Name: Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 22 s
Description: Aprende a preparar monocapas lipídicas para cristalización bidimensional de proteínas periféricas y solubles. Este método facilita estudios estructurales mediante microscopía electrónica criogénica.

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La preparación de este manuscrito fue parcialmente apoyada por la Oficina de Investigación del Ejército de los Estados Unidos (W911NF2010321) y los fondos iniciales de la Universidad Estatal de Arizona para P.-L.C.

1. Preparación del bloque de teflón
<ol><li>Prepare el bloque de teflón a partir de resina de PTFE (politetrafluoroetileno) resistente a los productos químicos. Haga taladros en el bloque utilizando un taladro general seguido de las dimensiones etiquetadas en la Figura 1.</li>
</ol>2. Preparación lipídica monocapa
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 30- 45 minutos
<ol><li>Preparación de stock de lípidos<ol>
<li>Preparar una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en cloroformo/metanol 9:1 (v/v) utilizando 8,91 ml de cloroformo, 0,99 ml de metanol y 0,01 ml de lípidos de 10 mg/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de placas de teflón<ol>
<li>Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante 5 minutos.</li>
		<li>Lavar con agua caliente durante 15 minutos.</li>
		<li>Enjuague con agua destilada.</li>
		<li>Seque la placa de teflón en un desecador durante 30 minutos y manténgala al vacío cuando no esté en uso(Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas
<ol><li>Prepare recién una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en una mezcla 9:1 de cloroformo/metanol el día del experimento.</li>
	<li>Coloque un papel de filtro Tipo 1 en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro.</li>
	<li>Llene los pozos de la placa de teflón con 60 μL del tampón.</li>
	<li>Agregue cuidadosamente la mezcla de lípidos en la parte superior de la superficie tampón gota a gota (idealmente 1 μL por gota) usando una jeringa Hamilton.</li>
	<li>Humedezca el papel de filtro con agua destilada para mantener la humedad en la placa de Petri.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. El cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie del tampón.</li>
</ol>4. Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas
<ol><li>Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono agujereada sin descarga de resplandor, con el lado de carbono hacia abajo, en la parte superior de cada depósito de amortiguación.</li>
	<li>Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral. Utilice las concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de 1 μM de proteína como punto de partida. Pre-optimizar la concentración de proteínas antes del experimento.</li>
	<li>Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Inyecte suavemente aproximadamente 20-30 μL de tampón en el puerto de inyección lateral. Esto elevará la cuadrícula por encima de la superficie del bloque de teflón.</li>
	<li>Inmediatamente levante la rejilla con una pinza y levántela verticalmente de la gota.</li>
	<li>Preparar muestras monocapa para tinción negativa o imágenes crio-TEM (Figura 2). Si las proteínas forman una matriz 2D, el espectro de potencia de la imagen o el periodograma de Fourier mostrarán intensidades de difracción en las frecuencias espaciales basadas en la simetría cristalina. Si no se muestran puntos de difracción en el espectro de potencia, es poco probable que las proteínas formen un cristal 2D.</li>
	<li>Compruebe la cobertura de la monocapa lipídica en la red EM utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Una imagen de electrones de menor magnificado es útil para identificar la morfología de la monocapa cubierta. Por lo general, el contraste de imagen del área cubierta de monocapa será ligeramente menor que el de las áreas descubiertas. Además, el espectro de potencia de imagen 2D calculado ayudará a identificar la ubicación del cristalino 2D.</li>
</ol>

<ol><li>Raunser, S., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+as+a+technique+to+study+the+structure+on+membrane+proteins+in+a+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment.</a> Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).</li>
<li>Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+beta-sheets+and+side-chain+clusters+in+two-dimensional+periodic+arrays+of+streptavidin+on+phospholipid+monolayers+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).</li>
<li>Braun, T., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Encyclopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electron crystallography.</a> Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).</li>
<li>Wang, H. -W., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-electron+microscopy+and+X-ray+crystallography+complement+each+other%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).</li>
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<li>Abeyrathne, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.15+Analysis+of+2-D+Crystals+of+Membrane+Proteins+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biophysics%22%5BJournal%5D)">1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy.</a> Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).</li>
<li>Muller, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lipid-Protein+Interactions+and+Lipid-Mediated+Modulation+of+Membrane+Protein+Function+through+Molecular+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).</li>
<li>Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+Interactions+between+Aquaporins+and+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).</li>
<li>Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lipid+head+groups+on+double-layered+two-dimensional+crystals+formed+by+aquaporin-0%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0.</a> PloS One. 10 (1), 0117371(2015).</li>
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<li>Gonen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+double-layered+two-dimensional+AQP0+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals.</a> Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).</li>
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<li>Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+membrane+junctions+reveal+the+structure+of+a+closed+water+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore.</a> Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).</li>
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<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+structural+changes+in+the+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1.</a> Nature Communications. 5, 3106(2014).</li>
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<li>Vénien-Bryan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+response+regulator+HupR+from+Rhodobacter+capsulatus.+Electron+microscopy+of+two-dimensional+crystals+on+a+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid.</a> Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).</li>
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<li>Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cholera+toxin+penetrating+a+lipid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane.</a> Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).</li>
<li>Celia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Escherichia+coli+gyrase+B+subunit+crystallized+in+two-dimensions+on+novobiocin-linked+phospholipid+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films.</a> Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).</li>
<li>Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+holoenzyme+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography.</a> Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).</li>
<li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+yeast+RNA+polymerase+A.+Electron+microscopy+of+lipid-bound+molecules+and+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).</li>
<li>Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystals+of+carboxysome+shell+proteins+recapitulate+the+hexagonal+packing+of+three-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).</li>
<li>Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+HIV-1+capsid+proteins+on+a+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+BIOLOGICAL+CHemistry%22%5BJournal%5D)">Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer.</a> The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).</li>
<li>Barklis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+membrane-bound+retrovirus+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins.</a> The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).</li>
<li>Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+purification%3A+a+rapid+method+for+isolating+protein+complexes+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).</li>
<li>Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).</li>
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<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Lebeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+a+membrane+protein+on+a+detergent-resistant+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer.</a> Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Una monocapa lipídica es una poderosa herramienta que facilita el crecimiento de grandes cristales 2D para estudios estructurales de macromoléculas biológicas. Para preparar con éxito una monocapa lipídica intacta en la interfaz aire-agua, se recomienda encarecidamente que los lípidos se preparen recién el día del experimento, ya que la oxidación de la cadena de acil lipídico podría provocar la interrupción del empaquetamiento en la monocapa y afectar negativamente la formación de cristales resultante. Los lípidos compra...

La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos1. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector4. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula5. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua6, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica18. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina2,25,la anexina V26,la toxina del cólera27,la subunidad28de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma31 y las proteínas de la cápside del VIH-132 y el virus de la leucemia murina de Moloney 33. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM34. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.
Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.

<table><tbody><tr><td>14:0 PC (DMPC)</td><td>Avanti Lípidos</td><td>850345</td><td>1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL</td></tr><tr><td>Bulbo para pipetas pequeñas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>al vacío Southern Labware</td><td>55207</td><td></td></tr><tr><td>EM</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>CF413-50</td><td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 y micro; m agujero, 1,3 y micro; m espacio</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-090</td><td>Diámetro 90 mm</td></tr><tr><td>Vidrio Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton (25 &micro; L)</td> <td>Jeringa Hamilton Company</td><td>80465</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (250 y micro; L)</td> <td>Jeringa Hamilton Company</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (5 y micro; L)</td> <td>Jeringa</td> Hamilton <td>Company 87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (500 y micro; L)</td> <td>Hamilton Company</td><td>203080</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1775-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm y veces; 15 mm</td></tr><tr><td>Bloque de teflón</td><td>Grainger</td><td>55UK05</td><td>60 y micro; Pocillos L con puertos de inyección laterales, fabricados manualmente</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>78325</td><td>Varios estilos</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>ultrapura</tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>VWR</td><td>97043-996</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

La cristalografía electrónica es una herramienta poderosa para la determinación de estructuras de alta resolución. Las macromoléculas como las proteínas solubles o de membrana se pueden cultivar en cristales bidimensionales (2D) altamente ordenados en condiciones favorables. La calidad de los cristales 2D cultivados es crucial para la resolución de la reconstrucción final a través del procesamiento de imágenes 2D. A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D de proteínas de membrana integral, pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa. Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua de tal manera que los grupos de cabeza lipídica polar permanecen hidratados en la fase acuosa y las cadenas de acilo no polares, las colas se dividen en el aire, rompiendo la tensión superficial y aplanando la superficie del agua. La naturaleza cargada o las partículas químicas distintivas de los grupos de cabeza proporcionan afinidad por las proteínas en solución, promoviendo la unión para la formación de matrices 2D. Una monocapa recién formada con la matriz 2D se puede transferir fácilmente a un microscopio electrónico (EM) en una rejilla de cobre recubierta de carbono utilizada para levantar y soportar la matriz cristalina. En este trabajo, describimos una metodología monocapa lipídica para imágenes criogénicas microscópicas electrónicas (crio-EM).

Una monocapa lipídica depositada en la rejilla EM se puede visualizar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) sin tinción. La presencia monocapa se puede reconocer por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en la trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste local más bajo que las que no tienen cobertura, ya que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión y muestra una iluminación más brillante(...

Las monocapas lipídicas se han utilizado como base para formar cristales de proteína bidimensionales (2D) para estudios estructurales durante décadas. Son estables en la interfaz aire-agua y pueden servir como un material de soporte delgado para la obtención de imágenes electrónicas. Aquí presentamos los pasos comprobados en la preparación de monocapas lipídicas para estudios biológicos.

Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D, como algunas proteínas de membrana integrales. Pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa lipídica.Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua, de modo que los grupos de cabeza polar del lípido permanecen hidratados en la fase acuosa. Y las colas de acilo no polares de la partición lipídica a la interfaz de agua de aire, que rompe la tensión superficial y aplana la superficie del agua. La naturaleza de la carga las sustancias químicas distintivas de los grupos de cabeza lipídica proporcionan la afinidad por las proteínas en solución.Promover la unión y, en principio, la formación de matrices 2D. Cualquier cristal 2D formado en una monocapa lipídica se puede transferir fácilmente al microscopio electrónico en una rejilla EM recubierta de carbono que se utiliza para levantar y apoyar la matriz cristalina en la capa lipídica. Describimos en este manuscrito, una metodología de monocapa lipídica para imágenes de microscopía electrónica criogénica.Preparación monocapa lipídica. Preparación de stock de lípidos, prepare una mezcla de lípidos de 0.01 mg por ml en 9: 1 volumen a volumen cloroformo, metanol. Utilizando 8,91 ml de cloroformo y 0,99 ml de metanol y 0,1 ml de una solución lipídica de 10 mg por ml.Preparación de placas de teflón. Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante cinco minutos. Lavar con agua caliente durante 15 minutos y luego enjuagar con agua destilada.Secar la placa de teflón en un desecado durante 30 minutos y mantenerla al vacío hasta su uso. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón. El tiempo estimado de funcionamiento será de una hora y media.Coloque un papel de filtro tipo uno en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro. Llene los pozos de la placa de teflón con 60 microlitros de tampón. Agregue cuidadosamente la mezcla líquida sobre la superficie del tampón gota a gota.Idealmente un microlitro por gota usando una jeringa Hamilton. Humedezca el papel de filtro con agua destilada y mantenga la humedad en la placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos, el cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie de los tampones.Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica. Tiempo estimado de funcionamiento de una hora y media. Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono sin brillo descargando carbono hacia abajo en la superficie de cada depósito de amortiguación.Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral, use concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de un micromolar. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. Inyecte suavemente aproximadamente de 20 a 30 microlitros de tampón en el puerto de inyección del sitio para elevar la rejilla por encima de la superficie del bloque de teflón.Esto le permite recoger la rejilla con un par de pinzas y levantarla verticalmente de la gota. Resultados representativos. Una monocapa lipídica depositada en una rejilla EM se puede visualizar bajo el microscopio electrónico de transmisión sin tinción de contraste.La presencia de monocapa se puede reconocer, por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en esa trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste más bajo que las que no tienen cobertura. Dado que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión, muestra una iluminación más brillante.En conclusión, el método de la monocapa lipídica ofrece una oportunidad para estudiar las estructuras de las proteínas debido a su simplicidad. Puede proporcionar un enfoque alternativo para facilitar el proceso de cristalización 2D.

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Research

Investigación

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Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

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