Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D, como algunas proteínas de membrana integrales. Pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa lipídica.

Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua, de modo que los grupos de cabeza polar del lípido permanecen hidratados en la fase acuosa. Y las colas de acilo no polares de la partición lipídica a la interfaz de agua de aire, que rompe la tensión superficial y aplana la superficie del agua. La naturaleza de la carga las sustancias químicas distintivas de los grupos de cabeza lipídica proporcionan la afinidad por las proteínas en solución.

Promover la unión y, en principio, la formación de matrices 2D. Cualquier cristal 2D formado en una monocapa lipídica se puede transferir fácilmente al microscopio electrónico en una rejilla EM recubierta de carbono que se utiliza para levantar y apoyar la matriz cristalina en la capa lipídica. Describimos en este manuscrito, una metodología de monocapa lipídica para imágenes de microscopía electrónica criogénica.

Preparación monocapa lipídica. Preparación de stock de lípidos, prepare una mezcla de lípidos de 0.01 mg por ml en 9: 1 volumen a volumen cloroformo, metanol. Utilizando 8,91 ml de cloroformo y 0,99 ml de metanol y 0,1 ml de una solución lipídica de 10 mg por ml.

Preparación de placas de teflón. Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante cinco minutos. Lavar con agua caliente durante 15 minutos y luego enjuagar con agua destilada.

Secar la placa de teflón en un desecado durante 30 minutos y mantenerla al vacío hasta su uso. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón. El tiempo estimado de funcionamiento será de una hora y media.

Coloque un papel de filtro tipo uno en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro. Llene los pozos de la placa de teflón con 60 microlitros de tampón. Agregue cuidadosamente la mezcla líquida sobre la superficie del tampón gota a gota.

Idealmente un microlitro por gota usando una jeringa Hamilton. Humedezca el papel de filtro con agua destilada y mantenga la humedad en la placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos, el cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie de los tampones.

Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica. Tiempo estimado de funcionamiento de una hora y media. Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono sin brillo descargando carbono hacia abajo en la superficie de cada depósito de amortiguación.

Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral, use concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de un micromolar. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. Inyecte suavemente aproximadamente de 20 a 30 microlitros de tampón en el puerto de inyección del sitio para elevar la rejilla por encima de la superficie del bloque de teflón.

Esto le permite recoger la rejilla con un par de pinzas y levantarla verticalmente de la gota. Resultados representativos. Una monocapa lipídica depositada en una rejilla EM se puede visualizar bajo el microscopio electrónico de transmisión sin tinción de contraste.

La presencia de monocapa se puede reconocer, por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en esa trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste más bajo que las que no tienen cobertura. Dado que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión, muestra una iluminación más brillante.

En conclusión, el método de la monocapa lipídica ofrece una oportunidad para estudiar las estructuras de las proteínas debido a su simplicidad. Puede proporcionar un enfoque alternativo para facilitar el proceso de cristalización 2D.