Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

El uso de la microinyección para entregar construcciones de ADN en Strongyloides nos permite generar knockouts y transgénicos, que se pueden usar para estudiar cómo se desarrollan estos gusanos, navegar por su entorno y parasitar a los huéspedes. Hasta el momento, esta es la única técnica exitosa para generar knockouts y transgénicos en estos parásitos. Un día antes de la microinyección, agregue 180 microlitros de la solución de agarosa en un resbalón de la cubierta con una pipeta Pasteur de vidrio, luego deje caer inmediatamente un segundo deslizamiento de la cubierta en la parte superior para aplanar la agarosa en una almohadilla delgada.

Después de 5 a 10 segundos, retire el deslizamiento de la cubierta superior deslizando los dos separados y determine en qué diapositiva está la almohadilla de agar, y colóquela boca arriba. Luego, seleccione un pequeño trozo de fragmento de vidrio de un deslizamiento de cubierta roto y, con fórceps, presiónelo suavemente en el agar cerca del borde superior de la almohadilla. El día de la microinyección, cubra el soporte Baermann, que es un tamiz hecho de dos anillos de plástico con dos capas de redes de tuiles de nylon aseguradas entre ellas con tres piezas superpuestas de tejido de laboratorio.

Luego agregue la mezcla fecal-carbón al soporte baermann. A continuación, coloque el soporte de Baermann con la mezcla fecal-carbón en el embudo, doble los trozos de tejidos alrededor de la mezcla fecal-carbón y agregue suficiente agua para sumergir la mayor parte del carbón fecal. Luego, cubra el embudo con una tapa de placa de Petri de plástico de 15 centímetros para contener el olor y etiquete el embudo según sea necesario.

Después de una o dos horas, sostenga un tubo de centrífuga de 50 mililitros debajo del tubo de goma en la parte inferior del embudo y abra cuidadosamente las abrazaderas en la parte inferior para dispensar de 30 a 40 mililitros de agua que contienen gusanos en el tubo de 50 mililitros. Entonces. transfiera 15 mililitros del agua de Baermann que contiene los gusanos a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire el tubo, retire hasta 13 mililitros del sobrenadante y deséchelo en un recipiente de desechos líquidos con yodo para matar cualquier gusano.

Después de recolectar todos los gusanos, inspeccione el pellet de gusanos en la parte inferior del tubo. Si no hay gusanos visibles, espere de una a dos horas y luego recoja más gusanos del aparato de Baermann. Transfiera los gusanos en la menor cantidad de agua posible a una placa de medio de crecimiento de nematodos al 2% de seis centímetros con un césped de E. coli HB101 y use esta placa como placa fuente para la microinyección.

Bajo el microscopio de disección, cubra el fragmento de vidrio en el deslizamiento de la cubierta de la almohadilla de microinyección con aceite de halocarbono utilizando una selección de gusano de platino estándar. Luego, coloque el resbalón de la cubierta de la almohadilla de microinyección en el endoscopio de microinyección y ubique el fragmento de vidrio cubierto de aceite. Alinee el fragmento de vidrio de tal manera que un borde sea perpendicular a la dirección de la aguja para que sirva como la superficie utilizada para romper la aguja.

A continuación, con un microscopio de disección, asegúrese de que la aguja no tenga burbujas o residuos en el eje cónico, luego asegure la aguja de 1 a 1,5 centímetros en el soporte presurizado. Coloque la punta de la aguja en el centro del campo de visión del microscopio a simple vista y bajo bajo aumento bajo, coloque la punta de la aguja en el campo de visión perpendicular al lado del fragmento de vidrio. Luego, cambie a un aumento más alto y alinee la punta de la aguja con el borde del vidrio, cerca, pero sin tocarlo.

A continuación, para romper la punta de la aguja y permitir el flujo de líquido, golpee suavemente la aguja en el costado de la pieza de vidrio mientras aplica presión continua del gas. Una vez que el líquido comience a fluir, verifique la forma de la punta y asegúrese de que esté afilado con líquido que fluya fácilmente. Cuando el líquido fluya bien de la aguja, mueva la diapositiva de microinyección al endoscopio de disección y agregue uno o dos microlitros de aceite de halocarbono en la almohadilla de agar para la colocación de los gusanos.

Transfiera de 20 a 30 Strongyloides adultos jóvenes a una placa mediana de crecimiento de nematodos al 2% sin bacterias durante al menos cinco minutos para eliminar el exceso de bacterias de superficie y seleccionar gusanos individuales para la microinyección. Agregue más gusanos a la placa según sea necesario mientras se inyecta. Usando una pequeña cantidad de aceite de halocarbono en una selección de gusanos, seleccione una hembra adulta joven de Strongyloides con uno a cuatro huevos en su gónada de la placa sin bacterias y transfiera el gusano a una pequeña gota de aceite en la almohadilla de agar.

Usando el pico de gusano, coloque suavemente el gusano para que no esté enrollado y la gónada sea visible y de fácil acceso. Luego, coloque el gusano en el campo de visión del microscopio de microinyección, asegurándose de que la gónada esté en el mismo lado que la aguja y colocada de modo que la aguja entre en contacto con la gónada en un ligero ángulo. A continuación, lleve la punta de la aguja al lado del gusano en el mismo plano focal.

Luego, apuntando al brazo de la gónada cerca de la mitad del gusano, inserte suavemente la aguja en la gónada con un microinyector. Aplique inmediatamente presión a la aguja para llenar suavemente todo el brazo de la gónada con la solución de ADN. Después de que se haya inyectado suficiente líquido, retire la aguja y observe que la herida se cierra.

Repita el procedimiento con el otro brazo de la gónada, si es visible. Una vez que se complete la inyección, verifique rápidamente que la aguja no esté obstruida aplicando presión con la punta de la aguja en la almohadilla de agar, luego transfiera el portaobjetos con el gusano inyectado al microscopio de disección. Para recuperar el gusano inyectado, primero coloque unas gotas de solución salina tamponada con gusano en el gusano para sacarlo de la almohadilla de agar.

Luego, recoja una pequeña cantidad de bacterias en una selección de gusanos y toque el gusano con las bacterias adherentes para eliminarlo del líquido. Transfiera suavemente el gusano a la placa de recuperación. Para experimentos de comportamiento, transfiera de 20 a 30 larvas a una placa mediana de crecimiento de nematodos al 2% con un césped grueso de bacterias HB101, y bajo un microscopio de disección de fluorescencia, identifique las larvas que expresan el transgén de interés.

Luego, usando una selección de gusanos, seleccione las larvas transgénicas y colóquelas en un pequeño vaso de reloj con solución salina tamponada por gusanos. Para la microscopía, usando una cuchilla de afeitar, puntúe una rejilla en el fondo de plástico de una placa de quimiotaxis de 10 centímetros para rastrear fácilmente la ubicación de los gusanos en la placa. A continuación, agregue tres microlitros de larvas en solución salina tamponada por gusanos en un cuadrado en la cuadrícula, llenando tantos cuadrados como sea necesario.

Luego agregue gotas de 15 a 20 microlitros de nicotina al 1% en agua a las gotas de gusano. Después de cuatro minutos, cuando los gusanos están paralizados, hágalos una prueba con un microscopio de disección de fluorescencia. Aquí se muestran las larvas transgénicas de Strongyloides stercolaris con un patrón de expresión incompleto y completo de mRFPmars de acto 2.

La expresión irregular en el músculo de la pared del cuerpo es más común cuando el transgén no está integrado en el genoma. En contraste, la expresión consistente en todo el músculo de la pared del cuerpo a menudo indica que el transgén se ha integrado en el genoma. El paso clave es colocar la aguja en el mismo plano de enfoque que la gónada para garantizar que el ADN se inyecte en la gónada y se incorpore a los óvulos en desarrollo.

El desarrollo de esta técnica permitió estudiar la función génica en nematodos parásitos, lo que está proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos del parasitismo y las interacciones huésped-parásito.