Name: Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a monitorear la eficiencia del empalme en células HeLa utilizando un ensayo con reportero minigen. Este método permite estudiar mutaciones asociadas a enfermedades y desarrollar terapias con U1 snRNA supresor.

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Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana del Cáncer (la Subvención de Investigación Institucional 74-001-34-IRG) y a S.S. y W.M. del Programa de Asociación de Investigación del Valle (P1-4009 y VRP77). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo se puede adaptar para el análisis de empalme en líneas celulares distintas de HeLa, sin embargo, es posible que sea necesario optimizar los factores que afectan la eficiencia de la transfección, como la confluencia celular y la cantidad de ADN. La relación de constructo reportero-U1 es otro parámetro crítico que puede necesitar ser determinado dependiendo de los niveles de expresión observados en otros tipos de células. La calidad del ARN extraído es crítica para el análisis de empalme; por lo tanto, el uso de ...

El empalme pre-ARNm es un paso de procesamiento esencial que elimina los intrones no codificantes y liga con precisión los exones codificantes para formar ARNm maduro. El reconocimiento de secuencias de consenso en las uniones exón-intrón, denominadas sitio de empalme de 5′ y sitio de empalme de 3′, por componentes de la maquinaria de empalme inicia el proceso de empalme. La ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 (snRNP) reconoce el sitio de empalme 5′ por emparejamiento de bases del snRNA U1 con el pre-ARNm1. Las mutaciones heredadas genéticamente que alteran las secuencias del sitio de empalme 5′ se asocian con muchas enfermedades2,3. Se predice que la pérdida de emparejamiento base de SnRNA U1 con los sitios de empalme mutantes de 5'causa un empalme aberrante, que puede comprometer la traducción de la transcripción afectada. Un enfoque terapéutico potencial para corregir los defectos de empalme implica la supresión de mutaciones por snRNA U1 modificado que transporta cambios de nucleótidos compensatorios en su región de 5′que se basa con el sitio de empalme de 5'. Se ha encontrado que estos snRNAs U1 modificados, también conocidos como snRNAs U1 específicos del exón, son efectivos para revertir los defectos de empalme, lo que resulta en una mayor expresión de proteínas del ARNm rescatado4,5,6,7,8.
Aquí, describimos el ensayo de complementación U1 snRNP, un ensayo de empalme celular basado en reporteros que permite la evaluación del efecto de las mutaciones de 5′-ss en el empalme de un exón y también se puede usar para el desarrollo de snRNAs U1 modificados para permitir el rescate de la inclusión de exones. También proporcionamos protocolos para el monitoreo de las transcripciones de reportero empalmadas por extensión de imprimación y RT-PCR, y para determinar la expresión de snRNAs U1 modificados por extensión de imprimación y RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Agua desionizada de grado reactivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de polvo Eagle Medium modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), Fuente australiana,</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, solución estándar 1.0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, certificado ACS Plus, 36.5 a 38.0%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros desechables de tapa de botella PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica EDTA dihidratada</td><td>Amresco</td><td>0105-2,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % de tripsina (10x), sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Fisher Biorreactivo</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Biorreactivo Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Disódico Fosfato de hidrógeno Heptahidratado</td><td>Biorreactivo Fisher</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potasio</td><td>Biorreactivo Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Medio de transfección - Opti-MEM&trade; I Medio de suero reducido, sin rojo fenol</td><td>Reactivo</td> de transfección ThermoFisher Scientific <td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>- Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reactivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo (aprox. 0,75 % de etanol como conservante/biología molecular)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto (200 pruebas), grado de biología molecular, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol, grado de biología molecular, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo</td><td>Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Plomo, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Granos de exclusión de tamaño - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Mini columnas de exclusión de tamaño</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de bajo peso molecular, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos inactivantes de rnasa - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM ea)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; Inhibidor de la ribonucleasa recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>transcriptasa inversa - M-MLV Transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>utilizado para la extensión de cebadores</td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Hexámeros aleatorios (50 y micro; M)</td><td>ThermoFisher Scientific N8080127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de PCR en tiempo real - SYBR&trade; Seleccione Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>utilizado para la preparación de ADNc</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampón de primera cadena</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamida (&ge; 99.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Revisión Hojas de datos de seguridad del material</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (cristales blancos o polvo cristalino/biología molecular)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (cristalino/ Electroforesis)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida: Bis-Acrilamida 19:1 (40% Solución/Electroforesis)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Revisar Hojas de datos de seguridad del material</td></tr><tr><td>Urea (cristales incoloros a blancos o polvo cristalino/Mol. Biol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodisulfato de amonio (APS) &ge; 98%, Pro-Pure, Grado Proteómico VWR</td><td></td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED) &ge; 99%,</td><td>Ultrapure VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Revisión Hojas de datos de seguridad</td></tr><tr><td>del material Sistemas de gel de losa ajustables, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 14,5 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 22,0 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 38,7 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Cribas de fósforo de almacenamiento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade; FLA 7000 Generador de imágenes biomoleculares</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Contador de centelleo líquido</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador</td> táctil <td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Sistemas de PCR en tiempo real</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Durante la expresión génica, el paso vital del empalme pre-ARNm implica el reconocimiento preciso de los sitios de empalme y el ensamblaje eficiente de los complejos espliceosómicos para unir exones y eliminar los intrones antes de la exportación citoplasmática del ARNm maduro. La eficiencia del empalme puede verse alterada por la presencia de mutaciones en los sitios de empalme, la influencia de los factores de empalme de acción trans o la actividad de la terapéutica. Aquí, describimos el protocolo para un ensayo celular que se puede aplicar para monitorear la eficiencia de empalme de cualquier exón dado. El ensayo utiliza un plásmido adaptable codificado 3-exon/2-intron minigene reporter, que puede expresarse en células de mamíferos por transfección transitoria. Después de la transfección, se aísla el ARN celular total, y la eficiencia del empalme de exones en el ARNm reportero se determina mediante la extensión del cebador o la reacción en cadena semicuantitativa de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Describimos cómo se puede determinar el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5′ asociadas a la enfermedad introduciéndolas en el reportero; y cómo la supresión de estas mutaciones se puede lograr mediante la coinfección con el ARN nuclear pequeño (snRNA) U1 que lleva mutaciones compensatorias en su región de 5′ que se fusiona con los sitios de empalme 5′ en las uniones exón-intrón en pre-ARNm. Por lo tanto, el reportero se puede utilizar para el diseño de partículas terapéuticas de U1 para mejorar el reconocimiento de los sitios de empalme mutantes de 5 '. La inserción de sitios reguladores de acción cis, como secuencias de potenciador de empalme o silenciador, en el informador también se puede utilizar para examinar el papel de U1 snRNP en la regulación mediada por un factor de empalme alternativo específico. Finalmente, las células que expresan al reportero se pueden incubar con moléculas pequeñas para determinar el efecto de la terapéutica potencial en el empalme constitutivo de pre-ARNm o en exones que transportan sitios de empalme mutantes de 5 '. En general, el ensayo de reportero se puede aplicar para monitorear la eficiencia del empalme en una variedad de condiciones para estudiar los mecanismos fundamentales de empalme y las enfermedades asociadas al empalme.

El reportero de empalme Dup51, un minigén de tres exones-dos intrón, se derivó del gen humano β-globina y ha sido descrito previamente (Figura 1A)11,12 . Creamos un reportero mutante, Dup51p, introduciendo mutaciones en el sitio de empalme 5' asociadas al síndrome de Usher que ocurren en el exón 3 del gen de la protocadherina 15 (PCDH15)13. La secuencia del sitio de empalme 5' en la unión exón 2-intró...

Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.

Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Este protocolo describe un ensayo celular para monitorear la eficiencia de empalme, utilizando un informador de administración adaptable. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar los efectos de las mutaciones asociadas a la enfermedad en los sitios Exxon o de empalme, y para diseñar terapia, particularmente una partícula, para mejorar el reconocimiento de los sitios de empalme mutantes a cinco puntos. El paso en las células Hela aspira el medio gastado e incuba las células con tres mililitros de 0,2 5%viajes en la que contienen un milimolar EDTA, a 37 grados centígrados durante tres minutos.Después de la incubación a siete mililitros de DMEM fresco y transferir la suspensión celular a un tubo de 10 mililitros. Centrifugar las células. Luego resuspenda el pellet celular en 10 mililitros de DMEM fresco y coloque las células en una nueva placa de cultivo de tejidos al 20% de confluencia, para transfección transitoria.Cuente las células hela con un portaobjetos de hemo citómetro limpio y prepare una suspensión con una densidad de 2.5 veces 10 a la quinta célula por mililitro, selle un mililitro de la suspensión celular en cada pozo de una placa de 12 pocillos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente aspirar el medio gastado y añadir 800 microlitros de DMEM fresco con suero a la placa. Preparar las mezclas de transfección y Vortex durante 15 segundos.Luego centrifuga las mezclas e incuérralas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue los 200 microlitros de la mezcla de transfección en un pozo de la placa de células hela de 12 pocillos para lograr un volumen final de un mililitro por pozo, e incube la placa a 37 grados Celsius durante 48 horas. Las reacciones de etiquetado preparadas se están incubando.Resusped las perlas de exclusión de tamaño de corte de peso molecular Dalton de 25 kilos mediante un vórtice suave durante 10 segundos. A continuación, transfiera 600 microlitros de las cuentas resuspendidas a una mini columna desechable, colocada en un tubo de recolección de 1,5 mililitros, y devuelva el stock de cuentas a cuatro grados centígrados. Centrifugar la columna y descartar el flujo a través de ellas.Luego lave las perlas dos veces agregando 300 microlitros de agua libre de ARN a la columna. Después del segundo lavado, transfiera la mini columna a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y agregue la mezcla de reacción de quinasa a la columna. Centrifugar la columna y recoger el flujo a través de la contención de los oligonucleótidos marcados P32.Agregue dos microgramos de ARN extraído de las células heli en tubos de microcentrífuga de 200 microlitros y agregue agua libre de ARN para completar el volumen a 6.55 microlitros. A continuación, agregue 0.9 microlitros, una mezcla maestra a cada tubo de PCR que contenga las muestras de ARN, e incube los tubos primero a 65 grados Celsius durante cinco minutos, y luego en hielo durante un minuto. A continuación, a 2,55 microlitros, una mezcla maestra de dos, a cada tubo que contiene el ARN y una mezcla maestra uno, e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de la incubación, transfiera los tubos a un termociclador e incube primero a 50 grados centígrados durante 60 minutos, y luego a 70 grados centígrados, durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue 10 microlitros de colorante de carga de ARN de formamida 2X a cada muestra, y proceda a separar los fragmentos por página UIA. Síntesis de ADN de Percy.Agregue dos microgramos de ARN extraído de las células hela transectadas, en tubos de microncentrífuga de 200 microlitros y agregue agua libre de ARN para compensar el volumen a un bajo 11 microlitros. A continuación, agregue dos microlitros, una mezcla maestra a cada muestra e incube primero a 65 grados Celsius durante cinco minutos, luego en hielo durante un minuto. A continuación, agregue siete microlitros, una mezcla maestra de dos a cada tubo e incube los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de la incubación a 50 grados Celsius durante 60 minutos y 70 grados Celsius durante 15 minutos.A continuación, para la PCR diluir la reacción del ADN C para producir una concentración de 100 nanogramos por microlitro, y transferir un microlitro de cada muestra de CDNA a nuevos tubos de PCR. Agregue 10.5 microlitros de la mezcla maestra a cada tubo que contenga CDNA y realice la PCR. Uso de un termociclador Después de que se complete la PCR.Agregue 12.5 microlitros de colorante de carga de ADN de formamida 2X a cada tubo. Calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y proceder a realizar una página UIA. Pipetear cinco microlitros de CDNA diluido en pozos individuales de un triplicado de placa qpcr de 96 pocillos.A continuación, agregue 10 microlitros de mezcla de PCR en tiempo real a cada pozo, selle las placas con una película óptica y centrífuga para recolectar las reacciones al fondo de los pozos, luego realice el qpcr mientras recopila los valores del ciclo de cuantificación del umbral del amplicón objetivo. Antes de cargar los marcadores y las muestras, enjuague los pozos con tampón TBE para eliminar la urea asentada. Luego cargue 10 microlitros de cada muestra por pozo y ejecute el gel a 300 a 500 voltios durante dos o tres horas, o hasta que el xileno llegue al fondo.Después de la electroforesis, retire las placas de vidrio del aparato de electroforesis y separe cuidadosamente las dos placas para que el gel quede plano en cualquiera de las superficies de vidrio, luego transfiera el gel a un papel de filtro y cúbralo con una envoltura de plástico, usando un secador de gel, seque al vacío el gel a 80 grados centígrados durante 30 minutos. luego coloque el gel seco en un cassette de imágenes de fósforo para incubar durante la noche a temperatura ambiente. Cuando se expresa en celdas hela, el reportero de corte dup 51 minnijean expresa la transcripción madura de longitud completa en la que Exxon dos se empalma de manera eficiente. Las cinco mutaciones del sitio de empalme primario y dup 51 P reducen la inclusión de Exxon dos del 95 al 30%, lo que lleva a la formación de una transcripción más corta.La coexpresión de dup 51 P con U15A SNRNA rescata a Exxon dos empalmes y restaura la formación de la transcripción completa. Por el contrario, la coexpresión con la variante salvaje de tipo U1 o U15G no tiene el efecto similar en el empalme dup 51P. La detección de transcripciones de variantes U15A, por extensión primaria utiliza el oligonucleótido U1 siete a 26, que es de 20 nucleótidos largos y pares de bases cerca de la adenina en la quinta posición del SNRNA U1.En presencia de DATP solo, U1 siete a 26 permite incorporar de dos a tres nucleótidos para el SNRNA U1 tipo salvaje endógeno que produce un producto largo de 22 o 23 nucleótidos. Para las variantes U15A y U15G, la extensión termina después de agregar una sola adenosina que produce un producto de 21 nucleótidos. Después de la normalización a la expresión de SNRNA U2, las variantes transfectadas de U1 wild-type U1 5g y U15A se expresaron de tres a cinco veces sobre el SNRNA endógeno.La calidad del ARN extraído es crítica para el análisis de empalme. Por lo tanto, el uso de agua libre de ARN y la descontaminación de los servicios con agentes inactivadores de ARN es muy recomendable. El sistema de informes descrito aquí se puede aplicar para estudiar el papel de los ARN de SN U1 en las regulaciones de empalme para revertir el efecto de las mutaciones de empalme de precios flash para el silenciamiento de genes utilizando ARN de modificación de U1SN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Los eventos de empalme en tándem ocurren en sitios a menos de 12 nucleótidos de distancia. La cuantificación de las proporciones de dichas variantes de empalme es factible utilizando un enfoque de PCR cuantitativo absoluto. Este manuscrito describe cómo se pueden cuantificar las variantes de empalme del gen STAT3, en las que dos eventos de empalme dan lugar a la inclusión/exclusión de Serina-701 y a α/β C-terminal.

La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

SINEUPs son sintético antisentido no-codificación RNAs, que contienen un dominio de unión a (BD) y un dominio efector (ED) y para arriba-regulan la traducción de mRNA de destino. Aquí, se describen métodos de detección de SINEUPs en líneas de cultivos celulares, análisis de su actividad de promoción de la traducción por Western-blot y un alto rendimiento semi-automático sistema de imagen.

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Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

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Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

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