Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente
11 de marzo de 2022
Esta contribución describe cómo configurar la cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal y cómo realizar la recopilación automatizada de datos en serie a temperatura ambiente utilizando la plataforma de cristalización en chip.
Este protocolo demuestra la cristalización de proteínas en un dispositivo similar a un chip en la recolección de datos de difracción de rayos X. Este dispositivo se llama cristal sobre cristal porque los cristales de proteína crecen en un solo cristal de cuarzo. Tras el crecimiento exitoso de cristales de proteínas en tales dispositivos, se recogen miles de imágenes de difracción de cada dispositivo a temperatura ambiente sin siquiera tocar los cristales de proteína.
La difracción de rayos X a temperatura ambiente es muy esencial para estudiar la función de las proteínas que involucran muchos estados conformacionales. Estos cambios informativos de proteínas o acciones de proteínas pueden congelarse, por lo que no son detectables en criocristalografía. Estos dispositivos se pueden utilizar para estudiar los procesos de señalización inducidos por la luz y los cambios redox.
Solo un puñado de dispositivos proporciona conjuntos de datos completos y redundantes. Para comenzar el preensamblaje del dispositivo, etiquete el anillo exterior para la identificación de la muestra. Incluya el nombre del proyecto, el número de dispositivo, la condición de cristalización y la fecha que desee.
Luego coloque el anillo etiquetado boca abajo sobre una superficie limpia y coloque una oblea de cuarzo dentro del anillo exterior. A continuación, vierta una pequeña cantidad de aceite de inmersión de microscopio en una placa de Petri y sumerja una cuña en el aceite asegurándose de que ambos lados de la cuña estén bien recubiertos. Elimine cualquier exceso de aceite frotando la cuña sobre una superficie limpia.
Luego coloque la cuña aceitada encima de la primera oblea de cuarzo. Mezclar la solución proteica y el tampón de cristalización en la primera oblea de cuarzo con una pipeta. Trate de evitar las burbujas de aire al mezclar.
El volumen total de la solución de cristalización no debe exceder la capacidad máxima de la cámara de cristalización determinada por el tamaño y el grosor de la cuña. Coloque la segunda oblea de cuarzo sobre la solución mezclada. La solución se extenderá espontáneamente.
Luego golpee ligeramente la segunda oblea de cuarzo en el borde para ayudar a difundir el aceite mientras expulsa el aire. Asegure el dispositivo atornillando un anillo de retención en el anillo exterior. Si es necesario, utilice una herramienta de apriete.
Evite apretar demasiado, ya que puede causar que las delicadas obleas de cuarzo se deformen o agrieten. Guarde los dispositivos ensamblados en una caja a temperatura ambiente o dentro de una incubadora con temperatura controlada. Después de unas horas o días, coloque el dispositivo de cristalización bajo un microscopio y controle el crecimiento del cristal.
Si es necesario, optimice las condiciones de cristalización como se describe en el manuscrito. Para la calibración, instale un cristal YAG delgado en el soporte del chip, luego instale el tope del haz. A continuación, abra el software Insitux y ejecute el programa indicado para tomar imágenes de fluorescencia de rayos X del haz directo donde el dispositivo es un nombre seleccionado por el usuario para el dispositivo de cristalización y el dispositivo.
Param es el nombre de archivo que contiene parámetros de control específicos del dispositivo. Luego encuentre la posición precisa del haz de rayos X directo ejecutando el programa de ajuste de perfil de haz donde la imagen de grabación es el nombre de archivo de la imagen de fluorescencia de rayos X. Para el escaneo óptico, coloque un dispositivo de cristalización en el soporte del chip y asegúrelo con un tornillo de pulgar.
Luego monte el soporte del chip en la etapa de traslación del difractómetro a través de un mecanismo cinemático. Dependiendo de la sensibilidad a la luz de la muestra de proteína y el propósito del experimento, instale una fuente de luz blanca o infrarroja para tomar micrografías de la ventana óptica del dispositivo. Una vez que la configuración esté lista, ejecute el programa de escaneo ingresando el comando indicado para escanear en movimiento en la línea del haz.
A continuación, ejecute el programa de mosaico en un equipo de usuario donde x es el valor inicial de la columna e y es el valor inicial para desplazamientos no autorizados de micrografías. El programa une todas las micrografías en un montaje de uno a tres micrómetros de resolución de píxeles. Después de coser las micrografías, ingrese el comando indicado para ejecutar el programa de búsqueda de cristales.
Este programa realiza el reconocimiento de cristales y la planificación de disparos y los parámetros clave en este programa permiten la selección específica de cristales y la planificación de objetivos. Retire la fuente de luz y coloque el tope del haz. A continuación, ejecute el programa de recopilación de datos para la difracción en serie.
El comando sugerido desencadena la recopilación de datos visitando las tomas planificadas en una secuencia preprogramada. Cada cristal objetivo se transloca a la posición del haz. En cada parada, la exposición a rayos X se toma con o sin iluminación láser en un retraso de tiempo programado.
En el estudio, se compararon las condiciones de cristalización entre la difusión de vapor y un lote en chip. Aquí se demuestran cuatro estudios de casos de cristalización en chip y conjuntos de datos representativos recopilados directamente de dispositivos de cuarzo. Los experimentos de cristalografía dinámica revelaron cambios inducidos por la luz en la proteína fotorreceptora de color rojo lejano al comparar datos de 4.352 cristales en la oscuridad y 8.287 cristales después de la iluminación de la luz.
El conjunto de datos oscuros de la difracción de Laue en serie in situ dio como resultado densidades de electrones mejor resueltas, lo que permite la construcción segura del modelo de un cromóforo bilin en una conformación de signo Z. Los mapas de diferencias inducidas por la luz han revelado movimientos concertados en la lámina beta central, lo que sugiere la importancia del apilamiento pi-pi entre los anillos pirrólicos del cromóforo y varios residuos aromáticos. Esta plataforma se llama Insitux.
La ventaja única de esta plataforma es que uno no tiene que hacer ninguna manipulación de cristal una vez que se realiza la cristalización. Es necesario recopilar muchos conjuntos de datos en condiciones cambiantes para capturar los movimientos de las proteínas. Y esto es posible con Insitux porque permite la recopilación de datos a gran escala de miles de cristales de proteínas a temperatura ambiente.
Con esta nueva capacidad, incluida la cristalografía, los sistemas sensibles a la luz se pueden activar dentro del dispositivo y el sistema inerte de luz se puede estudiar si el dispositivo de cristal sobre cristal se convierte en flujos de salida.
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Visión general
Este protocolo demuestra la cristalización de proteínas en un dispositivo tipo chip para la recolección de datos de difracción de rayos X. El dispositivo de cristal sobre cristal permite el crecimiento de cristales de proteínas en un solo cristal de cuarzo, permitiendo la recolección automatizada de datos a temperatura ambiente.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Cristalización de proteínas
- Difracción de rayos X
- Recolección automatizada de datos
Antecedentes
- Los cristales de proteínas pueden crecer en dispositivos de cristal sobre cristal.
- La difracción de rayos X a temperatura ambiente es crucial para el estudio de las funciones de las proteínas.
- Los estados conformacionales de las proteínas pueden capturarse sin crio-cristalografía.
- Este método puede aplicarse para estudiar procesos de señalización inducidos por luz.
Propósito del estudio
- Establecer la cristalización de proteínas en dispositivos tipo chip.
- Realizar recolección serial automatizada de datos a temperatura ambiente.
- Facilitar el estudio de la dinámica y funciones de las proteínas.
Métodos utilizados
- Uso de dispositivos de cristal sobre cristal para la cristalización.
- Recolección automatizada de miles de imágenes de difracción.
- Técnicas de difracción de rayos X a temperatura ambiente.
- Análisis de los estados conformacionales de las proteínas.
Principales resultados
- Crecimiento exitoso de cristales de proteínas en los dispositivos.
- Recolección de extensos datos de difracción sin contacto físico.
- Demostración de la efectividad de los estudios a temperatura ambiente.
- Insitios sobre las acciones y cambios de las proteínas durante los procesos de señalización.
Conclusiones
- El dispositivo de cristal sobre cristal es efectivo para la cristalización de proteínas.
- La difracción de rayos X a temperatura ambiente proporciona valiosas percepciones.
- Este método puede mejorar la comprensión de la dinámica de las proteínas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Studying protein dynamics at physiological temperatures is critical for understanding functional mechanisms in drug discovery. This platform enables room-temperature X-ray diffraction without crystal manipulation, supporting the capture of conformational states relevant to target validation. It provides a scalable approach to generate high-quality structural data for mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein functional states under near-physiological conditions to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces need for cryogenic workflows, simplifying structural analysis of dynamic targets.
- Predictive Value: Facilitates observation of light-induced or redox-driven conformational changes relevant to signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals directly on chip, eliminating transfer steps that can compromise sample integrity.
- Operational Value: Allows hundreds to thousands of crystals to be screened in an automated, label-free manner.
- Assay Readiness: Generates standardized, diffraction-ready samples for high-throughput structural interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structural follow-up of hits from phenotypic screens by providing atomic-level insights into mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of structural states with functional outputs in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Improves target validation by revealing conformational ensembles that inform drug binding modes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing structural data that informs mechanistic understanding without perturbing native-state dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven structural biology by enabling time-resolved or condition-specific data collection.
- Screening: Delivers diffraction data from native-state crystals grown in situ, enhancing reliability of structural readouts.
- Analytics: Provides electron density maps and difference maps that quantify structural changes upon perturbation.
- Translational Research: Connects structural observations to functional assays through correlated light- or redox-induced changes.
- Enterprise Reuse: Devices can be replicated across projects and conditions, serving as a structural screening platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Captures protein dynamics at room temperature, reducing risk of cryo-induced artifacts in structural interpretation.
- Operational Value: Eliminates crystal harvesting and mounting, increasing throughput and reducing sample loss.
- Strategic Value: Enables rapid iteration between functional and structural assays for iterative design cycles.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target mechanism, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallization, X-ray diffraction, and optical microscopy.
- Depends on access to synchrotron beamlines capable of serial Laue diffraction and fast detectors.
- Necessitates standardized crystallization conditions and device handling protocols across teams.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of chamber dimensions and surface properties.
- Practical limitation: Data quality depends on crystal size and diffraction limit, which varies by target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Device Pre‐Assembly, Sample Loading, and Device Assembly
2:36
Device Storage, Crystallization Optimization, and Calibration
3:42
Optical Scanning
4:59
X‐Ray Diffraction
5:34
Results: On‐Chip Protein Crystallization Platform for Automated Serial Diffraction Collection
6:45
Conclusion
