas del bulbo olfatorio son clave para la memoria olfativa a corto plazo y el aprendizaje asociativo, mientras que los oligodendrocitos mielinizan los axones del cuerpo calloso9. La mayoría de la neurogénesis adulta ocurre en la zona subgranular del giro dentado, donde se encuentran progenitores neurales radiales tipo 1 y no radiales tipo 23. La mayoría de las células progenitoras neurales están destinadas a convertirse en neuronas granulosas dentadas y astrocitos10. Conectados por uniones de brecha, los astrocitos forman redes para modular la plasticidad, la actividad sináptica y la excitabilidad neuronal5. Como neurona excitadora primaria del giro dentado, las células granulares proporcionan entrada desde la corteza entorrinal a la región CA311.
Las poblaciones de células madre neurales pueden aislarse utilizando estrategias de aislamiento inmunomagnético o inmunofluorescente12,13. El tejido neural es particularmente difícil de disociar; los esfuerzos para hacerlo a menudo resultan en muestras con poca viabilidad celular y / o no producen la suspensión de una sola célula necesaria para el análisis posterior. La disociación neuronal se puede realizar a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de técnicas14,15. En un estudio que evaluó los métodos de disociación neural, se comparó la viabilidad y calidad de la disociación mecánica manual por trituración de pipetas versus combinaciones de trituración de pipetas y digestión con diversas enzimas15. La calidad se calificó en función de la cantidad de grupos celulares y ADN o restos subcelulares en la suspensión preparada15. Las suspensiones de tumores gliales sometidos a disociación mecánica manual sola tuvieron una viabilidad celular significativamente menor que los tratamientos con dispasa o una combinación de DNasa, colagenasa e hialuronidasa15. Volovitz et al. reconocieron la variación en viabilidad y calidad entre los diferentes métodos y enfatizaron que una disociación inadecuada puede reducir la precisión del análisis aguas abajo15.
En un estudio separado, los autores compararon más de 60 métodos y combinaciones diferentes de disociación de células neuronales cultivadas14. Estos métodos incluyeron ocho variaciones diferentes de disociación mecánica manual por trituración de pipetas, una comparación de la incubación con cinco enzimas individuales a tres intervalos diferentes y varias combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática o la combinación de dos enzimas14. Ninguno de los métodos mecánicos produjo una suspensión de una sola célula14. Cuatro de los tratamientos de enzima única, diez de los tratamientos enzimáticos combinados y cuatro de las combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática produjeron una suspensión de una sola célula14. La digestión enzimática con TrypLE seguida de las muestras disociadas de Tripsina-EDTA de manera más efectiva14. Por cierto, las muestras tratadas con TrypLE y/o Tripsina-EDTA tendían a formar grupos gelatinosos14. Si bien este estudio se realizó en células cultivadas, habla de las deficiencias de la trituración de pipetas o la digestión enzimática sola.
Faltan comparaciones lado a lado de la disociación mecánica manual versus automatizada. Sin embargo, un grupo ejecutó la citometría de flujo para comparar la disociación mecánica manual y semiautomatizada de cerebros de ratones enteros junto con kits de disociación enzimática de papaína comercial o tripsina16. El procesamiento con el disociador produjo células viables de manera más consistente16. Después de la disociación, los autores también aislaron células prominina-1, células precursoras neuronales y microglia16. Para dos de las tres poblaciones de células aisladas, la pureza de las células aisladas fue ligeramente mayor cuando las muestras se procesaron con el disociador, en comparación con16 manualmente. Reiß et al. señalaron que la variabilidad de persona a persona en la técnica de pipeteo dificulta la reproducibilidad del rendimiento de la población celular viable en la disociación tisular16. Los autores concluyeron que la disociación mecánica automatizada estandariza el procesamiento de muestras16.
El método de disociación descrito en este manuscrito es una combinación de disociación mecánica totalmente automatizada y digestión enzimática, utilizando soluciones que acompañan a un kit comercial de disociación cerebral adulta17. A diferencia de los protocolos estándar, este protocolo optimizado reduce la manipulación de muestras, produce una suspensión unicelular altamente viable y está destinado a procesar cantidades mínimas de tejido de partida.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-003</td><td>Basix, colores surtidos</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>Becton Dickinson Labware Europa</td><td>352009</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>25 mL Pipetas serológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Filtro de vacío/ Almacenamiento Sistema de botellas</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación cerebral para adultos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-107-677</td><td>Contiene enzima P, tampón Z, tampón Y, enzima A, tampón A, solución de eliminación de residuos</td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, ratón, clon REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Proteína básica antimielina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSA-NCAM-PE, humano, ratón y rata, clon 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue, ratón, clon REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD31</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa calefactora de cerámica</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco de Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09 Flujo de</td><td>perfusiónJo</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td></td><td>(v10.7.0)</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Disociador con Calentadores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de manchas de células muertas Aqua fijable</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Noyes</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído de</td> disección <td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-3KG</td><td>Con prilas, 95%</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta GP LTS 20 y micro; L 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta GP LTS 250 &micro; L 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389277</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta RT LTS 1000 &micro; L FL 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &mu; L)</td> <td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>Cubitera redonda con tapa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo con tapa de filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 Llenadoras de pipetas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Espátula & Sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td>Disección & Perfusión</td></tr><tr><td>Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"</td><td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td><td>Aguja de mariposa</td></tr><tr><td>Rack para tubos de ensayo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Legend XTR Centrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>descatalogada</td><td>U otra centrífuga de mesa estándar</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de flujo variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Modelo de bajo caudal</td></tr><tr><td>Kit de inicio VetFlo para ratones</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-MSEKIT Máscara de</td><td>anestesia, tubo, cámara de inducción, botes de carbón</td></tr><tr><td>VetFlo Vaporizador Sistema de anestesia monocanal</td><td>Kent Scientific VetFlo-1210S</td><td></td><td>0.2&ndash; 4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Analizador de viabilidad celular</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>731196</td><td></td></tr> recuento <tr><td>de células Vi-CELL XR 4 bolsas de viales de muestra</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383721</td><td>recuento de células</td></tr></tbody></table>

disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Este protocolo de disociación neuronal (una adaptación del protocolo que acompaña a un kit comercial de disociación cerebral adulta) optimiza el procesamiento de tejidos en preparación para análisis detallados aguas abajo, como la citometría de flujo o la secuenciación de una sola célula. La disociación neuronal se puede llevar a cabo a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de las mismas. La naturaleza delicada de las células neuronales puede complicar los esfuerzos para obtener la suspensión unicelular verdadera y altamente viable con un mínimo de desechos celulares que se requiere para el análisis de una sola célula. Los datos demuestran que esta combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable (>90%), superando las dificultades antes mencionadas. Si bien algunos de los pasos requieren destreza manual, estos pasos disminuyen el manejo de muestras y la posible pérdida de células. Este manuscrito detalla cada paso del proceso para equipar a otros laboratorios para disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural en preparación para el análisis posterior.

Las muestras se procesaron con un citómetro de flujo en una instalación central, y los datos resultantes se evaluaron con un paquete de software para el análisis de flujo. Anteriormente, se analizaron los controles de compensación: la mancha viva / muerta y el control negativo. Si se utilizan múltiples fluorocromos, se deben preparar controles de fluorescencia menos uno (FMO) y controles de tinción única para cada anticuerpo. La compensación por superposición espectral para las muestras experimentales se calculó en funci...

Este protocolo de disociación de células neuronales está destinado a muestras con una baja cantidad de material de partida y produce una suspensión unicelular altamente viable para el análisis posterior, con pasos opcionales de fijación y tinción.

Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural puede equipar a los laboratorios para obtener información específica de la estructura sobre la eficacia del tratamiento, la función celular, así como la enfermedad y los mecanismos de acción del tratamiento. Este protocolo de disociación neuronal produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable y real. Además, podemos procesar muestras que son solo una fracción de las que están destinados los kits comerciales.La planificación y preparación adecuadas son clave para un resultado exitoso de esta técnica. Ejecutar varias rondas de práctica para familiarizarse con el protocolo sería beneficioso. Después de anestesiar a un ratón C57BL/6J hembra de seis meses de edad, pellizque la parte inferior del abdomen y levante la piel con fórceps.Luego, con tijeras, corte a través del pelaje y la piel hasta la parte inferior de la caja torácica. Haga dos incisiones diagonales que comiencen por debajo de la caja torácica y se muevan hacia cada hombro. Luego reseque cuidadosamente el diafragma y la caja torácica para exponer el corazón.Después de extraer cuidadosamente cualquier tejido conectivo alrededor del corazón, use tijeras para cortar la aurícula derecha. Luego apague el flujo de isoflurano hacia el respirador. Manteniendo el corazón firme con fórceps y con el bisel de la aguja de mariposa hacia arriba, perfore el ventrículo izquierdo mientras mantiene la aguja nivelada y paralela al animal.A continuación, mantenga la aguja en su lugar, encienda la bomba y perfunda al menos 30 mililitros de la solución salina o heparina hasta que el líquido que sale del corazón sea opaco y el hígado y los pulmones de color pálido. Después de la perfusión, apague la bomba, retire la aguja y transfiera el ratón al área de disección. Después de la decapitación, corte el pelaje desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos y despegue la piel hacia atrás para exponer el cráneo.A continuación, recorte el cráneo entre los ojos y haga dos cortes en la parte posterior del cráneo en las posiciones de las 10 y 2 en punto. Luego haga un corte largo a lo largo de la línea media sagital del cráneo hasta el corte original entre los ojos. A continuación, con fórceps, despegue las dos mitades del cráneo hacia los lados.Luego use una espátula para extraer el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de vidrio de 60 milímetros llena de DPBS frío y mantenida en hielo. Usando un bisturí o una maquinilla de afeitar, separe cada hemisferio y retire los bulbos olfativos y el cerebelo. Luego retire el mesencéfalo hasta que el hipocampo esté expuesto.A continuación, asegure el cerebro con fórceps. Luego, usando un segundo juego de fórceps, saque suavemente el hipocampo de cada hemisferio. Transfiera ambos hipocampos a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros que contenga DPBS frío y coloque el tubo sobre hielo.Usando fórceps, transfiera las piezas de tejido del hipocampo a un tubo C y agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas 2 en el tubo. Después de girar la tapa y apretar hasta que haga clic, coloque el tubo en un disociador y ejecute el programa apropiado. Mientras el programa se está ejecutando, moje previamente un colador de células de 70 micras colocado en un tubo cónico de 50 mililitros con dos mililitros de tampón BSA.Una vez que se complete el programa de disociación, agregue cuatro mililitros de tampón BSA al tejido disociado y filtre la mezcla a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de DPBS al tubo C. Luego cierre el tubo, gire la solución suavemente y filtre a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar la suspensión de la célula filtrada, desechar el sobrenadante sin molestar el pellet y almacenar el pellet. Para la eliminación de escombros, vuelva a suspender el pellet con 1, 550 microlitros de DPBS frío y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado. Luego agregue 450 microlitros de solución de eliminación de escombros fríos y pipetee hacia arriba y hacia abajo.Superponga suavemente la suspensión celular con un mililitro de DPBS frío, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita el procedimiento hasta que la superposición total sea de dos mililitros. A continuación, centrífuga la suspensión a 3.000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo.Aspire la capa superior, luego barre la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa media blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin perturbar la capa inferior. A continuación, agregue dos mililitros de DPBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Luego centrífuga la suspensión a 1, 000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un tampón BSA de mililitros. Después del conteo celular, centrifugue la suspensión celular restante y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tinción muerta viva diluida.Luego transfiera la muestra a un tubo de flujo etiquetado e incube a temperatura ambiente durante 8 a 10 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, agregue 500 microlitros de tampón BSA y repita el paso de centrifugación. Luego deseche el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de tampón en el tubo.La puerta primaria excluyó los escombros en los gráficos de dispersión hacia adelante frente a los gráficos de dispersión lateral y las células muertas se excluyeron posteriormente. La segunda puerta excluyó las células positivas para la proteína básica de mielina. Y de las células restantes, se crearon diagramas de densidad de células positivas para cada fluorocromo.La frecuencia de cada población de células neuronales se calculó a partir de la tercera puerta. Las muestras procesadas con disociación mecánica manual y digestión enzimática produjeron una población sustancialmente menor de células de interés, mientras que tanto las muestras frescas como las fijas procesadas con disociación mecánica automatizada y digestión enzimática mostraron una población varias veces mayor de células de interés. Si bien los pasos de perfusión y eliminación de escombros pueden ser desafiantes inicialmente, mantener una mano suave y firme puede ayudar a garantizar el éxito.

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Este video muestra un protocolo para obtener una suspensión unicelular altamente viable del hipocampo del cerebro del ratón utilizando una combinación de disociación mecánica automatizada y una mezcla de enzimas para ayudar en la digestión enzimática.

Obtención de una suspensión unicelular a partir de tejido del hipocampo de ratón

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Este video muestra un protocolo para aislar células de hipocampos de ratas, incluyendo neuronas, astrocitos y microglía.

Obtención de varias poblaciones de células neuronales a partir de un hipocampo de ratas

Este video muestra el registro de la actividad rítmica de la red neuronal, también conocida como oscilaciones theta, en un hipocampo aislado. Los electrodos se insertan en varias capas y posiciones espaciales para detectar y analizar las oscilaciones theta. Esto muestra las composiciones neuronales únicas y la conectividad de la red neuronal a través de diferentes capas del hipocampo.

Registro in vitro de oscilaciones theta en el hipocampo del ratón

Los cultivos neuronales embrionarios primarios disociados del hipocampo son útiles para investigar los mecanismos de señalización implicados en la muerte neuronal. El sexado de los embriones antes del aislamiento y disociación del hipocampo permite la preparación de cultivos masculinos y femeninos separados, lo que permite al investigador identificar e investigar la señalización celular específica del sexo.

Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.

Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

Aprende a disociar tejido neural del hipocampo de ratón C57BL/6J mediante digestión enzimática y disociación mecánica automatizada. Este protocolo genera suspensiones celulares viables para análisis de poblaciones neuronales.

Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón

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