Name: Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal para difracción de rayos X a temperatura ambiente. Este método permite recolectar miles de imágenes sin manipular los cristales, facilitando el estudio de estados conformacionales dinámicos.

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El uso de Advanced Photon Source, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencias operada para el Departamento de Energía de los Estados Unidos por el Laboratorio Nacional de Argonne, fue respaldada por el contrato DE-AC02-06CH11357. El uso de BioCARS fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención R24GM111072. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El uso de LS-CAT Sector 21 fue apoyado por Michigan Economic Development Corporation y Michigan Technology Tri-Corridor subvención 085P1000817. Este trabajo es apoyado por subvenciones de la Universidad de Illinois en Chicago, los Institutos Nacionales de Salud (R01EY024363) y la Fundación Nacional de Ciencias (MCB 2017274) a XY.

1. Premontaje del dispositivo
<ol><li>Etiquete el anillo exterior (30 mm de diámetro) para la identificación de la muestra. Si es necesario, incluya el nombre del proyecto, el número de dispositivo, la condición de cristalización y la fecha (Figura 1A). Coloque el anillo exterior boca abajo sobre una superficie limpia (Figura 1B) y coloque con cuidado una oblea de cuarzo dentro del anillo (Figura 1C). Esta primera oblea de cuarzo sirve como ventana de entrada para las radiografías incidentes.</li>
	<li>Vierta una pequeña cantidad de aceite de inmersión de microscopio (viscosidad de 150 cSt) en una placa de Petri. Sumerja una cuña en el aceite y asegúrese de que ambos lados de la cuña estén correctamente engrasados (Figura 1D). Retire el exceso de aceite frotando la cuña sobre una superficie limpia.</li>
	<li>Coloque la cuña aceitada encima de la primera oblea de cuarzo (Figura 1E). NOTA: El aceite de inmersión es un excelente sellador que protege la cámara de cristalización de la posible pérdida de vapor. Las virutas correctamente ensambladas generalmente duran semanas sin secado visible. Este paso previo al montaje se realiza bajo luz ambiental. Para muestras sensibles a la luz, todos los pasos posteriores, incluida la carga de muestras, el almacenamiento del dispositivo y la observación, deben llevarse a cabo bajo luz de seguridad.</li>
</ol>2. Carga de muestras y ensamblaje del dispositivo
<ol><li>Use una pipeta para mezclar bien la solución de proteína y el tampón de cristalización en la primera oblea de cuarzo. La relación de volumen entre la muestra de proteína y el tampón típicamente varía de 2:1 a 1:2 (Figura 1F). Asegúrese de que el volumen total de la solución de cristalización no exceda la capacidad máxima de la cámara de cristalización determinada por el tamaño y el grosor de la cuña. Evite las burbujas de aire durante la mezcla. NOTA: La composición de un tampón de cristalización varía de un experimento a otro. Consulte la Tabla 1 para conocer las condiciones de cristalización.</li>
	<li>Coloque la segunda oblea de cuarzo sobre la solución mezclada a medida que la solución comienza a extenderse (Figura 1G). Esta segunda oblea de cuarzo sirve como ventana de salida de los rayos X difractados.</li>
	<li>Golpee ligeramente la segunda oblea de cuarzo en el borde para ayudar a esparcir el aceite mientras expulsa el aire. Asegure el dispositivo atornillando un anillo de retención en el anillo exterior (Figura 1H). Utilice una herramienta de apriete si es necesario (Figura 1I). Tenga en cuenta que el apriete excesivo puede hacer que las delicadas obleas de cuarzo se deformen o incluso se agrieten.</li>
</ol>3. Optimización del almacenamiento y cristalización del dispositivo
<ol><li>Guarde los dispositivos ensamblados (Figura 1J) en una caja a temperatura ambiente o dentro de una incubadora con control de temperatura. NOTA: Los cristales de proteína pueden aparecer en unas pocas horas o días después de ensamblar un dispositivo de cristalización. Los resultados típicos de la cristalización en chip se muestran para varias muestras de proteínas representativas (Figura 2).</li>
	<li>Monitoree el crecimiento de cristales observando el dispositivo de cristalización bajo un microscopio. Si es necesario, optimice las condiciones de cristalización mediante iteraciones de las secciones 1-3.</li>
</ol>4. Calibración
NOTA: Los programas y comandos mencionados en las secciones siguientes se ejecutan en el software inSituX.
<ol><li>Instale un cristal delgado de granate de aluminio de itrio dopado en el soporte del chip (Figura 3). Instale el tope de haz. Tome imágenes de fluorescencia de rayos X del haz directo ejecutando el programa: burnmark.py <dispositivo>.param donde <dispositivo> es un nombre seleccionado por el usuario para el dispositivo de cristalización. <device>.param es un nombre de archivo que contiene parámetros de control específicos del dispositivo. Los valores predeterminados se reemplazarán gradualmente por valores específicos a lo largo del protocolo. En el archivo complementario 1 se muestra un archivo <device>.param de ejemplo.</li>
	<li>Encuentre la posición precisa del haz de rayos X directo ejecutando el programa de ajuste del perfil del haz: beam.py <grabar imagen> -d <dispositivo> donde <grabar imagen> es el nombre de archivo de la imagen de fluorescencia de rayos X (Figura 4). NOTA: Este programa calcula las posiciones precisas del haz directo, así como el tamaño del haz. La posición del haz marca el destino de translocación para todos los cristales del mismo dispositivo. El tamaño del haz también se utiliza para la planificación de objetivos.</li>
</ol>5. Escaneo óptico
<ol><li>Coloque un dispositivo de cristalización en el soporte del chip y asegure el dispositivo con un tornillo de mariposa (Figura 3A).</li>
	<li>Monte el soporte del chip en la etapa de traslación del difractómetro a través de un mecanismo cinemático (Figura 3B).</li>
	<li>Instale una fuente de luz adecuada para tomar micrografías de la ventana óptica del dispositivo. Se puede usar luz blanca, luz IR u otra luz de elección dependiendo de la sensibilidad a la luz de la muestra de proteína, así como del propósito del experimento.</li>
	<li>Ejecute el programa de análisis: scan.py <dispositivo>.param Este programa captura un conjunto de micrografías que se transfieren automáticamente a las computadoras de usuario especificadas.</li>
	<li>Ejecute el programa de mosaico en un equipo de usuario: tile.py <dispositivo> -x <x> -y <y> donde <x> y <y> son los valores iniciales para los desplazamientos de columna y fila de micrografías, respectivamente. Este programa une todas las micrografías en un montaje de 1-3 μm/píxel de resolución (Figura 5). NOTA: Los pasos 5.4 y 5.5 suelen tardar unos minutos. El número total de micrografías varía de varias decenas a cientos dependiendo del área de escaneo y la ampliación.</li>
	<li>Ejecute el programa de búsqueda de cristales: findX.py <montaje> -c <largo> <ancho> -w <cuña> -x <tamaño de haz> donde <montaje> es la imagen en mosaico. Este programa realiza reconocimiento de cristales y planificación de disparos. <longitud> y <anchura> indican el tamaño del cristal que se encontrará. Si el usuario desea evitar cristales más pequeños, <ancho> se puede utilizar como límite estableciendo un número mayor que los tamaños de cristales pequeños no deseados. <cuña> es un valor angular que establece la tolerancia para cristales de forma irregular. < tamaño del haz> se refiere al tamaño del haz directo obtenido del accesorio del perfil anterior (paso 4.2; Figura 4). Además, los usuarios pueden establecer un valor nominal para espaciar aún más los disparos dirigidos. Estos parámetros clave permiten la selección específica de cristales y la planificación de objetivos (Figura 6).</li>
</ol>6. Difracción de rayos X
<ol><li>Retire la fuente de luz e instale el tope del haz. Establezca una distancia de detector adecuada. Siga el protocolo de seguridad de la línea de luz para buscar en la cabina de rayos X. Abra el obturador de rayos X y el obturador láser si corresponde.</li>
	<li>Ejecute el programa de recopilación de datos para la difracción en serie: collect.py <device>.param -l <duración de la luz> Este comando desencadena la recopilación de datos en la que todas las tomas planificadas se visitan una tras otra de acuerdo con una secuencia preprogramada. Cada cristal objetivo se transloca a la posición del haz (paso 4.2). En cada parada, la exposición a rayos X se toma con o sin iluminación láser en un retraso de tiempo programado. La película 1 muestra una secuencia automatizada de recopilación de datos operada a una frecuencia de 1 Hz. Rutinariamente se recogen de decenas a cientos de imágenes de difracción de un solo dispositivo de cristalización (Película 2). NOTA: La calibración de la sección 4 y el escaneo óptico de la sección 5 son autónomos en la plataforma inSituX, por lo tanto, completamente transferibles a otra línea de luz. Sección 6 La difracción de rayos X tiene que involucrar algún detalle en la operación de la línea de luz.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
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<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
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<li>Bandara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+far-red-sensing+cyanobacteriochrome+reveals+an+atypical+bilin+conformation+and+spectral+tuning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118(2021).</li>
<li>Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+molecular+logic+OR+in+a+dual-sensor+histidine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).</li>
<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
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<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+base+selectivity+from+the+1.8+%C3%85+resolution+structure+of+an+RB69+DNA+polymerase+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex.</a> Biochemistry. 50, 581-590 (2011).</li>
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<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR es el inventor de los chips de cristal sobre cristal en la patente estadounidense 9632042 otorgada a Renz Research, Inc.

La cristalografía de proteínas en los primeros años realizada a temperatura ambiente experimentó una tremenda dificultad para combatir el daño por radiación de rayos X. Por lo tanto, ha sido reemplazado por el método de criocristalografía más robusto a medida que las fuentes de rayos X sincrotrón se volvieron fácilmente disponibles20. Con el advenimiento de los láseres de electrones libres de rayos X, la cristalografía de proteínas a temperatura ambiente se ha revivido en los últimos años, con muc...

Debido a los efectos ionizantes de la radiación de rayos X, la cristalografía de proteínas, en gran medida, se ha limitado a condiciones criogénicas en las últimas tres décadas. Por lo tanto, el conocimiento actual de los movimientos de las proteínas durante su función surge en gran medida de las comparaciones entre estructuras estáticas observadas en diferentes estados bajo condiciones criogénicas. Sin embargo, las temperaturas criogénicas inevitablemente dificultan la progresión de una reacción bioquímica o interconversión entre diferentes estados conformacionales mientras las moléculas de proteínas están trabajando. Para observar directamente la dinámica estructural de las proteínas a resolución atómica por cristalografía, se necesitan métodos robustos y rutinarios para realizar experimentos de difracción a temperatura ambiente, lo que requiere innovaciones técnicas en la entrega de muestras, la recopilación de datos y el posterior análisis de datos. Con este fin, los avances recientes en cristalografía en serie han ofrecido nuevas vías para capturar imágenes moleculares de especies estructurales intermedias y de vida corta a temperatura ambiente 1,2,3. En contraste con la estrategia de "un cristal, un conjunto de datos" ampliamente utilizada en la criocristalografía convencional, la cristalografía en serie adopta una estrategia de recopilación de datos similar a la de la microscopía crioelectrónica de una sola partícula. Específicamente, los datos experimentales en cristalografía en serie se recopilan en pequeñas fracciones de un gran número de muestras individuales, seguidas de un procesamiento intensivo de datos en el que las fracciones de datos se evalúan y combinan en un conjunto de datos completo para la determinación de la estructura 3D4. Esta estrategia de "un cristal, un disparo" alivia efectivamente el daño de la radiación de rayos X a los cristales de proteínas a temperatura ambiente a través de una estrategia de difracción antes de la destrucción5.
Dado que la cristalografía en serie requiere una gran cantidad de cristales de proteínas para completar un conjunto de datos, plantea grandes desafíos técnicos para muchos sistemas biológicos donde las muestras de proteínas son limitadas y / o se trata de un delicado manejo de cristales. Otra consideración importante es cómo preservar mejor la integridad cristalina en experimentos de difracción en serie. Los métodos de difracción in situ abordan estas preocupaciones al permitir que los cristales de proteínas se difracten directamente desde donde crecen sin romper el sello de la cámara de cristalización 6,7,8,9. Estos métodos sin manipulación son naturalmente compatibles con la difracción en serie a gran escala. Recientemente hemos informado sobre el diseño e implementación de un dispositivo de cristalización para difracción in situ basado en un concepto de cristal sobre cristal: cristales de proteínas cultivados directamente en cuarzo monocristalino11. Este dispositivo "cristal sobre cristal" ofrece varias ventajas. En primer lugar, cuenta con una ventana transparente de rayos X y luz hecha de un sustrato de cuarzo monocristalino, que produce poca dispersión de fondo, lo que resulta en excelentes relaciones señal-ruido en imágenes de difracción de cristales de proteínas. En segundo lugar, el cuarzo monocristalino es una excelente barrera de vapor equivalente al vidrio, proporcionando así un entorno estable para la cristalización de proteínas. Por el contrario, otros dispositivos de cristalización que utilizan sustratos a base de polímeros son propensos a secarse debido a la permeabilidad al vapor a menos que el material polimérico tenga un espesor sustancial, lo que contribuye a una alta dispersión de fondo10. En tercer lugar, este dispositivo permite la entrega de un gran número de cristales de proteínas al haz de rayos X sin ninguna forma de manipulación o recolección de cristales, lo cual es crítico para preservar la integridad del cristal11.
Para agilizar los experimentos de difracción de rayos X en serie utilizando los dispositivos de cristal sobre cristal, hemos desarrollado un prototipo de difractómetro para facilitar el cambio entre los modos de escaneo óptico y difracción de rayos X12. Este difractómetro tiene una huella pequeña y se ha utilizado para la recopilación de datos en serie en dos líneas de luz de la Fuente Avanzada de Fotones (APS) en el Laboratorio Nacional de Argonne. Específicamente, utilizamos BioCARS 14-ID-B para la difracción Laue y LS-CAT 21-ID-D para la oscilación monocromática. Este hardware de difractómetro no es necesario si una línea de haz láser de electrones libres de sincrotrón o rayos X está equipada con dos capacidades clave: (1) posicionamiento motorizado de la muestra con un rango de desplazamiento de ±12 mm alrededor del haz de rayos X en todas las direcciones; y (2) una cámara digital en el eje para la visualización de cristales bajo iluminación ligera que es segura para los cristales de proteínas en estudio. El dispositivo de cuarzo monocristalino junto con un difractómetro portátil y el software de control para escaneo óptico, reconocimiento de cristales y recopilación automatizada de datos in situ constituyen colectivamente la plataforma inSituX para cristalografía en serie. Aunque este desarrollo está motivado principalmente por sus aplicaciones de cristalografía dinámica utilizando una fuente de rayos X policromática, hemos demostrado el potencial de esta tecnología para soportar métodos de oscilación monocromática10,12. Con la automatización, esta plataforma ofrece un método de recopilación de datos en serie de alto rendimiento a temperatura ambiente con un consumo de proteínas asequible.
En esta contribución, describimos en detalle cómo configurar la cristalización en chip en un laboratorio húmedo y cómo realizar la recopilación de datos de rayos X en serie en una línea de luz sincrotrón utilizando la plataforma inSituX.
El método por lotes se utiliza para establecer la cristalización en chip bajo una condición similar a la del método de difusión de vapor obtenido para la misma muestra de proteína (Tabla 1). Como punto de partida, recomendamos usar precipitante a una concentración de 1.2-1.5x para el método de difusión de vapor. Si es necesario, la condición de cristalización por lotes se puede optimizar aún más mediante el cribado de rejilla fina. Las obleas de cuarzo no son necesarias para los ensayos de optimización; En su lugar, se pueden usar cubreobjetos de vidrio (ver más abajo). Se recomiendan dispositivos de cristalización parcialmente cargados para mantener los ensayos de optimización en una escala más pequeña. Varias muestras de proteínas se han cristalizado con éxito en tales dispositivos utilizando el método de lote10 (Tabla 1).
El dispositivo en sí consta de las siguientes partes: 1) un anillo exterior; 2) dos obleas de cuarzo; 3) una cuña similar a una arandela de plástico o acero inoxidable; 4) un anillo de retención; 5) aceite de inmersión del microscopio como sellador (Figura 1). El volumen total de la solución de cristalización cargada en un chip depende del propósito del experimento. La capacidad de la cámara de cristalización se puede ajustar eligiendo una cuña de diferentes espesores y/o diámetro interior. Configuramos rutinariamente dispositivos de cristalización de 10-20 μL de capacidad utilizando cuñas de 50-100 μm de espesor. Un dispositivo típico puede producir de decenas a miles de cristales de proteína adecuados para la recopilación de datos en serie (Figura 2).
Cuando tenga éxito, la cristalización en chip producirá decenas a cientos o incluso miles de cristales de proteínas en cada dispositivo de cuarzo listos para la difracción de rayos X. En una línea de luz de sincrotrón, dicho dispositivo se monta en una etapa de traslación de tres ejes del difractómetro utilizando un mecanismo cinemático. La ventana de cristalización de un dispositivo montado se escanea ópticamente y se visualiza en decenas o cientos de micrografías. Estas micrografías se unen en un montaje de alta resolución. Para cristales fotosensibles, el escaneo óptico se puede llevar a cabo bajo luz infrarroja (IR) para evitar la fotoactivación involuntaria. Se ha desarrollado un software de visión artificial para identificar y localizar cristales de proteínas distribuidos aleatoriamente en el dispositivo. Estos cristales se clasifican de acuerdo con su tamaño, forma y posición para informar o guiar la estrategia de recopilación de datos en cristalografía en serie. Por ejemplo, se pueden ubicar disparos únicos o múltiples en cada cristal objetivo. Los usuarios pueden planificar una sola pasada o múltiples rutas a través de cristales específicos. Hemos implementado software para calcular varias rutas de viaje. Por ejemplo, la ruta más corta se calcula utilizando algoritmos que abordan el problema del vendedor ambulante13. Para aplicaciones cristalográficas dinámicas bomba-sonda, se puede elegir el tiempo y la duración de las tomas de láser (bomba) y rayos X (sonda). Se programa una recopilación automatizada de datos en serie para translocar cada cristal objetivo en el haz de rayos X uno tras otro.
Los componentes clave del difractómetro insituX incluyen: 1) un soporte para dispositivo; 2) una etapa de traducción de tres ejes; 3) una fuente de luz para el escaneo óptico; 4) una parada del haz de rayos X; 5) bombear láseres si se estudian proteínas sensibles a la luz; 6) Microcomputadora Raspberry Pi equipada con una cámara sensible a IR; 7) Software de control para sincronizar motores, cámara, fuentes de luz, láser de bomba e interactuar con los controles de línea de luz.

<table><tbody><tr><td>Software de análisis</td> Desarrollo <td>interno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granate de aluminio y itrio dopado con cerio</td><td>Suministros MSE Ce</td><td></td><td>: Y3Al5O12, sustratos monocristalinos YAG</td></tr><tr><td>Soporte de chip</td><td>Software de control desarrollado</td><td></td><td></td>internamente</tr> Aceite de inmersión <tr><td></td><td>desarrollado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Laboratorios Cargille</td><td>16482</td><td>Tipo A bajo viscosidad 150 cSt</td></tr><tr><td>Plataforma inSituX</td><td>Fuente de</td> luz IR desarrollada <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED con lente de vidrio, 1085 nm, 5 mW, Microscopio TO-18</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Anillo exterior</td><td>Placa de</td> Petri desarrollada <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Láseres de bomba</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, código Pin E, diodo láser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anillo de retención</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 anillo de retención para &Oslash; Tubos y monturas de lentes de 1"</td></tr><tr><td>Cristal de cuarzo sin semillas</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diámetro Corte en Z 0,05 mm de espesor pulido de doble cara 8 mm en -X</td></tr><tr><td>Calce</td><td>Desarrollado</td><td></td><td></td>internamente</tr> Tope <tr><td>de haz de rayos X</td><td>Desarrollado</td><td></td><td></td> internamente</tr></tbody></table>

cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Las reacciones bioquímicas y los procesos biológicos se pueden entender mejor demostrando cómo las proteínas hacen la transición entre sus estados funcionales. Dado que las temperaturas criogénicas no son fisiológicas y pueden prevenir, disuadir o incluso alterar la dinámica estructural de las proteínas, es muy deseable un método robusto para experimentos rutinarios de difracción de rayos X a temperatura ambiente. El dispositivo de cristal sobre cristal y el hardware y software que lo acompañan utilizados en este protocolo están diseñados para permitir la difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente para cristales de proteínas de diferentes tamaños sin ninguna manipulación de la muestra. Aquí presentamos los protocolos para los pasos clave desde el ensamblaje del dispositivo, la cristalización en chip, el escaneo óptico, el reconocimiento de cristales hasta la planificación de tomas de rayos X y la recopilación automatizada de datos. Dado que esta plataforma no requiere recolección de cristales ni ninguna otra manipulación de muestras, cientos o miles de cristales de proteínas cultivados en chip se pueden introducir en un haz de rayos X de una manera programable y de alto rendimiento.

En los últimos años se han publicado varios conjuntos de datos representativos 10,12 junto con los resultados cristalográficos y los hallazgos científicos de una amplia gama de muestras de proteínas, incluidas proteínas fotorreceptoras y enzimas, por ejemplo, una planta UV-B fotorreceptora UVR8, una fotoliasa de reparación del ADN impulsada por la luz PhrB10, una nueva proteína sensible a la luz roja lejana de una histidina quinasa sensorial multidominio <sup cla...

Esta contribución describe cómo configurar la cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal y cómo realizar la recopilación automatizada de datos en serie a temperatura ambiente utilizando la plataforma de cristalización en chip.

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Este protocolo demuestra la cristalización de proteínas en un dispositivo similar a un chip en la recolección de datos de difracción de rayos X. Este dispositivo se llama cristal sobre cristal porque los cristales de proteína crecen en un solo cristal de cuarzo. Tras el crecimiento exitoso de cristales de proteínas en tales dispositivos, se recogen miles de imágenes de difracción de cada dispositivo a temperatura ambiente sin siquiera tocar los cristales de proteína.La difracción de rayos X a temperatura ambiente es muy esencial para estudiar la función de las proteínas que involucran muchos estados conformacionales. Estos cambios informativos de proteínas o acciones de proteínas pueden congelarse, por lo que no son detectables en criocristalografía. Estos dispositivos se pueden utilizar para estudiar los procesos de señalización inducidos por la luz y los cambios redox.Solo un puñado de dispositivos proporciona conjuntos de datos completos y redundantes. Para comenzar el preensamblaje del dispositivo, etiquete el anillo exterior para la identificación de la muestra. Incluya el nombre del proyecto, el número de dispositivo, la condición de cristalización y la fecha que desee.Luego

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

Este trabajo detalla el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ. El proceso de microfabricación permite integrar una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable con cualquier corte de peso molecular, entre dos capas del chip.

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

Se describe un versátil dispositivo microfluídico que permite la cristalización de una enzima utilizando el método de contradifusión, la introducción de un sustrato en los cristales por remojo y la determinación de la estructura 3D de la enzima: complejo de sustratos mediante un análisis en serie de cristales dentro del chip a temperatura ambiente.

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Presentamos un protocolo para la cristalización de proteínas utilizando la instalación de cristalización en el Complejo de Investigación en Harwell y la posterior recopilación de datos cristalográficos de rayos X in situ de cristales dentro de las placas en la línea de luz de Cristalografía Macromolecular Versátil in situ (VMXi) de Diamond. Describimos los requisitos de la muestra, los protocolos de cristalización y las pautas de recopilación de datos.

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante

Describimos procedimientos para la preparación y administración de microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía en serie en láseres de electrones libres de rayos X y fuentes de sincrotrón. Estos protocolos también se pueden aplicar para la incorporación y administración de microcristales de proteínas solubles, lo que reduce sustancialmente el consumo de muestras en comparación con la inyección líquida.

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Sistemas automatizados y protocolos para la preparación rutinaria de un gran número de pantallas y nanoliter gotitas de cristalización para los experimentos de difusión de vapor se describen y discuten.

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

Aprende cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal para difracción de rayos X a temperatura ambiente. Este método permite recolectar miles de imágenes sin manipular los cristales, facilitando el estudio de estados conformacionales dinámicos.

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

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